Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
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我々は、バック研究所(1S10 OD016281)におけるTripleTOFシステムに対するNIH共有計装交付金からの支援を認める。この研究は、国立アレルギー・感染症研究所(R01 AI108255からB.S.)と国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(R24 DK085610からエリック・ヴェルディン)によってもサポートされました。R01 DK090242 から エリック・ゲッツマンへ)。X.X.は、国立衛生研究所(NIH助成金T32GM8806、ジュディス・カンピシとリサ・エラービーへの助成金)によって支援され、N.B.はグレン医学研究財団の博士研究員によって支援されました。

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. 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W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. 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W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

著者たちは開示するものは何もない。

このプロトコルは、PTM クロストークをより効果的に理解するために、複数の PTM エンリッチメントを同時に行うための新しい手法を記述します。この目的に到達する代替方法は、非常に時間がかかり、高価である傾向があり、11、13を成功させるために大量のタンパク質を必要とします。このプロトコルは、実験の全体的な効率を向上させるために、2つのPTMの抗体結合ビーズに一度にインキュベーションを含むマルチPTM濃縮ワークフローを提示します。この方法はまた、分光ライブラリー生成およびDIA MS取得のためのDDAの使用を含み、フラグメントイオン22、23からの干渉を低減して存在するペプチドを検出および定量する。MSデータベース検索エンジンなどのソフトウェアプログラムは、DDA取得のデータを分析および定量するために使用されますが、定量プロテオミクスソフトウェア24および特定のDIA定量分析ソフトウェア25は、DIA取得によって生成された複雑なスペクトルを解釈するために必要です。
このプロトコルには、注意深く従うべき重要な手順がいくつかあります。プロトコルの主な目的は、複数のPTMを同時に濃縮することであるため、抗体アフィニティエンリッチメントステップ(セクション2)は実験の成功に不可欠です。ビーズに対してワッシュを行う場合、ビーズのどれも誤って吸引されないようにする必要があります。トリプシンで消化する前に尿素濃度を1Mに希釈したことを確認することも必要である(ステップ1.8)。タンパク質可溶化のプロトコルでは8M尿素が早く必要ですが、1Mを超える尿素濃度はトリプシンの酵素活性を阻害します。さらに、プロトコル全体でサンプルのpHを一貫してチェックすることが重要です。これは消化前に特に重要です。サンプルとトリプシン溶液のpHがインキュベーション前に適切に中和されない場合、多くの切断部位が見逃される非効率的な消化をもたらし、ペプチド同定が少なくなる可能性がある。
サンプルを準備する際には、プロトコルに対するいくつかの変更が役立つ場合があります。出発物質の1mgから調達したタンパク質ライセートの場合、各PTMスキャンチューブに設けられた抗体ビーズの4分の1を、費用対効果の高い代替物として使用することができる。より多量の出発物質は、使用される抗体ビーズの量が比例して増加する限り、より良い結果を得ることができます。ワークフローを強化できるもう 1 つの修飾は、トリプシンに加えて別のプロテアーゼでサンプルを消化することです。この修飾は、切断されたペプチドのより多くの変動をもたらし、タンパク質残基のカバレッジを増加させる。必要ではないが、トリプシンは、その高い切断特異性26によるPTM分析に用いられる酵素の1つであることが推奨される。
このプロトコルの制限は、研究されているPTMが14を同時に濃縮するために同様の化学を持つ必要があることです。異なる抗体結合ビーズの手順は、類似の溶媒および溶液を利用して、同様の溶出条件を含む類似の溶媒を利用し、好ましくは同じベンダーからである必要があります。このため、ここで概説する方法は、一例としてアセチル化およびコハシニル化を一貫して使用し、どちらも抗体共役ビーズ(Cellシグナル伝達技術社)を使用する。この方法は理論的には任意の数のPTMに適用できますが、この点でプロトコルの正確な制限を評価するために追加の研究が必要です。さらに、これは抗体ベースの濃縮方法であるため、この方法はPTM部位の相対的な定量しか提供できない。
既存のマルチPTMエンリッチメント方式と比較して、このワークフローは、より実現可能でコスト効率の高い代替手段です。この実験から、この方法の有効性は、個人またはシリアル濃縮などの代替方法と非常によく比較することが観察された。図2Bは、単一PTM濃縮およびシリアルPTM濃縮13と比較して、ワンポット法において、修飾ペプチドピーク領域の中央値CVが実際に減少したことを示す。さらに、アセチル化またはコハクニル化のためのサイトレベルの定量を評価する実験結果を分析した。さらに、スピアマン相関分析(図2C,D)は、ワンポットPTMエンリッチメントがシングルPTMエンリッチメントワークフローと同様に実行されることを実証しました。これはペプチドとフラグメントレベルの相関についても当てはまる。1ポットとシリアルPTM濃縮を比較する際に、3つの相関すべてに対して同じ観測が行われました。
このプロトコルにより、研究者はPTMクロストークに関する魅力的な生物学的洞察を迅速かつ費用対効果の高い方法で行うことができます。ワークフローのDIAコンポーネントは、サイトローカリゼーションに関する情報を提供し、PTMの低サイト占有率などの課題を克服するため、PTMに関する理解を深めることができます。この方法を使用して同時にエンリッチできる PTM の上限を評価するために、フォローアップ実験を行うことができます。このワークフローの将来の改善には、サイトのローカリゼーションとPTMサイト占有の分析をさらに自動化するための、より高度なソフトウェアプラットフォームの開発が含まれる可能性があります。

翻訳後の無数の修飾は、活性1、シグナル伝達2、およびターンオーバー3、4に対する作用を通してタンパク質および経路を動的に調節する。例えば、リン酸基5の添加によりタンパク質キナーゼが活性化または不活性化され、ヒストンアセチル化および他の修飾は、クロマチン構造を変化させ、転写調節機構6,7として機能するメカニズムを提供する。近年、複数のPTMが協調して働くか、タンパク質機能または活性を調節するために競合しているという証拠が高まっています8,9,10,11.そのため、PTM クロストークを理解することは、PTM 研究における新たなニーズです。しかし、PTMサイトを識別し定量するほとんどのプロテオームワークフローは、複数の改変の相互作用ではなく、単一の改変に焦点を当てています。記載されたワークフローは、複数の異なるPTMによって修飾される特異的タンパク質修飾「ホットスポット」およびリジン残基を相関させる。
科学界では、複数のPTMを同時に12個の研究に向けた、実現可能な方法が求められる。PTMの複数のタイプのサイトをグローバルに識別し、定量化するほとんどの方法は、高いコストと組織の量が12、13を必要とするため、困難です。マルチPTM濃縮実験は、サンプル調製、データ収集、およびデータ分析の面で時間がかかるだけでなく、通常、これらの研究は、タンパク質11の大量かつしばしば禁止量を必要とします。ここで説明する複数の PTM の同時エンリッチメントと分析のためのプロトコルは、これらの障壁のいくつかに対処し、さまざまな PTM14間の大規模な PTM プロファイリングとクロストークの評価を可能にします。このワンポットワークフローは、生物医学研究者が複数のPTMをグローバルにプロファイリングし、共変性ペプチドを同定し、PTMクロストークを効率的かつ費用対効果の高い方法で研究するための実用的な方法を概説します14,15.
ここでは、50年以上前に最初に研究されたミトコンドリアタンパク質アシル化を調べることによって紹介されています。具体的には、リジンアセチル化17とコハシニル化18に、タンパク質に対するこれらの修飾の共発生、さらにはペプチドレベルでの共修飾を含む。研究はサーチュイン5(SIRT5)ノックアウトマウスモデルを使用しているので、アセチル化および凝集部位の濃縮に焦点を当てることが選ばれました。この決定は、コハクニル化部位がSIRT5 desuccinylaseの標的であり、KOマウスで有意な上方調節を示すことを期待されているためであり、この場合において最も関連性の高いPTMとなる。両方のPTMは、最近Carricoら19によって要約されているように生物学的に関連しています。一般に、アセチル化は遺伝子発現および代謝に重要な影響を及ぼし、そして、コハクニル化は心臓代謝および機能20を調節することが報告されている。
上記のプロトコルは、タンパク質の投入物質の量が少ない(例えば、1mgのタンパク質ライセート)で行われ、サンプル処理、MS取得、およびデータ分析に費やされる時間を短縮することにより、実験の総持続時間を短縮することができる。ワークフローの回路図は、図 1に示されています。また、さらに低い量の出発物質(タンパク質ライセートの100μgまで、それに応じて使用されるビーズの量を縮小)を使用しており、予想通り、同定されたアシル化ペプチドの全体的な収率を低下させます。しかし、それはまだ非常に貴重な結果と定量化されたペプチドを提供します。
いわゆるトップダウンまたはミドルダウンのワークフローでは、通常、タンパク質分解酵素アプローチを使用しません(したがって、1つのタンパク質内の複数のPTMの接続性を維持します)、このプロトコルは、PTMの同定と定量のための余分な深さと感度を得るためのペプチドベースの親和性エンリッチメントアプローチに焦点を当てています(図1)。さらに、このペプチド中心のワークフローは、1)スペクトルライブラリを生成するためのデータ依存型取得(DDA)の組み合わせ、およびラベルフリーワークフローにおける正確なPTM定量のための2)データ非依存の取得(DIA)を含む最新の質量分析法を利用する。
DIAワークフローは、サンプリングされたm/z範囲21内のすべてのペプチド信号を包括的に断片化することにより、典型的なDDAスキャンスキームのサンプリングストカスティシティを克服する。この特徴は、ペプチド内でどの特定の断片イオンが修飾されているかに関する情報を得やすくなるため、部位局在化の点でも非常に有益である。さらに、DIAワークフローは、同一の前駆体イオンを有するマイナーPTMペプチドアイソフォームの同定および定量化を可能にする。DIA法はまた、常に包括的に測定される特定の対応する断片イオンに基づいて、ペプチド内の特定のPTM部位の局在を決定することができる。しかし、DDAアプローチでは、同じ前駆体イオンに対してMS/MSの複数のサンプリングを除外する「動的除外」機能を利用することが多く、マイナーPTMアイソフォームが欠落しています。
ここで説明する同時エンリッチメント戦略は、複数のPTMのグローバルプロファイリングと定量化、PTMクロストークの検証、翻訳後の変更の動的相互作用の理解の恩恵を受ける研究に最適です。1つの結合されたワークフローにおける複数の濃縮PTMの同定は、タンパク質分解ペプチドを含むPTMのグローバル、シリアルまたは並列の濃縮、またはインタクトタンパク質の分析によって説明されています。アセチル化およびコハクチル化の連続濃縮と直接比較して、ワンポット方法論の効率は非常に類似した14として確立された。これらの代替プロトコルは、出発材料と時間のかなりの量を必要とし、非常に高価なことができます。これに対し、ワンポットプロトコルは、その後の分析と同定を伴う複数のPTMの濃縮のための安価で効率的な方法を提供します。
マウス肝組織はSIRT5ノックアウトマウスから得られ、ここで出発物質として使用される。このプロトコルは、異なる組織または細胞培養実験からのタンパク質のライセートに対しても行うことができる。このプロトコルは、組織または細胞培養ペレットから得られるタンパク質ライセートに適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

タンパク質の複数の翻訳後修飾(PTM)を研究することは、PTMクロストークを理解し、タンパク質機能に関するより全体的な洞察を得るための重要なステップです。マルチPTM濃縮研究の重要性にもかかわらず、PTMの複数のグローバルプロテオーム分析を行うために必要な費用、時間、および大量のタンパク質量のために、一度に複数のPTMを調査する研究はほとんどありません。このプロトコルで詳述されている「ワンポット」アフィニティエンリッチメントは、低量のサンプルを含むリジン残基を含むペプチドの同時同定と定量を可能にすることによって、これらの障壁を克服する入力。このプロトコルには、SIRT5ノックアウトマウスのマウス肝臓からのタンパク質ライセートの調製、トリプシン消化の性能、PTMの濃縮、およびデータ独立型獲得(DIA)ワークフローを用いた質量分析分析のパフォーマンスが含まれる。このワークフローは、同じサンプルから2つのPTMを同時に濃縮できるため、大量のサンプルを必要とせずにPTMクロストークを研究するための実用的なツールを提供し、サンプル調製、データの調製に必要な時間を大幅に短縮します。取得、および分析を行います。ワークフローの DIA コンポーネントは、包括的な PTM 固有の情報を提供します。DIA は、さまざまな PTM ローカライズ アイソフォームを区別するために計算で解読できるフラグメントイオンの包括的なセットを提供するため、PTM サイトのローカリゼーションを研究する際に特に重要です。

図1は、マウス肝臓から組織を採取し、トリプシンでタンパク質ライセートを消化するための1mgのタンパク質を使用し、抗体共役ビーズを有するペプチドをインキュベートし、MS上のサンプルを取得し、最終的に様々な定量プロテオミクスソフトウェアパッケージ(アカデミックおよびコマーシャル)を用いてデータのDIA/SWATH分析を行うなど、ワークフローの一般的な図を示す。
図2Aは、マルチPTM濃縮研究に現在使用されている代替方法と比較して、ワークフローのタイムラインおよび必要なサンプルおよびタンパク質の量を示しています。ワンポット法は、これらの代替方法として半分の時間と半分のサンプル数で行うことができます。2つの単一PTM濃縮法と比較して、ワンポットプロトコルもタンパク質の半分の量を必要とします。
このプロトコルは、実現可能で費用対効果の高い代替手段であることが示されています。図2Bは、修飾ペプチド領域の変動係数(CV)の中央値が、シングルPTMおよびシリアルPTMの濃縮よりもワンポット法で低かったことを示す。図2C,Dは、ワンポットPTMとシングルPTMの濃縮方法を比較しながら、2つの改変に対するサイトレベルの定量の相関の間に顕著な違いは見当たらず、示しています。これは、ペプチドレベルとフラグメントレベルの相関についても当てはまる。1ポットとシリアルPTMのエンリッチメントを比較する際に、3つの相関すべてに対して同じ観測が行われました。Basistyら14による最近のレポートに関連付けられたすべての基礎となるMS生データおよび処理されたExcel結果シートが利用可能であり、MassIVE(MSV00081906)およびプロテオメックスチェンジ(PXD008640)からダウンロードすることができます。
一般に、抗体濃縮戦略は、潜在的なエピトープ咬合または限られた特異性などの特定の制限を示すかもしれないが、この研究で使用される抗体は、独立して生成されたクローンの混合物であり、したがって、より広い範囲を提供する特異 性。
実験結果は、PTMクロストークを検出し、評価する可能性を文書化します。図3は、成功した濃縮からのデータを表示し、PTMクロストークを視覚化する複数の異なるアシル修飾を含むペプチドの例を示しています。図3Aは、一方のリジン残基にアセチル化され、他方にコハシニル化されたペプチドを示し、図3Bは両方のリジンで同じペプチドをコハシニル化した。これは、同じリジン残基が両方のアシル化基で修飾できることを示し、その部位でクロストークが起こる可能性があることを示している。図4は、両方の改変を行うセクション7.1-7.3に記載されているように同定されたリジン残基の数を示し、また可能なPTMクロストークを指し示す。
図5に示すように、DIA PTMデータセットを定量プロテオミクスソフトウェアで処理することで、どのリジン残基が修飾されているかを特定できます。これは、サイトローカリゼーションと呼ばれる概念であり、PTMクロストークの可能性を判断するための分析に不可欠なステップです。図 5は、セクション 8.1~8.3 (具体的にはステップ 8.3.2 および 8.3.3) で説明されているように、視覚化および評価できる各々のイオンの確認と取り合いとともに、2 つのイソフォームの可能性を示しています。この情報に基づいて、元のサンプルに存在するアイソフォームが2つあるのは自信を持って特定できました。確認したアイソフォームKQYGEAFEKacRのMS/MSスペクトルは、アセチル化リジン残基を含むyイオン(y2-y5)が42m/z(アセチル基の増分質量)でシフトし、その修飾されたペプチド中の特異的リジン残基を確認したことを明確に示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> 図 1: PTM のワンポットエンリッチメントの一般的なワークフロー。組織(ここでは肝臓)は、SIRT5 KOおよび野生型(WT)マウスから採取され、タンパク質を分解し、トリプシンを消化してペプチドに分解する。ペプチドは、次に、コクシニル-およびアセチル抗体ビーズの組み合わせによる免疫親和性によって濃縮される。並列MSワークフローは、1)全ライセートタンパク質発現変化(タンパク質正常化用)と2)アシル化部位同定(DDA-MS)および部位局在化のための濃縮アシル含有ペプチドの小さなアリコートの両方を測定し、次いで定量(DIA-MS)を測定する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> 図2:ワンポットワークフローと代替方法の比較(A)ワンポットワークフロー、シリアルPTMエンリッチメント、および2つのシングルPTMエンリッチメントに必要な時間、コスト、および材料の比較。(B) ワンポットワークフロー、単一アセチルリシンPTM濃縮、および単一のスクシニルリジンPTM濃縮とのCVの比較。スピアマン相関分析は、ワンポットワークフローから得られたアシルペプチドピーク領域と、単一PTM濃縮物を比較する:log2ピーク面積の対応するプロット(C)アセチル化部位および(D)コハシニル化部位に対する結果を示す。回帰勾配および相関因子は、個々のパネル14に示されている。2つの独立した生物学的反復が各条件に対して処理された。この図は Basisty ら14から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> 図3:リジン残基のアセチル化とコハシ化修飾との間のクロストーク。ミトコンドリア3-ケトアシル-CoAチオラーゼのトリプチペプチドのMS/MSスペクトルは、同じアミノ酸配列を示すが、異なるPtMを有する2つのリジン残基で修飾されている。この図は Basisty ら14から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> 図4:アセチル化およびコハシニル化リジン残基の重複およびクロストーク-タンパク質複合体における特異的な例。(A)ベン図2,235アセチル化と2,173コクチル化部位の間の重複を表示します。このうち、943部位はアセチル化およびコハクニル化の両方であった。SIRT5(脱スクシニルラーゼ)ノックアウトマウスから肝臓を分析し、多くの凝視部位を同定した。実際、マウス肝臓で通常観察されるよりも豊富であった(修飾ペプチドは、Q値<0.05で濾過した)。(B) アセチル化部位とコハクニル化部位の両方を含むサブユニットの割合を示すタンパク質複合体 (太字の赤い線は、フィッシャーの正確な検定によって決定された有意性を表す)。(C) ATP合成酵素複合体の図: 赤のタンパク質サブユニットは、アセチル化およびコハシニル化された部位の両方を含むサブユニットを表している。この図は Basisty ら14から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> 図5:定量的プロテオミクスソフトウェアは、PTMのペプチド部位局在化を解読する。ペプチドのMS/MS断片化に基づいて、アセチル基が修飾している特異的リジン残基に関する情報を提供することができる。これは、PTMのサイトローカリゼーションに関する貴重な情報を提供するソフトウェアの能力を示しています(A)リジン残渣の修正とPTMサイトのローカリゼーションの2つの可能性:KQYGEAFEKacR(左)とKacQYGEAFEKR(右)。ペプチドのアイソフォームのポテンシャル部位の各々について「確認」および「反論」フラグメントイオンが示されている。この情報に基づいて、スコアの確認と反論スコアが割り当てられ、サンプル中にアイソフォームKQYGEAFEKacRが存在することを確認します。(B) 確認されたアイソフォームに相当する MS/MS スペクトル KQYGEAFEKacR は、アセチル化リジン残基(y2以上)を含むすべてのyイオンが+42 m/zの増分質量を運ぶことを示し、これはアセチル修飾に対応する。観察されたbイオンは、修飾を含まない。(C) y2イオンとy3イオンから生じる豊富なピーク領域を有するイオンクロマトグラム(XIC)を抽出し、いずれも確認したアイソフォームKQYGEAFEKacRのアセチル化部位を構成<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">し、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。</a>

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Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

このプロトコルは、複数のPTMを抗体を用いて同時に濃縮し、続いてデータ独立取得質量分析を行い、サイトの局在化およびクロストークに関する生物学的洞察を得るための新しい技術を説明する。これは、少量のサンプル入力のみを含むアセチル化およびスクシニル化PTMを含むスライシングを用いたペプチドの同時同定と定量を可能にする、時間と費用対効果の高い技術です。翻訳後の変更を追跡することは、さまざまな疾患状態を特徴付け、対処する上で重要なステップです。私たちはすでに、特定の癌や糖尿病がこれらのタンパク質改変を通じて高度に規制されていることを認識しています。この方法は、ユビキチン化、リン酸化などの濃縮のための抗体を持つ任意のPTMに理論的に適用することができます。また、他の組織タイプまたは細胞培養モデルにも適用できます。この技術を用いて価値あるデータを得る鍵は再現性です。これは、すべてのステップが非常に慎重に行われることを確認することによって達成することができます特に、抗体ビーズを含むステップ。まず、最大10ミリグラムのタンパク質を組み合わせたC18樹脂を含むカートリッジを入手してください。これらのカートリッジを真空装置に取り付けます。80%のアセトニトリルの800マイクロリットルと0.2%のギ酸を19.8%の水でカートリッジに加え、真空吸引を開始して液体を引き抜きます。カートリッジの乾燥を完全に避けてこのステップを1回繰り返します。真空吸引で水に0.2%のギ酸の800マイクロリットルを加えることによってカートリッジを平衡化します。これを 2 回繰り返します。真空吸引で約1,000マイクロリットル溶液に1ミリグラムのペプチドをカートリッジにロードします。真空吸引下水中の水中で0.2%のギ酸の800マイクロリットルでペプチドを2回洗浄してください。次に、各カートリッジの下に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管を配置してペプチドを収集します。真空吸引の下で、最初に800マイクロリットルの800マイクロリットルのアセトニトリルと0.2%のギ酸を19.8%水でカートリッジから溶出し、同じ溶液の400マイクロリットルで溶出した。脱塩したペプチドサンプルを真空濃縮器で2~3時間完全に乾燥させます。さて、乾燥したペプチドを1.4ミリリットルの冷たい1X免疫親和性精製バッファーに再懸濁させる。約7のpHを混合し、確保する渦。摂氏4度で10分間10,000倍gのサンプルを遠心分離します。小さなペレットが表示されます。抗体ビーズを調製しながら、氷の上にペプチドを脇に置きます。100マイクロリットルのK-アセチル抗体ビーズスラリーと100マイクロリットルのK-スクシニル抗体ビーズスラリーを含むチューブを含むチューブに冷たい1X PBSの1ミリリットルを加え、ピペット処理して混合します。ソリューション全体を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ミニチュア遠心分離機で室温で30秒間回転させます。任意のビーズを吸引しないように注意を払ってPBSを吸引します。さらに3回洗い流します。次に、約440マイクロリットルのPBSでビーズを再懸濁する。よく混ぜるためにビーズを数回ピペット。200マイクロリットルのプレカットチップを使用して、各アセチルリジン抗体ビーズとサクシニル化抗体ビーズの100マイクロリットルを新しいチューブに移します。ミニチュア遠心分離機で30秒間スピンダウンし、ゲルローダーチップでメディアを吸引します。ビーズが白くなるようになりました。再懸濁されたペプチドを洗浄されたビーズに直接ピペットし、一晩でビーズを4°Cで攪拌してインキュベートする。朝、ペプチドサンプルを2,000倍gで30秒間摂氏4度で回転させます。非結合ペプチドを含む上清を除去し、必要に応じて、将来の実験のために保存します。冷たい1X免疫親和性精製バッファーをビーズに1ミリリットル加え、5回反転して洗浄し混合します。摂氏4度で30秒間2,000倍gで回転します。免疫親和性精製液を吸引し、免疫親和性精製洗浄工程をもう一度繰り返す。その後、冷たいHPLC水を1ミリリットルビーズに加え、5回反転して混ぜます。摂氏4度で30秒間2,000倍gで回転します。水を吸い取り、さらに2回水洗いステップを繰り返します。2,000回gで30秒間摂氏4度で回転し、チューブ底に残った水を集めます。平らな先端のゲルの負荷の先端によって、集めた余分な水を吸引する。ビーズを吸引しないように注意してください。55マイクロリットルの0.15%トリフルオロ酢酸をビーズに水に加えます。時折混合するチューブの底をタップしながら、室温で10分間ビーズをインキュベートします。ミニチュア遠心分離機で30秒間、室温でビーズを回転させます。平らな先端のゲルローディングの先端を使用して、溶出したペプチドを新しいチューブに移します。45マイクロリットルの0.15%トリフルオロ酢酸をビーズに水に加えます。チューブの底部をたたたきながら室温で10分間インキュベートして混合する。ミニチュア遠心分離機で30秒間、室温でビーズを回転させます。平らな先端のゲルの負荷の先端を使用して第二の溶出を取り除き、最初の溶出とそれを結合する。結合した溶出ペプチドを12,000倍gで室温で5分間回転させ、持ち越すビーズをペレットします。ペプチドサンプル溶液を新しい500マイクロリットルチューブに移します。濃縮ペプチド混合物をC18プレカラムチップにロードし、1分間に2マイクロリットルの移動相Aで洗浄して再びペプチドを脱塩するローディング方法を構築します。ペプチドが分析カラムに移され、移動相AおよびB.具体的に使用して2〜3時間の勾配で毎分300ナノリットルの流量で溶出するようにクロマトグラフィー法を構築し、5%移動相Bから35%移動相Bまでの線形勾配を80分間にわたって使用する。その後、移動相Bを5分間で80%に引き上げ、8分間80%Bで保持してから5%Bに戻り、25分間の再平衡化を行います。次に、データ依存の取得のための MS 計測器メソッドを構築します。実験1では、M/Z 400から1,500までのMS1前駆体イオンスキャンを設定します。期間を 120 分に設定します。IDA 実験を作成し、「OK」をクリックします。スイッチ基準タブで、毎秒2~5~200カウントの間の帯電状態のイオンのMS/MSスキャンをトリガする強度しきい値を設定します。前駆体イオンの動的除外を60秒に設定します。実験 2 の場合は、MS2 スキャンの範囲を M/Z 100 から 1,500 の範囲で MS/MS 製品のイオン スキャンに設定します。パラメータを編集して衝突エネルギーの拡散を 5 に設定し、高感度製品イオンスキャン モードを選択します。最後に、サンプルをオートサンプラーに入れ、サンプルキューを提出し、データ非依存の取得のためのMS計測方法を構築し、2つの計測器スキャン実験を定義するLC-MS/MS取得方法を開始します。MS1前駆体イオンスキャンを400~1,250質量でスキャンして充電し、持続時間を120分に設定します。衝突エネルギーの拡散を10に設定し、蓄積時間を45ミリ秒に設定し、高感度製品イオンスキャンモードを選択します。次に、64 の可変ウィンドウ DIA SWATH 取得スキームを含むテキスト ファイルをインポートして、SWATH 取得ウィンドウをメソッドに取り込みます。この取得スキームでは、5~90質量から充電、幅の範囲の可変窓が400~1,250質量の全質量範囲にわたって段階的に通過し、合計64のSWATHセグメントを合計で45ミリ秒の累積時間で充電します。MS1 の累積時間を 0.25 秒に調整します。MS1 スキャンと 64 の MS2 スキャンを組み合わせて、合計サイクル時間 3.2 秒を生成する必要があります。本研究では、実験結果はPTMクロストークを検出し評価する可能性を文書化した。この表は、ワークフローのタイムラインと、必要なサンプルとタンパク質の量を示しています。ワンポット法は、これらの代替方法と同じくらいの時間とサンプル数の半分で実行できます。改変ペプチド領域の変動の中央値係数は、単一PTMおよびシリアルPTM濃縮よりもワンポット法において低かった。1ポットPTMとシングルPTMの濃縮方法を比較する一方で、2つの変更に対するサイトレベルの定量の相関には注目すべき違いは見当たらない。この図は、成功した濃縮からのデータを表示し、PTMクロストークを視覚化する複数の異なるアシル修飾を含むペプチドの例を示しています。ペプチドは、一方のリジン残基にアセチル化され、他方で簡潔にされ、ここで同じペプチドが両方のリジンで簡潔に行われた。これは、同じリジン残基が両方のアシル化基で修飾され、その部位でクロストークが起こる可能性があることを示している。各サンプルに同じ量のビーズが含まれていることを確認し、ペプチド結合ビーズを洗浄する際に誤って吸引されないようにすることが不可欠です。Spectronautなどのソフトウェアツールでの質量分析ベースのプロファイリングとデータ分析は、PTMのサイトローカリゼーションを特定、定量化、実行するために、この手順に従って実行されます。このデータに依存しない取得ワークフローと同時 PTM エンリッチメントを組み合わせて、PTM のクロストークをより効率的に評価する手段を開き、PTM シグナリングの関連性に関するより良い洞察を提供します。

Research

JoVE Journal

Biology

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Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

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