Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Vi anerkjenner støtten fra NIH delte instrumenteringsstipend for TripleTOF-systemet ved Buck Institute (1S10 OD016281). Dette arbeidet ble også støttet av National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 til BS) og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 til Eric Verdin; R01 DK090242 til Eric Goetzman). X.X. ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, til Judith Campisi og Lisa Ellerby), N.B. ble støttet av et postdoktorstipend fra Glenn Foundation for Medical Research.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen beskriver en ny teknikk for samtidig flere PTM berikelse for å mer effektivt forstå PTM crosstalk. Alternative metoder for å nå dette målet har en tendens til å være uoverkommelig tidkrevende og dyrt, og de krever store mengder protein for å være vellykket11,13. Denne protokollen presenterer en arbeidsflyt for multi-PTM berikelse som innebærer inkubasjon i antistoffkonjugerte perler for to PTMer samtidig for å forbedre eksperimentets generelle effektivitet. Denne metoden innebærer også bruk av DDA for spektral bibliotekgenerasjon og DIA MS-oppkjøp for å oppdage og kvantifisere peptidene som er tilstede med redusert interferens fra fragmenter22,23. Programmer, for eksempel MS database søkemotorer brukes til å analysere og kvantifisere data fra DDA oppkjøp, mens Kvantitativ Proteomics Software24 og spesifikke DIA Quantitative Analysis Software25 er nødvendig for å tolke den komplekse spectra produsert av DIA oppkjøp.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som bør følges nøye. Siden hovedmålet med protokollen er å berike for flere PTMer samtidig, er antibody-affinity berikelsestrinnet (avsnitt 2) avgjørende for eksperimentets suksess. Når du utfører vasker på perlene, er det nødvendig å sikre at ingen av perlene blir aspirert ved et uhell. Å sikre at ureakonsentrasjonen er fortynnet til 1 M før fordøyelsen med trypsin (trinn 1,8) er også nødvendig. Selv om 8 M urea er nødvendig tidligere i protokollen for proteinløselighet, vil ureakonsentrasjoner over 1 M hemme trypsins enzymatiske aktivitet. I tillegg er det viktig å konsekvent sjekke pH av prøven gjennom protokollen. Dette er spesielt viktig før fordøyelsen. Hvis pH av prøven og trypsinløsningen ikke nøytraliseres riktig før inkubasjonen, kan det resultere i en ineffektiv fordøyelse hvor mange spaltingssteder kan gå glipp av, noe som resulterer i færre peptididentifikasjoner.
Noen endringer i protokollen kan være nyttig når du forbereder prøver. For et proteinlysat anskaffet fra 1 mg startmateriale, kan en fjerdedel av antistoffperlene som leveres i hvert PTM-skannerør brukes som et kostnadseffektivt alternativ. En større mengde startmateriale kan brukes til bedre resultater, så lenge mengden antistoffperler som brukes, økes proporsjonalt. En annen endring som kan forbedre arbeidsflyten er å fordøye eksempler med en annen protease i tillegg til trypsin. Denne endringen ville resultere i mer variasjon i peptider spaltet, noe som gir økt dekning av proteinrester. Selv om det ikke er nødvendig, anbefales det at trypsin være et av enzymene som brukes til PTM-analyse på grunn av sin høye spaltingsspesifitet26.
En begrensning av denne protokollen er at PTM blir studert må ha lignende kjemi for å bli beriket samtidig14. Prosedyrene for de forskjellige antistoffkonjugerte perlene må være like, ved hjelp av lignende løsemidler og løsninger, inkludert lignende elutionforhold, og helst fra samme leverandør. Av denne grunn bruker metoden som er skissert her konsekvent acetylering og kortfattet som et eksempel, som begge bruker antistoffkonjugerte perler (Cell Signaling Technology, Inc). Selv om denne metoden teoretisk kan brukes på en rekke PTMs, vil ytterligere studier være nødvendig for å vurdere den nøyaktige begrensningen av protokollen i denne forbindelse. Videre, da dette er en antistoffbasert berikelsesmetode, kan metoden bare gi en relativ kvantifisering av PTM-områder.
Sammenlignet med eksisterende multi-PTM berikelsesmetoder, er denne arbeidsflyten et mer gjennomførbart og kostnadseffektivt alternativ. Fra dette eksperimentet ble det observert at effekten av denne metoden sammenligner ekstremt godt med alternative metoder, for eksempel individuelle eller serieberikelser. Figur 2B viser at median-CV for modifiserte peptid toppområder faktisk ble redusert i en-pot metoden i forhold til single-PTM berikelser og serie-PTM berikelser13. Vi analyserte videre de eksperimentelle resultatene som vurderte talltall på stedsnivå for acetylering eller konsistasjon. I tillegg viste Spearman korrelasjonsanalyse (figur 2C,D) at en-pot PTM-berikelsen utføres på samme måte som arbeidsflytene for enkeltPTM-berikelse. Dette gjaldt også for korrelasjonene på peptid- og fragmentnivå. Den samme observasjonen holdt for alle tre korrelasjoner når du sammenligner en-pot med seriell-PTM berikelse.
Denne protokollen gjør det mulig for forskere å gjøre fascinerende biologisk innsikt i PTM crosstalk på en rask og kostnadseffektiv måte. DIA-komponenten i arbeidsflyten gjør det mulig for forskere å forstå mer om PTMs, da den gir informasjon om lokalisering på stedet og overvinner utfordringer som lavt område belegg av PTMs. Forløperioner har en tendens til å bli utelukket med DDA, noe som er spesielt viktig når du studerer PTMs, da nettstedets belegg ofte er lavt til det punktet hvor disse peptidene ikke blir valgt for MS / MS, men fortsatt inneholder viktig informasjon. Oppfølgingseksperimenter kan utføres for å vurdere den øvre grensen for hvor mange PTMer som kan berikes samtidig ved hjelp av denne metoden. En fremtidig forbedring av denne arbeidsflyten kan omfatte utvikling av mer avanserte programvareplattformer for ytterligere å automatisere analysen av områdelokalisering og PTM-nettstedbelegg.

En myriade av post-translational modifikasjoner dynamisk regulere proteiner og veier gjennom effekter på aktiviteten1, signaliserer2,og omsetning3,4. For eksempel aktiveres proteinkinaser eller deaktiveres ved tilsetning av fosfatgrupper5,og histoneacetylasjon og andre modifikasjoner gir en mekanisme for å endre kromatinstrukturen og tjene som transkripsjonelle regulatoriske mekanismer6,7. I de senere årene har bevis montert at flere PTMs fungerer i konsert eller konkurrere om å regulere proteinfunksjon eller aktivitet8,9,10,11. Derfor er forståelse av PTM crosstalk et voksende behov i PTM forskning. De fleste tilgjengelige proteomiske arbeidsflyter for å identifisere og kvantifisere PTM-områder fokuserer imidlertid på enkeltendringer, i stedet for samspillet mellom flere endringer. Den beskrevne arbeidsflyten korrelerer spesifikk proteinmodifisering "hot-spots" og lysin rester som er endret av flere forskjellige PTMs.
Det er et økende behov i det vitenskapelige samfunnet for mulige metoder for å studere flere PTMer samtidig12. De fleste metoder for å globalt identifisere og kvantifisere nettstedene til flere typer PTMer er utfordrende på grunn av de høye kostnadene og mengden vev som kreves12,13. Ikke bare er multi-PTM berikelse eksperimenter tidkrevende i form av prøveforberedelse, datainnsamling, og dataanalyse, men disse studiene krever vanligvis store og ofte uoverkommelige mengder protein11. Beskrevet her er en protokoll for samtidig berikelse og analyse av flere PTMer, som også adresserer flere av disse barrierene og muliggjør storskala PTM profilering og vurdering av kryssbehandling mellom ulike PTMs14. Denne en-pot arbeidsflyten skisserer en praktisk måte for biomedisinske forskere å globalt profilere flere PTMer, identifisere komodifiserte peptider, og studere PTM crosstalk på en effektiv måte14,15.
Her vises denne metoden ved å undersøke mitokondrieproteinacylasjon, som først ble studert for over 50 år siden16. Det konsentrerer seg spesifikt om lysin acetylation17 og succinylation18, inkludert samtidig forekomst av disse modifikasjoner på proteiner og til og med samtidig modifisering på peptidnivå. Siden studien bruker en sirtuin 5 (SIRT5) knockout musemodell, ble det valgt å fokusere på berikelse av acetylering og kortfattede nettsteder. Denne beslutningen ble gjort fordi kortfattede nettsteder er mål for SIRT5 desuccinylase og forventes dermed å vise betydelig upregulation i KO mus, noe som gjør dem til de mest relevante PTMs i dette tilfellet. Begge PTM er biologisk relevante som nylig oppsummert av Carrico et al.19. Generelt viser acetylering viktige effekter på genuttrykk og metabolisme, og kortfattet er rapportert å regulere hjertemetabolismen og funksjon20.
Den beskrevne protokollen kan utføres med en lav mengde proteininndatamateriale (f.eks. 1 mg proteinlysat) og reduserer den totale varigheten av forsøket ved å redusere tiden som brukes til prøvebehandling, MS-innhenting og dataanalyse. En arbeidsflytskjematisk er angitt i figur 1. Vi har også brukt enda lavere mengder startmateriale (ned til 100 μg proteinlysat, skalering ned mengdene perler som brukes tilsvarende), noe som som forventet reduserer den totale avkastningen av identifiserte asiret peptider; Det gir imidlertid fortsatt svært verdifulle resultater og kvantifiserbare asiret peptider.
Mens såkalte ovenfra og ned-arbeidsflyter vanligvis ikke bruker proteolytiske fordøyelsestilnærminger (og dermed opprettholder tilkoblingen til flere PTMer i ett protein), fokuserer denne protokollen på en peptidbasert affinitetsberikelsestilnærming for å få ekstra dybde og følsomhet for PTM-identifikasjon og kvantifisering(figur 1). I tillegg benytter denne peptid-sentriske arbeidsflyten moderne massespektrometrimetoder, inkludert 1) en kombinasjon av dataavhengig oppkjøp (DDA) for å generere spektrale biblioteker, og 2) datauavhengig oppkjøp (DIA) for nøyaktig PTM-kvantifisering i en etikettfri arbeidsflyt.
DIA arbeidsflyter overvinne prøvetaking stochasticity av typiske DDA scan ordninger ved omfattende fragmentering alle peptid signaler innenfor samplet m / z rekkevidde21. Denne funksjonen er også svært gunstig når det gjelder lokalisering av nettstedet, fordi det er lettere å få informasjon om hvilke spesifikke fragmentioner som endres i peptidet. I tillegg tillater DIA-arbeidsflyter identifikasjon og kvantifisering av mindre PTM-peptidisoformer med identiske forløperioner. DIA-metoder kan også bestemme en bestemt LOKALLOKALISERING av PTM-området i et peptid basert på spesifikke tilsvarende fragmentioner som er grundig målt til enhver tid. DDA tilnærminger bruker imidlertid ofte "dynamisk ekskludering" funksjoner som utelukker flere prøvetaking av MS / MS for samme forløper ion, og dermed mangler mindre PTM isoformer.
Den samtidige berikelsesstrategien som er beskrevet her, er ideelt egnet for studier som vil dra nytte av den globale profileringen og kvantifiseringen av flere PTMer, undersøke PTM-krysssnakk og forstå de dynamiske interaksjonene til post-translasjonelle modifikasjoner. Identifisering av flere berikede PTMer i en kombinert arbeidsflyt er beskrevet av: global, seriell eller parallell berikelse av PTM som inneholder proteolytiske peptider, eller alternativt ved analyse av intakte proteiner. I direkte sammenligning med serieberikelse av acetylering og succinylation, ble effektiviteten av en-pot metodikk etablert som svært lik14. Disse alternative protokollene krever betydelige mengder startmateriale og tid og kan være uoverkommelig dyrt. I motsetning gir en-pot-protokollen en billig og effektiv metode for berikelse av mer enn én PTM med påfølgende analyse og identifikasjon.
Mus levervev er hentet fra SIRT5 knockout mus og brukes her som startmateriale. Denne protokollen kan også utføres for proteinlysates fra forskjellige vev eller cellekultur eksperimenter. Denne protokollen kan brukes på proteinlysates hentet fra vev eller cellekulturpellets.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

Å studere flere post-translational modifikasjoner (PTMs) av proteiner er et avgjørende skritt for å forstå PTM crosstalk og få mer helhetlig innsikt i proteinfunksjon. Til tross for viktigheten av multi-PTM berikelse studier, få studier undersøke mer enn én PTM om gangen, delvis på grunn av utgifter, tid, og store proteinmengder som kreves for å utføre flere globale proteomiske analyse av PTMs. Den "one-pot" affinitet berikelse beskrevet i denne protokollen overvinner disse barrierene ved å tillate samtidig identifisering og kvantifisering av peptider med lysin rester som inneholder acetylering og kortfattet PTMs med lave mengder prøve Input. Protokollen innebærer utarbeidelse av proteinlysate fra muselever av SIRT5 knockout mus, ytelse av trypsin fordøyelse, berikelse for PTMs, og ytelse av masse spektrometrisk analyse ved hjelp av en data-uavhengig oppkjøp (DIA) arbeidsflyt. Fordi denne arbeidsflyten gjør det mulig å berike to PTMer fra samme prøve samtidig, gir den et praktisk verktøy for å studere PTM crosstalk uten å kreve store mengder prøver, og det reduserer i stor grad tiden som kreves for prøveforberedelse, data oppkjøp, og analyse. DIA-komponenten i arbeidsflyten inneholder omfattende PTM-spesifikk informasjon. Dette er spesielt viktig når du studerer PTM-lokalisering, da DIA gir omfattende sett med fragmentioner som kan deputeres for å skille mellom ulike PTM lokalisering isoformer.

Figur 1 viser et generelt diagram av arbeidsflyten, inkludert høsting av vevet fra muselever, ved hjelp av 1 mg protein for å fordøye proteinlysatet med trypsin, inkubere peptider med antistoffkonjugerte perler, anskaffe prøvene på MS, og til slutt utføre DIA / SWATH analyse av dataene ved hjelp av ulike kvantitative proteomiker programvarepakker (akademisk og kommersiell).
Figur 2A viser hvordan tidslinjen for arbeidsflyten og mengden utvalg og protein som kreves, sammenlignet med alternative metoder som brukes til multi-PTM-berikelsesstudier. En-pot-metoden kan utføres i halvparten så mye tid og med halvparten av antall prøver som disse alternative metodene. Sammenlignet med to single-PTM berikelsesmetode, krever en-pot-protokollen også halvparten av mengden protein.
Denne protokollen har vist seg å være et mulig og kostnadseffektivt alternativ. Figur 2B viser at mediankoeffisienten for variasjon (CV) for modifiserte peptidområder var lavere i én-pot-metoden enn i single-PTM- og seriell-PTM-berikelsene. Figur 2C,D viser at mens du sammenligner en-pot PTM og single-PTM berikelse metoder, ingen bemerkelsesverdige forskjeller var tydelig mellom korrelasjonene til nivå kvantifiseringer for de to modifikasjoner. Dette gjaldt også for korrelasjoner på peptidnivå og fragmenteringsnivå. Den samme observasjonen holdt for alle tre korrelasjoner når du sammenligner en-pot og seriell-PTM berikelser. Alle underliggende MS-rådata og behandlede Excel-resultatark knyttet til en nylig rapport fra Basisty et al.14 er tilgjengelige og kan lastes ned fra MassIVE (MSV00081906) og ProteomeXchange (PXD008640).
Generelt, mens antistoffberikelsesstrategier kan vise visse begrensninger, for eksempel potensiell epitopokklusjon eller begrenset spesifisitet, er antistoffene som brukes i denne studien blandinger av uavhengig genererte kloner og dermed gir bredere områder av Særegenheter.
Eksperimentelle resultater dokumenterer muligheten for å oppdage og vurdere PTM crosstalk. Figur 3 viser data fra en vellykket berikelse og illustrerer et eksempel for et peptid som inneholder flere og forskjellige acyl-modifikasjoner som visualiserer PTM-krysssnakk. Figur 3A viser et peptid som er acetylated på en lysin rester og succinylated på den andre, og figur 3B viser samme peptid succinylated på begge lysiner. Dette viser at de samme lysinrester kan endres med begge akyleringsgruppene, og det er mulighet for kryssforsken som skjer på dette stedet. Figur 4 viser antall lysinrester som ble identifisert som beskrevet i avsnitt7.1-7.3 for å bære begge modifikasjoner, og peker også mot mulig PTM crosstalk.
Som figur 5 demonstrerer, kan behandling av DIA PTM-datasett med kvantitativ proteomikkprogramvare gjøre det mulig for oss å finne ut hvilke spesifikke lysinrester som endres. Dette er et konsept kjent som lokalisering av nettstedet, som er et viktig skritt for enhver analyse for bestemmelse av mulig PTM crosstalk. Figur 5 viser to potensielle isoformer sammen med bekreftende og tilbakevise ioner for hver som kan visualiseres og vurderes som beskrevet i avsnitt8.1-8.3 (spesielt trinn 8.3.2 og 8.3.3). Basert på denne informasjonen kunne vi trygt identifisere hvilke av de to isoformene som var tilstede i det opprinnelige utvalget. MS/ MS-spekteret av den bekreftede isoform KQYGEAFEKacR viser tydelig at y ions (y2-y5) som inneholder acetylated lysin rester, som forskjøvet med 42 m / z (increment massen av en acetyl gruppe), bekreftet den spesifikke lysin rester i peptid som ble endret.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> Figur 1: Typisk arbeidsflyt for en-pot berikelse av PTMer. Vev (her, lever) høstes fra SIRT5 KO og villtype (WT) mus, og proteiner er lysed, trypsin-fordøyd til peptider, og desaltet. Peptider berikes deretter av immunaffinitet med kombinasjoner av succinyl- og acetyl-antistoffperler. Parallelle MS-arbeidsflyter måler både 1) små aliquots av hele lysate proteinuttrykksendringer (for proteinnormalisering) og 2) beriket acylholdige peptider for acylation site identifikasjon (DDA-MS) og lokalisering på stedet, etterfulgt av kvantifisering (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> Figur 2: Sammenligning av arbeidsflyt med én pot med alternative metoder. (A) Sammenligning av tid, kostnader og materialer som kreves for en-pot arbeidsflyt, seriell-PTM berikelse, og to single-PTM berikelser. (B)Sammenligning av CV-er mellom en-pot arbeidsflyt, enkelt acetyl-lysin PTM berikelse, og enkelt succinyl-lysin PTM berikelse. Spearman korrelasjonsanalyse som sammenligner acyl peptid toppområder hentet fra en-pot arbeidsflyt, og single-PTM berikelser: tilsvarende tomter av log2 peak area resultater for (C) acetylation nettsteder og (D) succinylation nettsteder. Regresjonsbakker og korrelasjonsfaktorer er angitt i de enkelte panelene14. To uavhengige biologiske replikaer ble behandlet for hver av betingelsene. Dette tallet er endret fra Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> Figur 3: Krysssnakk mellom acetylering og konsistasjonsmodifikasjoner av lysinrester. MS/MS spectra av tryptiske peptider fra mitokondrie 3-ketoacyl-CoA tiolase som viser samme aminosyresekvens, men har blitt modifisert ved to lysinrester med forskjellige PTMs. (A) MS/ MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK og (B) MS / MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccKsuK. Ksu Kc. Kc. Kc. Kc. Dette tallet er endret fra Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> Figur 4: Overlapping og kryssforsken mellom acetylated og succinylated lysine rester-spesifikke eksempler i proteinkomplekser. (A) Venn diagram som viser overlapping mellom 2235 acetylation og 2173 kortfattede nettsteder. Av disse var 943 steder både acetylated og konsisert. Lever en SIRT5 (de-succinylase) knockout mus ble analysert, og mange konsisinyasjon nettsteder ble identifisert. Faktisk var de rikere enn normalt observert i muselever (modifiserte peptider ble filtrert med en Q-verdi på <0,05). (B) Proteinkomplekser som viser prosentandelen av deres underenheter som inneholder både acetylated og konsiserte steder (fet rød linje representerer betydningen som bestemmes av Fishers eksakte test). (C) Diagram over ATP synthase kompleks: protein underenheter i rødt skildrer underenhetene som inneholder både acetylated og konsiserte steder. Dette tallet er endret fra Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> Figur 5: Kvantitativ proteomikkprogramvare dechiffrerer peptidnettstedetlokalisering av PTMs. Basert på MS/ MS fragmentering av peptidet, er det mulig å gi informasjon om de spesifikke lysinrester acetylgruppen endrer. Dette viser programvarens evne til å tilby verdifull informasjon om lokalisering av PTMs. (A) To muligheter for lysinrester modifikasjon og PTM nettstedet lokalisering: KQYGEAFEKacR (venstre) og KacQYGEAFEKR (høyre). "Bekreftelse" og "tilbakevise" fragmentioner vises for hver av de potensielle lokaliseringsisoformene for peptidet. Basert på denne informasjonen tilordnes bekreftende poengsummer og tilbakevisning av poengsummer, noe som bekrefter tilstedeværelsen av isoform KQYGEAFEKacR i eksemplet. (B) MS/MS-spektrum som tilsvarer bekreftet isoform KQYGEAFEKacR som indikerer at alle y ioner inkludert acetylated lysinrester (y2 og høyere) har en økningsmasse på +42 m/z, noe som tilsvarer essetmodifikasjonstylen. Observerte b ioner inneholder ikke modifikasjonen. (C)Ekstrahert ionkromatogram (XIC) med rikelig toppområder som følge av y2 og y3 ions, som begge utgjør acetylation området i bekreftet isoform KQYGEAFEKacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Denne arbeidsflyten beskriver ytelsen til tids- og kostnadseffektiv berikelse av flere proteinpost-translational modifikasjoner (PTMs) samtidig for kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen benytter ptm berikelse på peptidnivå med flere konjugerte antistoffer, etterfulgt av datauavhengig oppkjøpsmassespektrometrianalyse for å få biologisk innsikt i PTM crosstalk.

Samtidig affinitetberikelse av to post-translational modifikasjoner for kvantifisering og lokalisering av nettstedet

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Denne protokollen beskriver den nye teknikken for samtidig berikelse av flere PTMer med antistoffer etterfulgt av datauavhengig oppkjøp massespektrometri analyse for å få biologisk innsikt i lokalisering og kryss-snakk. Dette er en tid og kostnadseffektiv teknikk som muliggjør samtidig identifisering og kvantifisering av peptider med kutting som inneholder acetylering og kortfattet PTMer med bare små mengder prøveinndata. Sporing av endringer etter oversettelsen er et viktig skritt for å karakterisere og bekjempe ulike sykdomsstater.Vi er allerede klar over at visse kreftformer og diabetes er sterkt regulert gjennom disse proteinmodifikasjonene. Denne metoden kan teoretisk gjelde for alle PTMer med antistoffer for berikelse som ubiquitination, fosforylering og andre. Det kan også gjelde for andre vevstyper eller cellekulturmodeller.Nøkkelen til å skaffe verdifulle data ved hjelp av denne teknikken er reproduserbarhet. Dette kan oppnås ved å sikre at alle trinnene utføres svært nøye, spesielt trinnene som involverer antistoffperlene. Til å begynne med, få patroner som inneholder C18 harpiks som kombinerte opptil 10 milligram protein.Sett disse patronene i et vakuumapparat. Tilsett 800 mikroliter med 80 % acetonitril og 0,2 % maursyre i patronene med 19,8 % vann og start vakuumsuging for å trekke væsken gjennom. Gjenta dette trinnet én gang for å unngå å tørke patronene helt.Likevekt patronene ved å tilsette 800 mikroliter med 0,2 % maursyre i vann med vakuumsuging. Gjenta dette to ganger. Legg ett mg peptider i ca. 1 000 mikroliter på patronene med vakuumsuging.Vask peptidene to ganger med 800 mikroliter på 0,2 % maursyre i vann under vakuumsuging. Deretter ordner du 1,5 milliliter mikrocentrifugerør under hver sylinderampulle for å samle opp peptidet. Under vakuumsuging, elute peptider fra patroner først med 800 mikroliter på 80% acetonitril og 0,2% maursyre i 19,8% vann deretter med 400 mikroliter av samme oppløsning.Tørk de avsaltede peptidprøvene helt i en vakuumkonsentrator i to til tre timer. Nå, resuspend tørkede peptider i 1,4 milliliter kald 1X immunoaffinity rensing buffer. Vortex å blande og sikre en pH på ca 7.Sentrifuger prøvene ved 10 000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. En liten pellet vises. Sett peptidene til side på is mens du forbereder antistoffperler.Tilsett en milliliter kald 1X PBS til et rør som inneholder 100 mikroliter k-acetyl antistoff perle slurry og et rør som inneholder 100 mikroliter k-succinyl antistoff perle slurry og bland ved pipettering. Overfør hele løsningen til nye 1,5 ml ml og spinn i en miniatyr sentrifuge i 30 sekunder ved romtemperatur. Aspirer PBS tar vare på å unngå aspirering av perler.Gjenta vasken tre ekstra ganger. Deretter bruker du perlene på ca. 440 mikroliter pbs. Pipette perlene flere ganger for å blande godt.Med 200 mikroliter forhåndssnittspisser overfører du 100 mikroliter av hver acetyllysinantistoffperler og kortsinusantistoffperler til et nytt rør. Spinn ned i 30 sekunder i en miniatyr sentrifuge og aspirer av media med en gel loader tips. Perlene blir nå hvite.Pipette det resuspended peptid direkte på vasket perler og inkubere peptidene med perler på fire grader Celsius over natten med agitasjon. Om morgenen spinner du peptidprøvene ved 2000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Fjern supernatant som inneholder ubundne peptider og lagre for fremtidige eksperimenter hvis ønskelig.Tilsett en milliliter kald 1X immunoaffinitetsrensingsbuffer til perlene for å vaske og blande ved å invertere fem ganger. Spinn på 2, 000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Aspirer av immunoaffinitetsrenseløsningen og gjenta immunoaffinitetsrensingsvask trinn en gang til.Tilsett deretter ett milliliter kaldt HPLC-vann til perlene og bland ved å invertere fem ganger. Spinn på 2, 000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Aspirer av vannet og gjenta vannvasktrinnet to ekstra ganger.Spinn en ekstra tid på 2 000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius for å samle gjenværende vann i bunnen av røret. Med flate spisse gellastetips, aspirer av ekstra vann som har samlet seg. Vær forsiktig så du unngår å aspirere perlene.Tilsett 55 mikroliter med 0,15% trifluorotaktisk syre i vann til perlene. Inkuber perlene i 10 minutter ved romtemperatur mens du av og til trykker på bunnen av røret for å blande. Spinn perlene ved romtemperatur i 30 sekunder i en miniatyr sentrifuge.Bruk en flat tippet gel lasting tips for å overføre eluted peptider til et nytt rør. Tilsett 45 mikroliter med 0,15% trifluorotaktisk syre i vann til perlene. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur mens du trykker på bunnen av røret av og til for å blande.Spinn perlene ved romtemperatur i 30 sekunder i miniatyr sentrifuge. Fjern den andre elution ved hjelp av en flat tippet gel lasting tips og kombinere den med den første elution. Spinn de kombinerte eluted peptidene på 12 000 ganger g i fem minutter ved romtemperatur for å pellet noen perler som bærer over.Overfør peptidprøveløsningen til et nytt 500 mikroliterrør. Bygg lastemetoden for å laste de berikede peptidblandingene på en C18-forkolonnebrikke og desalt peptidene igjen ved å vaske med mobil fase A ved to mikroliter per minutt i 10 minutter. Bygg kromatografimetoden slik at peptider overføres til en analytisk kolonne og elute med en strømningshastighet på 300 nanoliter per minutt med en to til tre timers gradient ved hjelp av mobilfaser A og B.Spesielt, bruk en lineær gradient fra 5% mobil fase B til 35% mobil fase B over 80 minutter.Deretter rampe mobil fase B til 80% over fem minutter deretter holde på 80% B i åtte minutter før du går tilbake til 5% B for en 25-minutters re-likevekt. Deretter bygger du en MS-instrumentmetode for dataavhengig anskaffelse. For eksperiment én setter du opp MS1-forløperionskanning fra M/Z 400 til 1 500.Angi varigheten til 120 minutter. Opprett et IDA-eksperiment, og klikk på OK. Under kategorien Bryterkriterier angir du intensitetsterskelen for å utløse MS/MS-søk etter ioner av ladede tilstander mellom to til fem til 200 tellinger per sekund. Angi dynamisk ekskludering av forløperioner til 60 sekunder.For eksperiment to angir du MS/MS-produktionskanning med et MS2-skanneområde fra M/Z 100 til 1 500. Klikk på rediger parametere og sett kollisjonsenergispredningen til fem, og velg skannemodus for høysensitivitetsproduktion. Til slutt plasserer du prøven i autosampleren.Send inn eksempelkøen og start LC-MS/MS-anskaffelsesmetoder som bygger en MS-instrumentmetode for datauavhengig anskaffelse og definerer to eksperimenter for instrumentskanning. Utfør MS1-forløperionskanninger fra 400 til 1 250 masse for å lade og angi varigheten til 120 minutter. Sett kollisjonsenergien spredt til 10 og akkumuleringstid til 45 millisekunder, og velg deretter skannemodus for høy følsomhetsproduktion.Deretter importerer du en tekstfil som inneholder 64 variabelvinduet DIA SWATH oppkjøp ordningen for å fylle SWATH anskaffe vinduer inn i metoden. I denne oppkjøpsordningen sendes variable vinduer fra fem til 90 masse til lading og bredde i trinnvise trinn over hele masseområdet på 400 til 1 250 masse for å lade med totalt 64 SWATH-segmenter hver med en 45 millisekund akkumuleringstid. Juster MS1-akkumuleringstiden til 0,25 sekunder.Sammen bør MS1-skanningen og 64 MS2-skanninger nå gi en total syklustid på 3,2 sekunder. I denne studien dokumenterte eksperimentelle resultater muligheten for å oppdage og vurdere PTM cross-talk. Denne tabellen viser hvordan tidslinjen for arbeidsflyten og mengdene prøve og protein som kreves.En-pot metoden kan utføres i halvparten så mye tid og med halvparten av antall prøver som disse alternative metodene. Median variasjonskoeffisient for de modifiserte peptidområdene var lavere i én grytemetoden enn i enkelt-PTM- og seriell PTM-berikelse. Mens du sammenligner en-pot PTM og enkelt PTM berikelse metoder, ingen bemerkelsesverdige forskjeller var tydelig mellom korrelasjonene av stedsnivå kvantifisering for de to modifikasjonene.Denne figuren viser data fra en vellykket berikelse og illustrerer et eksempel for et peptid som inneholder flere og forskjellige acyl modifikasjoner visualisere PTM cross-talk. Et peptid ble acetylated på en lysin rester og konsistret på den andre mens her samme peptid ble konsistret på begge lysiner. Dette viser at de samme lysinrester kan endres med både acylation grupper, og det er en mulighet for kryss-snakk skjer på det stedet.Det er viktig å sørge for at hver prøve inneholder samme mengde perler og sørge for at ingen av perlene aspireres ved et uhell når du vasker peptidbindingsperler. Massespektrometribasert profilering og dataanalyse i programvareverktøy som Spectronaut utføres etter denne fremgangsmåten for å identifisere, kvantifisere og utføre lokalisering av PTMer. Denne datauavhengige oppkjøpsarbeidsflyten i kombinasjon med samtidig PTM-berikelse vil åpne veier for å vurdere PTM-krysssnakk på en mer effektiv måte og gi bedre innsikt i relevansen av PTM-signalering.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gjær Protein Extraction og rensing for studier av funksjon, interaksjoner, og posttranslasjonelle modifikasjoner

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifisering av Post-translasjonell Modifikasjoner av Plant Protein komplekser

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantifisering av krystallinsk cellulose akkumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots å overvåke Tissue-spesifikke Cell Wall Modifikasjoner

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifisering av områdespesifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometri ved hjelp av Data-uavhengig oppkjøpet massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...