Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Reconhecemos o apoio da concessão de instrumentação compartilhada do NIH para o sistema TripleTOF no Buck Institute (1S10 OD016281). Este trabalho também contou com o apoio do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (R01 AI108255 a B.S.) e do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (R24 DK085610 a Eric Verdin; R01 DK090242 para Eric Goetzman). X.X. foi apoiado por uma bolsa dos Institutos Nacionais de Saúde (concessão do NIH T32GM8806, para Judith Campisi e Lisa Ellerby), N.B. foi apoiada por uma bolsa de pós-doutorado da Glenn Foundation for Medical Research.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve uma nova técnica para o enriquecimento simultâneo de múltiplos PTM para entender mais efetivamente o crosstalk ptm. Métodos alternativos de atingir esse objetivo tendem a ser proibitivamente demorados e caros, e exigem grandes quantidades de proteína para serem bem sucedidos11,13. Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho de enriquecimento multi-PTM que envolve incubação em contas conjugadas por anticorpos para dois PTMs ao mesmo tempo para melhorar a eficiência geral do experimento. Este método também envolve o uso de DDA para geração de bibliotecas espectrais e aquisições dia MS para detectar e quantificar os peptídeos presentes com interferência reduzida de íons fragmentados22,23. Programas de software, como os mecanismos de pesquisa de banco de dados ms são usados para analisar e quantificar dados de aquisições de DDA, enquanto o Quantitative Proteomics Software24 e o software específico de análise quantitativa DIA25 são necessários para interpretar o espectro complexo produzido pelas aquisições da DIA.
Existem vários passos críticos dentro deste protocolo que devem ser seguidos cuidadosamente. Como o principal objetivo do protocolo é enriquecer para vários PTMs simultaneamente, a etapa de enriquecimento anticorpo-afinidade (seção 2) é fundamental para o sucesso do experimento. Ao realizar lava-jatos nas contas, é necessário garantir que nenhuma das contas seja aspirada acidentalmente. Garantir que a concentração de ureia tenha sido diluída para 1 M antes da digestão com a trippsina (passo 1.8) também é necessária. Embora a ureia de 8 M seja exigida no protocolo de solubilização proteica, as concentrações de ureia acima de 1 M inibirão a atividade enzimática da trippsina. Além disso, é importante verificar consistentemente o pH da amostra em todo o protocolo. Isso é especialmente importante antes da digestão. Se o pH da amostra e a solução de trippsina não forem neutralizados adequadamente antes da incubação, pode resultar em uma digestão ineficiente em que muitos locais de decote podem ser perdidos, resultando em menos identificações de peptídeos.
Algumas modificações no protocolo podem ser úteis ao preparar amostras. Para um lysate de proteína adquirido a partir de 1 mg de material inicial, um quarto das contas de anticorpos fornecidas em cada tubo de varredura PTM pode ser usada como uma alternativa econômica. Uma maior quantidade de material inicial pode ser usada para melhores resultados, desde que a quantidade de contas de anticorpos utilizadas seja aumentada proporcionalmente. Outra modificação que pode melhorar o fluxo de trabalho é digerir amostras com outro protease, além da trippsina. Essa modificação resultaria em mais variabilidade nos peptídeos, proporcionando maior cobertura de resíduos proteicos. Embora não seja necessário, recomenda-se que a metese seja uma das enzimas utilizadas para análise de PTM devido à sua alta especificidade do decote26.
Uma limitação desse protocolo é que os PTMs que estão sendo estudados precisam ter químicas semelhantes para serem enriquecidos simultaneamente14. Os procedimentos para as diferentes contas conjugadas por anticorpos devem ser semelhantes, utilizando solventes e soluções semelhantes, incluindo condições de elusão semelhantes e, preferencialmente, do mesmo fornecedor. Por essa razão, o método aqui descrito usa consistentemente acetilação e sucinta como exemplo, ambos usam contas conjugadas com anticorpos (Cell Signaling Technology, Inc). Embora esse método possa teoricamente ser aplicado a qualquer número de PTMs, seriam necessários estudos adicionais para avaliar a limitação exata do protocolo nesse sentido. Além disso, como se trata de um método de enriquecimento baseado em anticorpos, o método só pode fornecer uma quantificação relativa dos sites de PTM.
Em comparação com os métodos de enriquecimento multi-PTM existentes, esse fluxo de trabalho é uma alternativa mais viável e econômica. A partir deste experimento, observou-se que a eficácia deste método se compara extremamente bem com métodos alternativos, como enriquecimentos individuais ou seriais. A Figura 2B mostra que o CV mediano das áreas de pico de peptídeos modificados foi realmente diminuído no método de um pote em comparação com enriquecimentos de PTM único e enriquecimentos de PTM em série13. Analisamos ainda os resultados experimentais avaliando as quantificações do nível do local para acetilação ou sucinta. Além disso, a análise de correlação de Spearman (Figura 2C,D) demonstrou que o enriquecimento ptm de um pote teve desempenho semelhante aos fluxos de trabalho de enriquecimento de um único PTM. Isso também era verdade para as correlações de peptídeo e fragmentação. A mesma observação foi realizada para as três correlações ao comparar um pote com enriquecimento serial-PTM.
Esse protocolo permite que os pesquisadores façam insights biológicos fascinantes sobre o crosstalk PTM de forma rápida e econômica. O componente DIA do fluxo de trabalho permite que os pesquisadores entendam mais sobre os PTMs, pois fornece informações sobre localização do local e supera desafios como baixa ocupação de PTMs. Os íons precursores tendem a ser excluídos com DDA, o que é particularmente importante ao estudar PTMs, pois a ocupação do local muitas vezes é baixa ao ponto em que esses peptídeos não são selecionados para MS/MS, mas ainda contêm informações cruciais. Experimentos de acompanhamento poderiam ser realizados para avaliar o limite superior de quantos PTMs podem ser enriquecidos simultaneamente usando este método. Uma melhoria futura desse fluxo de trabalho pode incluir o desenvolvimento de plataformas de software mais avançadas para automatizar ainda mais a análise da localização do site e a ocupação do site ptm.

Uma miríade de modificações pós-translacionais regulam dinamicamente proteínas e caminhos através de efeitos na atividade1, sinalização2e rotatividade3,4. Por exemplo, as quinases proteicas são ativadas ou desativadas pela adição dos grupos de fosfato5, e a acetilação de histona e outras modificações fornecem um mecanismo para alterar a estrutura da cromatina e servir como mecanismos regulatórios transcricionales6,7. Nos últimos anos, surgiram evidências de que vários PTMs trabalham em conjunto ou competem para regular a função proteica ou atividade8,9,10,11. Portanto, entender o crosstalk ptm é uma necessidade emergente na pesquisa do PTM. No entanto, a maioria dos fluxos de trabalho proteômicos disponíveis para identificar e quantificar os sites de PTM se concentram em modificações únicas, em vez da interação de múltiplas modificações. O fluxo de trabalho descrito correlaciona "pontos quentes" específicos de modificação proteica e resíduos de lisina que são modificados por vários PTMs diferentes.
Há uma necessidade crescente na comunidade científica de métodos viáveis para estudar múltiplos PTMs simultaneamente12. A maioria dos métodos para identificar e quantificar globalmente os locais de vários tipos de PTMs são desafiadores devido aos altos custos e quantidade de tecido necessários12,13. Não só os experimentos de enriquecimento multi-PTM são demorados em termos de preparação de amostras, aquisição de dados e análise de dados, mas esses estudos normalmente requerem grandes e muitas vezes quantidades proibitivas de proteína11. Descrito aqui está um protocolo para enriquecimento e análise simultâneo de vários PTMs, que também aborda várias dessas barreiras e permite o perfil ptm em larga escala e avaliação de crosstalk entre vários PTMs14. Este fluxo de trabalho de um pote descreve uma maneira prática para pesquisadores biomédicos traçarem perfil global de vários PTMs, identificarem peptídeos co-modificados e estudarem o crosstalk PTM de forma eficiente e econômica14,15.
Aqui, este método é mostrado examinando a acylation de proteína mitocondrial, que foi estudada pela primeira vez há mais de 50 anos,16. Concentra-se especificamente na acetilação de lisina17 e na sucinta18,incluindo a co-ocorrência dessas modificações em proteínas e até mesmo a co-modificação no nível peptídeo. Como o estudo utiliza um modelo de rato-de-nocaute sirtuino 5 (SIRT5), ele foi escolhido para se concentrar no enriquecimento de acetilação e locais de sucinta. Esta decisão foi tomada porque os locais de sucinta são alvos da SIRT5 dessuccinylase e, portanto, espera-se que mostrem uma significativa upregulação em camundongos KO, tornando-os os PTMs mais relevantes neste caso. Ambos os PTMs são biologicamente relevantes como recentemente resumido por Carrico et al.19. Em geral, a acetilação mostra efeitos importantes na expressão genética e no metabolismo, e a sucinta tem sido relatada para regular o metabolismo cardíaco e a função20.
O protocolo descrito pode ser realizado com baixa quantidade de material de insumo proteico (por exemplo, 1 mg de proteína) e reduz a duração total do experimento reduzindo o tempo gasto para processamento de amostras, aquisição de MS e análise de dados. Um esquema de fluxo de trabalho é fornecido na Figura 1. Também usamos quantidades ainda menores de material inicial (até 100 μg de isato de proteína, reduzindo as quantidades de contas utilizadas em conformidade), o que, como esperado, reduz o rendimento global dos peptídeos acylated identificados; no entanto, ele ainda fornece resultados altamente valiosos e peptídeos acírquios quantificáveis.
Embora os chamados fluxos de trabalho de cima para baixo ou médio-down normalmente não utilizem abordagens de digestão proteolítica (e assim mantenham a conectividade de vários PTMs dentro de uma proteína), este protocolo se concentra em uma abordagem de enriquecimento de afinidade baseada em peptídeo para obter profundidade extra e sensibilidade para identificação e quantificação ptm(Figura 1). Além disso, esse fluxo de trabalho centrado no peptídeo utiliza métodos modernos de espectrometria de massa, incluindo 1) uma combinação de aquisição dependente de dados (DDA) para gerar bibliotecas espectrais e 2) aquisição independente de dados (DIA) para quantificação ptm precisa em um fluxo de trabalho sem rótulos.
Os fluxos de trabalho do DIA superam a amostragem de esquemas típicos de varredura dda, fragmentando abrangentemente todos os sinais de peptídeo dentro da faixa m/zamostrada 21. Esse recurso também é extremamente benéfico em termos de localização do site, pois é mais fácil obter informações sobre quais íons específicos de fragmentos são modificados dentro do peptídeo. Além disso, os fluxos de trabalho dia permitem a identificação e quantificação de pequenas isoformas ptm-peptídeos com íons precursores idênticos. Os métodos DIA também podem determinar uma localização específica do site PTM dentro de um peptídeo com base em íons específicos correspondentes que são amplamente medidos em todos os momentos. No entanto, as abordagens dda muitas vezes utilizam características de "exclusão dinâmica" que excluem múltiplas amostragem de MS/MS para o mesmo íon precursor, perdendo assim pequenas isoformas PTM.
A estratégia simultânea de enriquecimento aqui descrita é idealpara estudos que se beneficiarão do perfil global e quantificação de vários PTMs, examinando o crosstalk ptm e entendendo as interações dinâmicas das modificações pós-translacionais. A identificação de múltiplos PTMs enriquecidos em um fluxo de trabalho combinado foi descrita por: enriquecimento global, serial ou paralelo do PTM contendo peptídeos proteolíticos, ou, alternativamente, pela análise de proteínas intactas. Em comparação direta com o enriquecimento serial da acetilação e sucintação, a eficiência da metodologia de um pote foi estabelecida como sendo muito semelhantea 14. Esses protocolos alternativos exigem quantidades significativas de material e tempo iniciais e podem ser proibitivamente caros. Em contrapartida, o protocolo de um pote fornece um método barato e eficiente para enriquecimento de mais de um PTM com análise e identificação subsequentes.
Os tecidos hepáticos do rato são obtidos de ratos sirt5 e são usados aqui como material inicial. Este protocolo também pode ser realizado para lisates proteicos de diferentes tecidos ou experimentos de cultura celular. Este protocolo pode ser aplicado a lisates proteicos obtidos a partir de tecidos ou pelotas de cultura celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

Estudar múltiplas modificações pós-translacionais (PTMs) de proteínas é um passo crucial para entender o crosstalk PTM e obter insights mais holísticos sobre a função proteica. Apesar da importância dos estudos de enriquecimento multi-PTM, poucos estudos investigam mais de um PTM por vez, devido parcialmente às despesas, tempo e grandes quantidades proteicas necessárias para realizar múltiplas análises proteômicas globais de PTMs. O enriquecimento de afinidade "um pote" detalhado neste protocolo supera essas barreiras ao permitir a identificação simultânea e quantificação de peptídeos com resíduos de lisina contendo acetilação e sucintação ptMs com baixas quantidades de amostra Entrada. O protocolo envolve a preparação de proteínas provenientes de fígados de camundongos de camundongos toquesirt5, desempenho da digestão de trippsina, enriquecimento para PTMs e desempenho da análise espectrométrica em massa utilizando um fluxo de trabalho de aquisição independente de dados (DIA). Como esse fluxo de trabalho permite o enriquecimento de dois PTMs da mesma amostra simultaneamente, fornece uma ferramenta prática para estudar o crosstalk PTM sem exigir grandes quantidades de amostras, e reduz consideravelmente o tempo necessário para a preparação da amostra, dados aquisição e análise. O componente DIA do fluxo de trabalho fornece informações específicas do PTM abrangentes. Isso é particularmente importante ao estudar a localização do site ptm, pois o DIA fornece conjuntos abrangentes de íons fragmentais que podem ser computacionalmente decifrados para diferenciar entre diferentes isoformas de localização do PTM.

A Figura 1 mostra um diagrama geral do fluxo de trabalho, incluindo a colheita do tecido dos fígados de camundongos, o uso de 1 mg de proteína para digerir o lysato protetina com trippsina, incubar peptídeos com contas conjugadas por anticorpos, adquirir as amostras no MS e finalmente realizar análise dia/swath dos dados usando vários pacotes de software proteômico quantitativo (acadêmico e comercial).
A Figura 2A mostra como o cronograma do fluxo de trabalho e as quantidades de amostra e proteína necessárias, em comparação com métodos alternativos que estão sendo utilizados atualmente para estudos de enriquecimento multi-PTM. O método de um pote pode ser realizado pela metade do tempo e com metade do número de amostras quanto esses métodos alternativos. Comparado com o método de enriquecimento de dois PTM único, o protocolo de um pote também requer metade da quantidade de proteína.
Este protocolo tem se mostrado uma alternativa viável e econômica. A Figura 2B mostra que o coeficiente mediano de variação (CV) para áreas modificadas de peptídeos foi menor no método de um pote do que nos enriquecimentos uniptm e ptm serial. A Figura 2C,D mostra que, ao comparar os métodos de enriquecimento PTM e single-PTM, não foram evidentes diferenças notáveis entre as correlações das quantificações de nível do local para as duas modificações. Isso também era verdade para as correlações de nível peptídeo e fragmentado. A mesma observação foi realizada para as três correlações ao comparar os enriquecimentos de um pote e PTM em série. Todos os dados brutos subjacentes de MS e folhas de resultados processadas do Excel associadas a um relatório recente da Basisty et al.14 estão disponíveis e podem ser baixados no MassIVE (MSV000081906) e ProteomeXchange (PXD0008640).
Em geral, embora estratégias de enriquecimento de anticorpos possam mostrar certas limitações, como oclusão potencial de epítopo ou especificidade limitada, os anticorpos utilizados neste estudo são misturas de clones gerados independentemente e, portanto, fornecem faixas mais amplas de Especificidades.
Os resultados experimentais documentam a possibilidade de detectar e avaliar o crosstalk ptm. A Figura 3 exibe dados de um enriquecimento bem sucedido e ilustra um exemplo para um peptídeo contendo múltiplas e diferentes modificações acyl visualizando o crosstalk PTM. Figura 3A mostra um peptídeo que é acessado em um resíduo de lisina e sucinta no outro, e a Figura 3B mostra o mesmo peptídeo sucinta em ambas as lisinas. Isso demonstra que o mesmo resíduo de lisina pode ser modificado com ambos os grupos de acylation, e há a possibilidade de crosstalk ocorrer naquele local. A Figura 4 apresenta o número de resíduos de lisina identificados como descritonos nos trechos 7.1-7.3 para levar ambas as modificações, apontando também para possíveis crosstalk ptm.
Como demonstra a Figura 5, o processamento de conjuntos de dados DIA PTM com software quantitativo de proteômica nos permite identificar quais resíduos específicos de lisina são modificados. Trata-se de um conceito conhecido como localização do site, que é um passo essencial para qualquer análise para determinação de possível crosstalk PTM. A Figura 5 exibe duas isoformas potenciais, juntamente com os íons confirmados e refutantes para cada um que pudessem ser visualizados e avaliados conforme descrito nas seções 8.1-8.3 (especificamente passos 8.3.2 e 8.3.3). Com base nessas informações, conseguimos identificar com confiança qual das duas isoformas estava presente na amostra original. O espectro MS/MS do isoform confirmado KQYGEAFEKacR demonstra claramente que os íons y (y2-y5) contendo o resíduo de lisina acesina, que mudou de 42 m/z (a massa incremental de um grupo de acetil), confirmou o resíduo específico de lisina no peptídeo modificado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho típico para enriquecimento de um pote de PTMs. Os tecidos (aqui, fígados) são colhidos de camundongos SIRT5 KO e tipo selvagem (WT), e as proteínas são lised, tessapsin-digeridas em peptídeos e salted. Peptídeos são então enriquecidos pela imunoafinidade com combinações de contas de anticorpo sucinta e acetil. Fluxos de trabalho de MS paralelos medem ambos 1) pequenas alíquotas de mudanças de expressão proteica inteira (para normalização da proteína) e 2) peptídeos enriquecidos contendo acylation para identificação do local de acylation (DDA-MS) e localização do local, seguido pela quantificação (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> Figura 2: Comparação do fluxo de trabalho de um pote com métodos alternativos. (A)Comparação de tempo, custos e materiais necessários para o fluxo de trabalho de um pote, enriquecimento em série-PTM e dois enriquecimentos de PTM. (B)Comparação de CVs entre o fluxo de trabalho de um pote, o enriquecimento PTM de acetil-lysina único e o enriquecimento ptm único sucinta-lsine. Análise de correlação de lança comparando as áreas de pico do peptídeo acyl obtidas a partir do fluxo de trabalho de um pote, e os enriquecimentos de um único PTM: parcelas correspondentes dos resultados da área de pico log2 para locais de acetilação(C)e(D)locais de sucinta. As encostas de regressão e os fatores de correlação são indicados nos painéis individuais14. Duas réplicas biológicas independentes foram processadas para cada uma das condições. Este número foi modificado de Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> Figura 3: Crosstalk entre acetilação e modificações de sucinta de resíduos de lisina. Espectro de espectra speto de ms/MS de peptídeos triptróticos de tisindrial 3-ketoacyl-CoA thiolase que mostram a mesma sequência de aminoácidos, mas foram modificados em dois resíduos de lisina com diferentes PTMs. (A)MS/MS do peptídeo AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK e (B) MS/MS do peptídeo AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccKsuccK. Este número foi modificado de Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> Figura 4: Sobreposição e conversa cruzada entre os resíduos de lisina acessa e sucintas – exemplos específicos em complexos proteicos. (A)diagrama de Venn exibindo sobreposição entre 2.235 acetilação e 2.173 locais de sucinta. Destes, 943 locais foram acesiados e sucintas. Fígado de um rato-nocauteado SIRT5 (dessssério) foi analisado, e muitos locais de sucinta foram identificados. Na verdade, eles eram mais abundantes do que normalmente observados no fígado do rato (peptídeos modificados foram filtrados a um valor Q de <0,05). (B) Complexos proteicos que mostram a porcentagem de suas subunidades contendo locais acesilados e sucintas (linha vermelha ousada representa a importância determinada pelo teste exato de Fisher). (C) Diagrama do complexo de sintetizador ATP: subunidades proteicas em vermelho retratam as subunidades que contêm locais acessais e sucintas. Este número foi modificado de Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> Figura 5: O software quantitativo de proteômica decifra a localização do site peptídeo de PTMs. Com base na fragmentação de MS/MS do peptídeo, é possível fornecer informações sobre o resíduo específico de lisina que o grupo acetil está modificando. Isso mostra a capacidade do software de oferecer informações valiosas sobre a localização do site de PTMs. (A) Duas possibilidades de modificação de resíduo sine e localização do site PTM: KQYGEAFEKacR (esquerda) e KacQYGEAFEKR (à direita). "Confirmar" e "refutar" íons fragmentados são mostrados para cada uma das possíveis isoformas de localização do local do peptídeo. Com base nessas informações, são atribuídos pontuações e pontuações refutantes, confirmando a presença de isoform KQYGEAFEKacR na amostra. (B) Espectro MS/MS correspondente ao isoform confirmado KQYGEAFEKacR indicando que todos os íons y, incluindo o resíduo de lisina acessina (y2 e superior) carregam uma massa incremental de +42 m/z, que corresponde à modificação acetila. Os íons b observados não contêm a modificação. (C) Cromatografia de íon extraído (XIC) com áreas de pico abundantes resultantes de y2 ey 3 íons, ambos compõem o site de acetilação no isoform confirmado KQYGEAFEKacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Este protocolo descreve a nova técnica para enriquecimento simultâneo de múltiplos PTMs com anticorpos seguidos de análise de espectrometria de massa de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre localização do local e cross-talk. Trata-se de uma técnica de tempo e custo-benefício que permite a identificação simultânea e quantificação de peptídeos com corte contendo PTMs de acetilação e succinilation com apenas pequenas quantidades de entrada amostral. O acompanhamento das modificações pós-translacionais é um passo importante na caracterização e combate a diferentes estados da doença.Já sabemos que certos cânceres e diabetes são altamente regulados através dessas modificações proteicas. Este método pode teoricamente aplicar-se a quaisquer PTMs com anticorpos para enriquecimento, como ubiquização, fosforilação e outros. Também pode se aplicar a outros tipos de tecidos ou modelos de cultura celular.A chave para obter dados valiosos usando essa técnica é a reprodutibilidade. Isso pode ser alcançado garantindo que todas as etapas sejam realizadas com muito cuidado, particularmente as etapas que envolvem as contas de anticorpos. Para começar, obtenha cartuchos contendo resina C18 que combinavam até 10 miligramas de proteína.Coloque esses cartuchos em um aparelho de vácuo. Adicione 800 microliters de 80% de acetonitrilo e 0,2% de ácido fórmico aos cartuchos com 19,8% de água e inicie a sucção a vácuo para puxar o líquido. Repita esta etapa uma vez evitando a secagem dos cartuchos completamente.Equilibre os cartuchos adicionando 800 microliters de ácido fórmico de 0,2% na água com sucção a vácuo. Repita isso duas vezes. Carregue um peptídeos miligramas em cerca de 1.000 microliter solução nos cartuchos com sucção a vácuo.Lave os peptídeos duas vezes com 800 microliters de ácido fórmico de 0,2% na água sob sucção a vácuo. Em seguida, organize tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro sob cada cartucho para coletar o peptídeo. Sob sucção a vácuo, peptídeos elutos de cartuchos primeiro com 800 microliters de 80% de acetonitrilo e 0,2% ácido fórmico em 19,8% de água, em seguida, com 400 microliters da mesma solução.Seque as amostras de peptídeos dessaladas completamente em um concentrador de vácuo por duas a três horas. Agora, resuspenque os peptídeos secos em 1,4 mililitros de tampão de purificação de imunoaffinity frio 1X. Vórtice para misturar e garantir um pH de aproximadamente 7.Centrifugar as amostras a 10.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Uma pequena pelota aparece. Coloque os peptídeos de lado no gelo enquanto prepara contas de anticorpos.Adicione um mililitro de PBS frio 1X a um tubo contendo 100 microliters de pasta de anticorpos de tértil K e um tubo contendo 100 microliters de pasta de anticorpo k-succinyl e misture por pipetação. Transfira toda a solução para novos tubos de 1,5 mililitros e gire em uma centrífuga em miniatura por 30 segundos à temperatura ambiente. Aspire o PBS tomando cuidado para evitar aspirar quaisquer contas.Repita a lavagem três vezes adicionais. Em seguida, resuspende as contas em cerca de 440 microliters de PBS. Pipeta as contas várias vezes para misturar bem.Com 200 dicas de pré-corte de microliter, transfira 100 microliters de cada linha de anticorpos acetilosinas e contas de anticorpos de succinil à flor da pele para um novo tubo. Gire por 30 segundos em uma centrífuga em miniatura e aspire fora da mídia com uma ponta de carregador de gel. As contas agora ficam brancas.Pipeta o peptídeo resuspended diretamente sobre as contas lavadas e incubar os peptídeos com contas a quatro graus Celsius durante a noite com agitação. Pela manhã, gire as amostras de peptídeos a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante contendo peptídeos não ligados e guarde para experimentos futuros, se desejar.Adicione um mililitro de tampão de purificação de imunoaffinity frio 1X às contas para lavar e misturar invertendo cinco vezes. Gire a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Aspire a solução de purificação do imunoaffinity e repita a lavagem da purificação do imunoaffinity passo mais uma vez.Em seguida, adicione um mililitro de água HPLC fria às contas e misture invertendo cinco vezes. Gire a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Aspire fora da água e repita a etapa de lavagem de água duas vezes adicionais.Gire um tempo adicional a 2.000 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius para coletar qualquer água restante no fundo do tubo. Com pontas de carregamento de gel de ponta plana, aspire qualquer água extra que tenha coletado. Tenha cuidado para evitar aspirar as contas.Adicione 55 microliters de ácido trifluoroacético de 0,15% na água às contas. Incubar as contas por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto ocasionalmente toca a parte inferior do tubo para misturar. Gire as contas à temperatura ambiente por 30 segundos em uma centrífuga em miniatura.Use uma ponta de carregamento de gel de ponta plana para transferir os peptídeos elucidos para um novo tubo. Adicione 45 microliters de ácido trifluoroacético de 0,15% na água às contas. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto toca na parte inferior do tubo ocasionalmente para misturar.Gire as contas à temperatura ambiente por 30 segundos na centrífuga em miniatura. Remova a segunda elução usando uma ponta de carregamento de gel de ponta plana e misture-a com a primeira elução. Gire os peptídeos elucidos combinados a 12.000 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente para pelotar quaisquer contas que se sobressiam.Transfira a solução da amostra de peptídeos para um novo tubo de 500 microliter. Construa o método de carregamento para carregar as misturas de peptídeos enriquecidos em um chip pré-coluna C18 e salgue novamente os peptídeos lavando com a fase móvel A em dois microliters por minuto durante 10 minutos. Construa o método de cromatografia de modo que os peptídeos sejam transferidos para uma coluna analítica e elute a uma taxa de fluxo de 300 nanoliters por minuto com um gradiente de duas a três horas usando as fases móvel A e B.Especificamente, use um gradiente linear de 5% da fase B móvel para 35% da fase B móvel ao longo de 80 minutos.Posteriormente, aumente a fase móvel B para 80% ao longo de cinco minutos e depois mantenha em 80%B por oito minutos antes de retornar a 5%B para uma ree equilíbrio de 25 minutos. Em seguida, construa um método de instrumentos MS para aquisição dependente de dados. Para o experimento um, configure a varredura de íons precursores MS1 de M/Z 400 a 1.500.Defina a duração para 120 minutos. Crie um experimento IDA e clique em OK. Na guia de critérios de switch, defina o limiar de intensidade para acionar as varreduras de MS/MS para íons de estados carregados entre duas a cinco a 200 contagens por segundo. Defina a exclusão dinâmica dos íons precursores para 60 segundos.Para o experimento dois, defina a digitalização do produto MS/MS com uma faixa de varredura MS2 de M/Z 100 a 1.500. Clique nos parâmetros de edição e defina a energia de colisão para cinco e selecione o modo de digitalização de íons do produto de alta sensibilidade. Por fim, coloque a amostra no autosampler.Envie a fila de amostras e inicie os métodos de aquisição do LC-MS/MS, construindo um método de instrumentos MS para aquisição independente de dados e definindo dois experimentos de varredura de instrumentos. Realize as varreduras de íons precursores do MS1 de 400 a 1.250 massas para carregar e definir a duração para 120 minutos. Defina a energia de colisão para 10 e o tempo de acumulação para 45 milissegundos e selecione o modo de digitalização de íons do produto de alta sensibilidade.Em seguida, importe um arquivo de texto contendo o esquema de aquisição de 64 janelas de janela variável DIA SWATH para preencher janelas de aquisição swath no método. Neste esquema de aquisição, janelas variáveis que variam de cinco a 90 massas para carga e largura são passadas em etapas incrementais sobre a faixa de massa total de 400 a 1.250 massas para carregar com um total de 64 segmentos SWATH cada um com um tempo de acumulação de 45 milissegundos. Ajuste o tempo de acumulação do MS1 para 0,25 segundos.Juntos, a varredura MS1 e 64 ms2 scans devem agora produzir um tempo total de ciclo de 3,2 segundos. Neste estudo, os resultados experimentais documentaram a possibilidade de detectar e avaliar o cross-talk do PTM. Esta tabela mostra como a linha do tempo do fluxo de trabalho e as quantidades de amostra e proteína necessárias.O método de um pote pode ser realizado pela metade do tempo e com metade do número de amostras como esses métodos alternativos. O coeficiente mediano de variação para as áreas de peptídeo modificado foi menor no método de um pote do que no único PTM e enriquecimento PTM serial. Ao comparar os métodos de enriquecimento PTM de um pote e um único PTM, não foram aparentes diferenças notáveis entre as correlações da quantificação do nível do local para as duas modificações.Esta figura exibe dados de um enriquecimento bem sucedido e ilustra um exemplo para um peptídeo contendo múltiplas e diferentes modificações de acicl visualizando o conversão de PTM. Um peptídeo foi acetilado em um resíduo de lise e succilyado no outro, enquanto aqui o mesmo peptídeo foi succilyado em ambas as lises. Isso demonstra que o mesmo resíduo de liseina pode ser modificado com ambos os grupos de aciclização e há a possibilidade de conversa cruzada ocorrer naquele local.É essencial garantir que cada amostra contenha a mesma quantidade de contas e certifique-se de que nenhuma das contas seja aspirada acidentalmente ao lavar contas de ligação de peptídeos. A especificação em massa baseada em perfil e análise de dados em ferramentas de software como o Spectronaut são realizadas após este procedimento para identificar, quantificar e realizar a localização do local de PTMs. Esse fluxo de trabalho de aquisição independente de dados em combinação com o enriquecimento simultâneo de PTM abrirá caminhos para avaliar de forma mais eficiente o cross-talk do PTM e fornecer melhores insights sobre a relevância da sinalização ptm.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Princípios do site-specific Recombinase (SSR) Tecnologia

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Biologia

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...