Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Vi erkänner stödet från NIH delade instrumenteringsbidrag för TripleTOF-systemet vid Buck Institute (1S10 OD016281). Detta arbete stöddes också av National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 till B.S.) och National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 till Eric Verdin; R01 DK090242 till Eric Goetzman). X.X. stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (NIH bevilja T32GM8806, till Judith Campisi och Lisa Ellerby), NB stöddes av en postdoktoral gemenskap från Glenn Foundation for Medical Research.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Detta protokoll beskriver en ny teknik för samtidig multipel PTM anrikning för att mer effektivt förstå PTM crosstalk. Alternativa metoder för att nå detta mål tenderar att vara oöverkomligt tidskrävande och dyrt, och de kräver stora mängder protein för att lyckas11,13. Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för anrikning med flera ptm-medel som innebär inkubation i antikroppskonjuperade pärlor för två PTM-tillverkare samtidigt för att förbättra experimentets övergripande effektivitet. Denna metod innebär också användning av DDA för spektralbibliotek generation och DIA MS förvärv för att upptäcka och kvantifiera peptider som finns med minskad inblandning från fragmentjoner22,23. Program, såsom MS databas sökmotorer används för att analysera och kvantifiera data från DDA förvärv, medan kvantitativa proteomics Software24 och specifika DIA kvantitativanalys Software25 är nödvändiga för att tolka den komplexa spektra produceras av DIA förvärv.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som bör följas noggrant. Eftersom det huvudsakliga målet med protokollet är att berika för flera PTM samtidigt är antikroppsaffinitetsanrikningssteget (avsnitt 2) avgörande för experimentets framgång. När du utför tvättar på pärlorna, är det nödvändigt att se till att ingen av pärlorna är sugs oavsiktligt. Att säkerställa att ureakoncentrationen har spädts ut till 1 M före matsmältningen med trypsin (steg 1.8) är också nödvändigt. Även om 8 M urea krävs tidigare i protokollet för proteinlöslighet, kommer urea koncentrationer över 1 M hämma trypsin s enzymatisk aktivitet. Dessutom är det viktigt att konsekvent kontrollera provets pH-kort i hela protokollet. Detta är särskilt viktigt före matsmältningen. Om pH för provet och trypsin-lösningen inte neutraliseras på lämpligt sätt före inkubationsinkubationen, kan det resultera i en ineffektiv matsmältning där många klyvningsplatser kan missas, vilket resulterar i färre peptididentifieringar.
Några ändringar i protokollet kan vara till hjälp när du förbereder prover. För ett protein som upphandlas från 1 mg utgångsmaterial kan en fjärdedel av antikroppspärlorna som tillhandahålls i varje PTM-skanningsrör användas som ett kostnadseffektivt alternativ. En större mängd utgångsmaterial kan användas för bättre resultat, så länge mängden antikroppar pärlor som används ökar proportionellt. En annan ändring som kan förbättra arbetsflödet är att smälta prover med en annan proteas förutom trypsin. Denna ändring skulle resultera i mer variation i peptider kaverade, vilket ger ökad täckning av proteinrester. Även om det inte är nödvändigt, rekommenderas att trypsin vara en av de enzymer som används för PTM analys på grund av dess höga klyvning specificitet26.
En begränsning av detta protokoll är att de PTMs som studeras måste ha liknande kemister för att berikas samtidigt14. Förfarandena för de olika antikroppskonjuperade pärlorna måste vara likartade, med hjälp av liknande lösningsmedel och lösningar, inklusive liknande elutionvillkor, och helst från samma leverantör. Av denna anledning använder den metod som beskrivs här konsekvent acetylation och koncishet som ett exempel, som båda använder antikroppskonjuperade pärlor (Cell Signaling Technology, Inc). Även om denna metod teoretiskt kan tillämpas på valfritt antal ptm-avgifter, skulle ytterligare studier behövas för att bedöma den exakta begränsningen av protokollet i detta avseende. Eftersom detta är en antikroppsbaserad berikningsmetod kan metoden dessutom endast ge en relativ kvantifiering av PTM-anläggningar.
I jämförelse med befintliga multi-PTM anrikningmetoder är det här arbetsflödet ett mer genomförbart och kostnadseffektivt alternativ. Från detta experiment observerades att effekten av denna metod jämför mycket väl med alternativa metoder, såsom individuella eller seriella anrikningar. Figur 2B visar att median-CV för modifierade peptid toppområden faktiskt minskade i en-pot-metoden jämfört med en-PTM anrikning och seriell-PTM anrikning13. Vi analyserade vidare de experimentella resultaten som bedömde kvantifieringar på platsnivå för acetylation eller koncisation. Dessutom visade Spearman korrelationsanalys(figur 2C,D)att en pott PTM-anrikningen utfördes på samma sätt som arbetsflödena för en PTM-anrikning. Detta gällde även för konkorrelationer på peptid- och fragmentnivå. Samma observation som hölls för alla tre korrelationer när man jämför en pott med seriell-PTM anrikning.
Detta protokoll gör det möjligt för forskare att göra fascinerande biologiska insikter i PTM-överhörning på ett snabbt och kostnadseffektivt sätt. DIA-komponenten i arbetsflödet gör det möjligt för forskare att förstå mer om PTM, eftersom det ger information om lokalisering av webbplatser och övervinner utmaningar som låg platsbeläggning av PTMs. Prekursorjoner tenderar att uteslutas med DDA, vilket är särskilt viktigt när man studerar PTM, eftersom platsbeläggningen ofta är låg till den punkt där dessa peptider inte blir utvalda för MS/MS men fortfarande innehåller viktig information. Uppföljningsexperiment kan utföras för att bedöma den övre gränsen för hur många PTM-skivor som kan berikas samtidigt med den här metoden. En framtida förbättring av detta arbetsflöde kan omfatta utveckling av mer avancerade mjukvaruplattformar för att ytterligare automatisera analysen av lokalisering av webbplats och BELÄGGNING AV PTM-webbplatser.

En myriad av post-translationella ändringar reglerar dynamiskt proteiner och vägar genom effekter på aktiviteten1,signalerar2, och omsättning3,4. Till exempel aktiveras eller inaktiveras proteinkinaser genom tillsats av fosfatgrupper5, och histonacetylation och andra ändringar ger en mekanism för att ändra kromatinstrukturen och fungera som transkriptionella regleringsmekanismer6,7. Under de senaste åren har bevis monterats att flera PTM-grupper arbetar i samförstånd eller konkurrera r att reglera proteinfunktion eller aktivitet8,9,10,11. Därför är förståelse PTM överhörning ett växande behov i PTM forskning. De flesta tillgängliga proteomiska arbetsflöden för att identifiera och kvantifiera PTM-webbplatser fokuserar dock på enstaka ändringar, snarare än samspelet mellan flera ändringar. Det beskrivna arbetsflödet korrelerar specifika proteinmodifiering "hot-spots" och lysinrester som modifieras av flera olika PTM.
Det finns ett växande behov i det vetenskapliga samfundet för genomförbara metoder för att studera flera PTM samtidigt12. De flesta metoder för att globalt identifiera och kvantifiera platserna för flera typer av PTM är utmanande på grund av de höga kostnader och mängden vävnad som krävs12,13. Inte bara är multi-PTM anrikning experiment tidskrävande när det gäller provberedning, datainsamling och dataanalys, men dessa studier kräver vanligtvis stora och ofta oöverkomliga mängder protein11. Beskrivs här är ett protokoll för samtidig anrikning och analys av flera PTM, som också behandlar flera av dessa hinder och möjliggör storskalig PTM profilering och bedömning mellanhörning mellan olika PTMs14. Detta en-pot arbetsflöde beskriver ett praktiskt sätt för biomedicinska forskare att globalt profil flera PTMs, identifiera co-modifierade peptider, och studera PTM överhörning på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt14,15.
Här visas denna metod upp genom att undersöka mitokondriell proteinaylering, som först studerades för över 50 år sedan16. Det koncentrerar sig specifikt på lysinacetylation17 och koncisering18, inklusive samförekomst av dessa ändringar på proteiner och även co-modifiering på peptidnivå. Eftersom studien använder en sirtuin 5 (SIRT5) knockout mus modell, valdes det att fokusera på anrikning av acetylation och koncisathet platser. Detta beslut fattades eftersom koncistningplatser är måltavlor för SIRT5 desuccinylase och förväntas därför visa betydande uppreglering hos KO-möss, vilket gör dem till de mest relevanta PTM i detta fall. Båda PTM är biologiskt relevanta som nyligen sammanfattas av Carrico et al.19. I allmänhet visar acetylation viktiga effekter på genuttryck och metabolism, och koncistivhet har rapporterats för att reglera hjärtmetabolism och funktion20.
Det beskrivna protokollet kan utföras med en låg mängd proteiningångsmaterial (t.ex. 1 mg proteinlysning) och minskar experimentets totala varaktighet genom att minska den tid som ägnas åt provbehandling, MS-förvärv och dataanalys. Ett arbetsflödeschema finns i figur 1. Vi har också använt ännu lägre mängder utgångsmaterial (ner till 100 μg proteinlysa, skala ner mängden pärlor som används därefter), vilket som väntat minskar den totala avkastningen av identifierade acylated peptider; Det ger dock fortfarande mycket värdefulla resultat och kvantifierbara acylated peptider.
Medan så kallade uppifrån och ned eller mitten-down arbetsflöden vanligtvis inte använder proteolytiska matsmältningmetoder (och därmed upprätthålla anslutningen av flera PTMs inom ett protein), fokuserar detta protokoll på en peptid-baserad affinity anrikning strategi för att få extra djup och känslighet för PTM identifiering och kvantifiering(figur 1). Dessutom använder detta peptid-centrerad arbetsflöde moderna masspektrometri metoder, inklusive 1) en kombination av databeroende förvärv (DDA) för att generera spektrala bibliotek, och 2) dataoberoende förvärv (DIA) för korrekt PTM kvantifiering i ett etikettfritt arbetsflöde.
DIA arbetsflöden övervinna provtagning stochasticity av typiska DDA scan system genom att omfattande fragmentera alla peptid signaler inom samplade m / z intervall21. Denna funktion är också mycket fördelaktigt när det gäller webbplats lokalisering, eftersom det är lättare att få information om vilka specifika fragmentjoner ändras inom peptid. Dessutom gör DIA-arbetsflöden identifiering och kvantifiering av mindre PTM-peptidisoformer med identiska prekursorjoner. DIA-metoder kan också bestämma en specifik PTM-platslokalisering inom en peptid baserat på specifika motsvarande fragmentjoner som mäts utförligt hela tiden. DDA-metoder använder dock ofta "dynamisk uteslutning" funktioner som utesluter flera provtagningar av MS/MS för samma prekursorjon, vilket saknar mindre PTM-isoformer.
Den samtidiga anrikningsstrategi som beskrivs här är idealisk för studier som kommer att dra nytta av den globala profilering och kvantifiering av flera PTMs, undersöka PTM-överhörning och förstå de dynamiska interaktionerna mellan ändringar efter översättning. Identifiering av flera berikade PTM-företag i ett kombinerat arbetsflöde har beskrivits av: global, seriell eller parallell anrikning av PTM som innehåller proteolytiska peptider, eller alternativt genom analys av intakta proteiner. I direkt jämförelse med seriell anrikning av acetylation och koncisation, effektiviteten i en pott metod infördes som mycket liknande14. Dessa alternativa protokoll kräver betydande mängder utgångsmaterial och tid och kan vara oöverkomligt dyra. Däremot ger en pottprotokollet en billig och effektiv metod för anrikning av mer än en PTM med efterföljande analys och identifiering.
Muslevervävnader erhålls från SIRT5-knockoutmöss och används här som startmaterial. Detta protokoll kan också utföras för proteinlysning från olika vävnader eller cellkulturexperiment. Detta protokoll kan tillämpas på proteinlysa som erhållits från vävnader eller cellkulturpellets.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

Studera flera post-translationella modifieringar (PTM) av proteiner är ett viktigt steg för att förstå PTM överhörning och få mer holistiska insikter i proteinfunktion. Trots vikten av multi-PTM anrikning studier, få studier undersöka mer än en PTM i taget, delvis på grund av kostnader, tid och stora proteinmängder som krävs för att utföra flera globala proteomiska analys av PTM. Den an-pot" affinitet srikulation som beskrivs i detta protokoll övervinner dessa hinder genom att tillåta samtidig identifiering och kvantifiering av peptider med lysinrester som innehåller acetylation och koncishet PTMs med låga mängder prov Input. Protokollet innebär beredning av proteinlysa från muslever av SIRT5 knockout möss, prestanda trypsin matsmältning, berikning för PTMs, och prestanda av massa spektrometrisk analys med hjälp av en dataoberoende förvärv (DIA) arbetsflöde. Eftersom det här arbetsflödet gör det möjligt att berika två PTM-produkter från samma prov samtidigt, ger det ett praktiskt verktyg för att studera PTM-överhörning utan att kräva stora mängder prover, och det minskar avsevärt den tid som krävs för provberedning, data förvärv och analys. Dia-komponenten i arbetsflödet ger omfattande PTM-specifik information. Detta är särskilt viktigt vid studier av PTM webbplats lokalisering, som DIA ger omfattande uppsättningar av fragmentjoner som kan beräknas beräkningsmässigt att skilja mellan olika PTM lokalisering isoforms.

Figur 1 visar ett allmänt diagram över arbetsflödet, inklusive skörd av vävnaden från muslever, med 1 mg protein för att smälta proteinet lysate med trypsin, inkubering peptider med antikropp-konjugerapärlor, förvärva prover på MS, och slutligen utföra DIA / SWATH analys av data med hjälp av olika kvantitativa proteomics mjukvarupaket (akademiska och kommersiella).
Bild 2A visar hur tidslinjen för arbetsflödet och mängden prov och protein som krävs, jämfört med alternativa metoder som för närvarande används för multi-PTM anrikningstudier. En-pot-metoden kan utföras på hälften så mycket tid och med hälften av antalet prover som dessa alternativa metoder. Jämfört med två single-PTM anrikning metod, en-pot protokollet kräver också hälften av mängden protein.
Detta protokoll har visat sig vara ett genomförbart och kostnadseffektivt alternativ. Figur 2B visar att mediankoefficienten för variation (CV) för modifierade peptidområden var lägre i enpottmetoden än i en-PTM och seriell-PTM-berikande. Figur 2C,D visar att det vid en pottptm och enpottsmetoder för anrikning av ptm och en enda PTM-anrikningsmetoder, inte var anmärkningsvärda skillnader uppenbarade mellan sambanden mellan kvantifieringarna på platsnivå för de två ändringarna. Detta gällde också för peptid-nivå och fragment-nivå korrelationer. Samma iakttagelse som hölls för alla tre korrelationer när man jämför an-pot och seriell-PTM anrikning. Alla underliggande MS rådata och bearbetade Excel resultatblad som är associerade med en färsk rapport från Basisty et al.14 finns tillgängliga och kan laddas ner från MassIVE (MSV00081906) och ProteomeXchange (PXD008640).
I allmänhet, även om antikroppsberikningsstrategier kan visa vissa begränsningar, såsom potentiell epitopocklusion eller begränsad specificitet, är de antikroppar som används i denna studie blandningar av oberoende genererade kloner och ger därmed bredare Särdrag.
Experimentella resultat dokumenterar möjligheten att upptäcka och bedöma PTM-överhörning. Figur 3 visar data från en lyckad berikning och illustrerar ett exempel för en peptid som innehåller flera och olika acyl-ändringar som visualiserar PTM-överhörning. Bild 3A visar en peptid som är acetylated på en lysinrester och koncisat på den andra, och figur 3B visar samma peptid som är kortfattad vid båda lysines. Detta visar att samma lysinrester kan modifieras med både acylationsgrupper, och det finns en möjlighet att korssamtal inträffar på den platsen. I figur 4 visas antalet lysinrester som identifierades enligt avsnitten 7.1-7.3 för att bära båda ändringarna, vilket också pekar mot eventuella PTM-överhörningar.
Som figur 5 visar, bearbetning DIA PTM dataset med kvantitativa proteomics programvara tillåter oss att precisera vilka specifika lysinrester ändras. Detta är ett begrepp som kallas lokalisering av platser, vilket är ett viktigt steg för alla analyser för bestämning av eventuella PTM-överhörning. Figur 5 visar två potentiella isoformer tillsammans med de bekräftande och vederläggajonerna för varje som kan visualiseras och bedömas enligt beskrivningen i avsnitten 8.1-8.3 (särskilt steg 8.3.2 och 8.3.3). Baserat på denna information kunde vi tryggt identifiera vilka av de två isoformerna som fanns i det ursprungliga urvalet. Ms/MS-spektrumet av den bekräftade isoform KQYGEAFEKacR visar tydligt att y jonerna (y2-y5)som innehåller de acetylated lysinrester, som skiftades med 42 m/z (en ökningsmassa av en acetylgrupp), bekräftade de specifika lysinrester i peptid som ändrades.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> Bild 1: Typiskt arbetsflöde för anrikning av en pott för PTM. Vävnad (här, lever) skördas från SIRT5 KO och vild-typ (WT) möss, och proteiner är lysed, trypsin-smälta i peptider, och saltade. Peptider berikas sedan av immuntillhörighet med kombinationer av koncisa- och acetyl-antikroppspärlor. Parallella MS-arbetsflöden mäter både 1) små alikvoter av hela lysate proteinuttrycksförändringar (för proteinnormalisering) och 2) berikade acyl-innehållande peptider för identifiering av acylationsstället (DDA-MS) och lokalisering av platser, följt av kvantifiering (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> Bild 2: Jämförelse av arbetsflöde med en pott med alternativa metoder. (A)Jämförelse av tid, kostnader och material som krävs för enpottsarbetsflödet, serial-PTM-anrikning och två anrikning av en enda PTM. (B)Jämförelse av CV mellan enpottsarbetsflödet, enkel acetyl-lysinPTM-anrikning och enkel kortfattad PTM-anrikning. Spearman korrelationsanalys som jämför acyl peptidtoppområden som erhållits från enpottsarbetsflödet och en-PTM-berikande: motsvarande tomter i log2-toppområdets resultat för(C)acetylationsplatser och (D)koncisatningsplatser. Regressionssluttningar och korrelationsfaktorer anges i de enskilda panelerna14. Två oberoende biologiska replikat behandlades för vart och ett av villkoren. Denna siffra har ändrats från Basist et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> Figur 3: Tvärsnitt mellan acetylation och koncishetmodifiering av lysinrester. MS/MS spektra av tryptic peptider från mitokondriell3-ketoacyl-CoA thiolase som visar samma aminosyra sekvens men har modifierats vid två lysinrester med olika PTMs.(A)MS/MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK och (B)MS/MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Denna siffra har ändrats från Basist et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> Figur 4: Överlappning och tvärprat mellan de acetylated och koncisa lysinrester-specifika exempel i proteinkomplex. A) Venn diagram som visar överlappning mellan 2.235 acetylation och 2.173 koncisation platser. Av dessa var 943 platser både acetylated och koncist. Lever från en SIRT5 (de-succinylas) knockout mus analyserades, och många koncisa platser identifierades. I själva verket var de mer rikligän normalt observerats i muslever (modifierade peptider filtrerades till ett Q-värde av <0,05). (B)Proteinkomplex som visar procentandelen av deras underenheter som innehåller både acetylated och koncisat platser (fet röd linje representerar den betydelse som bestäms av Fishers exakta test). (C)Diagram över ATP syntas komplex: protein underenheter i rött skildrar underenheter som innehåller både acetylated och koncisat platser. Denna siffra har ändrats från Basist et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> Figur 5: Kvantitativproteomics programvara dechiffrerar peptid webbplats lokalisering av PTMs. Baserat på MS/MS fragmentering av peptid, är det möjligt att ge information om de specifika lysinrester acetyl gruppen ändrar. Detta visar programvarans förmåga att erbjuda värdefull information om lokalisering av bankomater. (A)Två möjligheter till lysinrestmodifiering och PTM-lokalisering av platser: KQYGEAFEKacR (vänster) och KacQYGEAFEKR (till höger). "Bekräfta" och "vederlägga" fragmentjoner visas för var och en av de potentiella plats lokalisering isoformer av peptid. Baserat på denna information tilldelas bekräftande poäng och vederläggning av poäng, vilket bekräftar förekomsten av isoform KQYGEAFEKacR i exemplet. B) MS/MS-spektrum som motsvarar den bekräftade isoform KQYGEAFEKacR som anger att alla y joner, inklusive de acetylated lysinrester (y2 och högre) bär en ökningsmassa på +42 m/z, vilket motsvarar acetylmodifieringen. Observerade b joner innehåller inte ändringen. (C)Extraherad jonkromattogram (XIC) med rikliga toppområden till följd av y2 och y3 joner, som båda utgör acetylationsplatsen i den bekräftade isoform KQYGEAFEKacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

I arbetsflödet beskrivs prestanda för tids- och kostnadseffektiv berikning av flera proteinändringar efter translationella (PTM) samtidigt för kvantitativ global proteomanalys. Protokollet använder peptid-nivå PTM anrikning med flera konjugerade antikroppar, följt av dataoberoende förvärv massa pektrometri analys för att få biologiska insikter i PTM överhörning.

Samtidig affinitetsberikning av två ändringar efter translationella för kvantifiering och lokalisering

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Detta protokoll beskriver den nya tekniken för samtidig anrikning av flera PTMs med antikroppar följt av data oberoende förvärv masspektrometri analys för att få biologisk inblick i webbplatsen lokalisering och cross-talk. Detta är en tids- och kostnadseffektiv teknik som möjliggör samtidig identifiering och kvantifiering av peptider med skivning som innehåller acetylering och succinylation-PTM:er med endast små mängder provinmatning. Att spåra efteröversättningsändringar är ett viktigt steg i att karakterisera och bekämpa olika sjukdomsstater.Vi är redan medvetna om att vissa cancerformer och diabetes är starkt reglerade genom dessa protein modifieringar. Denna metod kan teoretiskt gälla för alla PTM med antikroppar för anrikning såsom ubiquitination, fosforylering och andra. Det kan också gälla för andra vävnadstyper eller cellodlingsmodeller.Nyckeln till att få värdefulla data med hjälp av denna teknik är reproducerbarhet. Detta kan uppnås genom att se till att alla steg utförs mycket noggrant särskilt de steg som involverar antikroppspärlorna. Till att börja, erhålla patroner som innehåller C18 harts som kombineras upp till 10 milligram protein.Montera dessa patroner i en vakuumapparat. Tillsätt 800 mikroliter av 80%acetonitril och 0,2%myrsyra till patronerna med 19,8%vatten och starta vakuumsug för att dra vätskan igenom. Upprepa detta steg en gång undvika torkning av patronerna helt.Jämviktspatronerna genom att tillsätta 800 mikroliter med 0,2 %myrsyra i vatten med vakuumsug. Upprepa detta två gånger. Ladda en milligram peptider i ca 1, 000 microliter lösning på patronerna med vakuum sug.Tvätta peptiderna två gånger med 800 mikroliter på 0,2%myrsyra i vatten under vakuumsug. Ordna sedan 1,5 milliliter mikrocentrifugrör under varje patron för att samla in peptiden. Under vakuumsug, elute peptider från patroner först med 800 mikroliter av 80%acetonitril och 0,2%myrsyra i 19,8%vatten sedan med 400 mikroliter av samma lösning.Torka de avsaltade peptidproverna helt i en vakuumkoncentrator i två till tre timmar. Nu, resuspend de torkade peptiderna i 1,4 milliliter av kall 1X immunoaffinity rening buffert. Vortex för att blanda och säkerställa ett pH-värde på cirka 7.Centrifugera proverna vid 10, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. En liten pellet visas. Ställ peptiderna åt sidan på is medan du förbereder antikroppspärlor.Tillsätt en milliliter kall 1X PBS till ett rör som innehåller 100 mikroliter av K-acetyl antikroppslam och ett rör som innehåller 100 mikroliter av K-succinyl antikroppslam och blanda genom pipettering. Överför hela lösningen till nya 1,5 milliliterrör och snurra i en miniatyrcentrifug i 30 sekunder vid rumstemperatur. Aspirera PBS noga med att undvika aspirerande av några pärlor.Upprepa tvätten tre extra gånger. Därefter resuspend pärlorna i cirka 440 mikroliter av PBS. Pipettera pärlorna flera gånger för att blanda väl.Med 200 microliter precut tips, överföra 100 mikroliter av varje acetyllysin antikropp pärlor och succinyllysine antikropp pärlor i ett nytt rör. Snurra ner i 30 sekunder i en miniatyr centrifug och aspirera bort media med en gel lastare spets. Pärlorna blir nu vita.Pipettera den återsuspended peptiden direkt på de tvättade pärlorna och inkubera peptiderna med pärlor i fyra grader Celsius över natten med agitation. På morgonen snurrar du peptidproverna på 2, 000 gånger g i 30 sekunder vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten som innehåller obundna peptider och spara för framtida experiment om så önskas.Tillsätt en milliliter kall 1X immunoaffinity rening buffert till pärlorna att tvätta och blanda genom att invertera fem gånger. Snurra på 2, 000 gånger g i 30 sekunder vid fyra grader Celsius. Aspirera bort immunoaffinity reningslösning och upprepa immunoaffinity rening tvätta steg en gång till.Tillsätt sedan en milliliter kallt HPLC-vatten till pärlorna och blanda genom att invertera fem gånger. Snurra på 2, 000 gånger g i 30 sekunder vid fyra grader Celsius. Aspirera av vattnet och upprepa vattentvättsteget två extra gånger.Snurra ytterligare en gång vid 2, 000 gånger g i 30 sekunder vid fyra grader Celsius för att samla eventuellt kvarvarande vatten i botten av röret. Med platta tippade gel lastning tips, aspirera bort något extra vatten som har samlats. Var försiktig så att du undviker att aspirera pärlorna.Tillsätt 55 mikroliter av 0,15%trifluoroättiksyra i vatten till pärlorna. Inkubera pärlorna i 10 minuter i rumstemperatur medan du ibland knackar på botten av röret för att blanda. Snurra pärlorna i rumstemperatur i 30 sekunder i en miniatyrcentrifug.Använd en platt tippad gel lastning spets för att överföra eluted peptider i ett nytt rör. Tillsätt 45 mikroliter av 0,15%trifluoroättiksyra i vatten till pärlorna. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur medan du knackar på rörets botten då och då för att blanda.Snurra pärlorna i rumstemperatur i 30 sekunder i miniatyrcentrifugen. Ta bort den andra elueringen med hjälp av en platt tippad gel lastning spets och kombinera den med den första eluering. Snurra de kombinerade eluted peptiderna i 12, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur för att pelleta eventuella pärlor som för över.Överför peptidprovlösningen till ett nytt 500-mikroliterrör. Bygg upp lastningsmetoden för att lasta de berikade peptidblandningarna på ett C18-chip för kolonn och avsalta peptiderna igen genom att tvätta med mobil fas A vid två mikroliter per minut i 10 minuter. Bygg kromatografimetoden så att peptider överförs till en analytisk kolonn och elute vid en flödeshastighet på 300 nanoliter per minut med en två till tre timmars lutning med hjälp av mobila faserna A och B.Specifikt, använd en linjär gradient från 5%mobil fas B till 35%mobil fas B under 80 minuter.Därefter ramp den mobila fasen B till 80%under fem minuter sedan hålla på 80%B i åtta minuter innan han återvände till 5%B för en 25-minuters återjämning. Därefter bygger du en MS-instrumentmetod för databeroende förvärv. För experiment ett, inrätta MS1 föregångare jonskanning från M / Z 400 till 1, 500.Ställ in varaktigheten på 120 minuter. Skapa ett IDA-experiment och klicka på OK. Under fliken växelvillkor, ange intensitetströskeln för att utlösa MS/MS-skanningar för joner av debiterade tillstånd mellan två till fem till 200 antal per sekund. Ställ in den dynamiska uteslutningen av prekursorjoner till 60 sekunder.För experiment två, ställ MS / MS produktjonskanning med en MS2 scan intervall från M / Z 100 till 1, 500. Klicka på redigera parametrar och ställ in kollision energi sprids till fem och välj hög känslighet produkt jonsökning läge. Placera slutligen provet i autosampler.Skicka in exempelkön och starta LC-MS/MS-förvärvsmetoder som bygger upp en MS-instrumentmetod för dataoberoende förvärv och definiera två instrumentgenomsökningsexperiment. Utför MS1-prekursorjonskanningar från 400 till 1, 250 massa för att ladda och ställ in varaktigheten på 120 minuter. Ställ kollision energi sprids till 10 och ackumulering tid till 45 millisekunder välj sedan hög känslighet produkt jonsökning läge.Därefter importerar du en textfil som innehåller 64 variabelfönstret DIA SWATH förvärvsschema för att fylla SWATH förvärv fönster i metoden. I detta förvärvsschema skickas variabla fönster från fem till 90 massa till laddning och bredd i stegvisa steg över hela massintervallet 400 till 1, 250 massa att ladda med totalt 64 SWATH-segment vardera med en 45 millisekunders ackumuleringstid. Justera MS1-ansamlingstiden till 0,25 sekunder.Tillsammans ska ms1 scan och 64 MS2 skanningar bör nu ge en total cykeltid på 3,2 sekunder. I denna studie dokumenterade experimentella resultat möjligheten att upptäcka och bedöma PTM cross-talk. I den här tabellen visas hur tidslinjen för arbetsflödet och de mängder prov och protein som krävs.En-pot metoden kan utföras på hälften så mycket tid och med halva antalet prover som dessa alternativa metoder. Medianens variationskoefficient för de modifierade peptidområdena var lägre i en-pot-metoden än i den enda PTM och seriell PTM-anrikning. Samtidigt som man jämförde en-pot PTM och enstaka PTM-berikningsmetoder, var inga anmärkningsvärda skillnader uppenbara mellan sambanden för kvantifiering på platsnivå för de två ändringarna.Denna siffra visar data från en lyckad anrikning och illustrerar ett exempel för en peptid som innehåller flera och olika acyl modifieringar visualisera PTM cross-talk. En peptid var acetylerad på en lysin rester och succilynated på den andra medan här samma peptid var succilynated på båda lysin. Detta visar att samma lysin rester kan ändras med både acylation grupper och det finns en möjlighet att cross-talk inträffar på den platsen.Det är viktigt att se till att varje prov innehåller samma mängd pärlor och se till att ingen av pärlorna är aspirerade av misstag när du tvättar peptidbindningspärlor. Masspektrometri baserad profilering och dataanalys i mjukvaruverktyg såsom Spectronaut utförs efter denna procedur för att identifiera, kvantifiera och utföra plats lokalisering av PTMs. Detta dataoberoende förvärvsarbetsflöde i kombination med samtidig PTM-anrikning kommer att öppna vägar för att mer effektivt bedöma PTM-cross-talk och ge bättre insikter om relevansen av PTM-signalering.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Principer för platsspecifika Recombinase (SSR) Teknik

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Teknik för analys av Cell Typspecifika Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Upptäckt av post-translationella modifieringar på inhemska intakt nukleosomer med ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor avbildning av biologiska strukturer med fluorescens Fotoaktivering Lokalisering Mikroskopi

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Högupplöst Kvantifiering av kristallin cellulosa Ackumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots att övervaka Vävnadsspecifik cellvägg Ändringar

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifiering av platsspecifika Protein lysin acetylering och Succinylation stökiometri använder Data-oberoende förvärv masspektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...