Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Buck Enstitüsü'ndeki (1S10 OD016281) TripleTOF sistemi için NIH ortak enstrümantasyon hibesinin desteğini kabul ediyoruz. Bu çalışma ayrıca Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (R01 AI108255-B.S.) ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R24 DK085610, Eric Verdin; R01 DK090242 Eric Goetzman için). X.X. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH hibe T32GM8806, Judith Campisi ve Lisa Ellerby için) bir hibe tarafından desteklenen, NB Glenn Vakfı Tıbbi Araştırma için doktora sonrası burs tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, PTM çapraz konuşmasını daha etkili bir şekilde anlamak için eşzamanlı çoklu PTM zenginleştirme için yeni bir tekniği açıklar. Bu amaca ulaşmanın alternatif yöntemleri engelleyici zaman alıcı ve pahalı olma eğilimindedir, ve başarılı olmak için protein büyük miktarda gerektirir11,13. Bu protokol, deneyin genel verimliliğini artırmak için aynı anda iki PTM için antikor konjuge boncuklarda kuluçka içeren çok PTM zenginleştirme iş akışı sunar. Bu yöntem aynı zamanda spektral kütüphane üretimi ve DIA MS kazanımları için DDA kullanımını tespit etmek ve parça iyonları22,23azaltılmış girişim ile mevcut peptidler ölçmek içerir. MS veritabanı arama motorları gibi yazılım programları DDA satın almalarından elde edilen verileri analiz etmek ve ölçmek için kullanılırken, Kantitatif Proteomik Yazılım24 ve dia satın almaları tarafından üretilen karmaşık spektrumları yorumlamak için özel DIA Kantitatif Analiz Yazılımı25 gereklidir.
Bu protokol içinde dikkatle izlenmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Protokolün ana amacı aynı anda birden fazla PtM için zenginleştirmek olduğundan, antikor-yakınlık zenginleştirme adımı (bölüm 2) deneyin başarısı için önemlidir. Boncuklar üzerinde yıkıntı yaparken, boncukların hiçbirinin kazara aspire edilmemesini sağlamak gerekir. Üre konsantrasyonunun sindirimden önce 1 M'ye kadar seyreltilmesini sağlamak tripsin (adım 1.8) ile de gereklidir. Protein çözünürasyonu için protokolde daha önce 8 M üre gerekmesine rağmen, 1 M'nin üzerindeki üre konsantrasyonları tripsinin enzimatik aktivitesini inhibe edecektir. Buna ek olarak, protokol boyunca numunenin pH'ını sürekli olarak kontrol etmek önemlidir. Bu özellikle sindirim öncesinde önemlidir. Numunenin pH'ı ve tripsin çözeltisi kuluçkadan önce uygun şekilde nötralize edilmezse, birçok dekolte bölgesinde gözden kaçırılabileceği ve daha az peptid tanımlaması ile sonuçlanabileceği verimsiz bir sindirime neden olabilir.
Örnekler hazırlanırken protokolde yapılan birkaç değişiklik yararlı olabilir. 1 mg başlangıç materyalinden elde edilen bir protein lisat için, her PTM tarar tüpünde sağlanan antikor boncuklarının dörtte biri uygun maliyetli bir alternatif olarak kullanılabilir. Kullanılan antikor boncuk miktarı orantılı olarak arttığı sürece, daha iyi sonuçlar için daha fazla sayıda başlangıç malzemesi kullanılabilir. İş akışını geliştirebilecek bir diğer değişiklik de, örnekleri tripsinin ek olarak başka bir proteaz ile sindirmektir. Bu modifikasyon, protein kalıntılarının daha fazla kapsama alanı sağlayarak, kümeslerde daha fazla değişkenliğe neden olur. Gerekli olmamakla birlikte, yüksek dekolte özgüllüğü nedeniyle PTM analizinde kullanılan enzimlerden biri olan tripsinin olması tavsiye edilir26.
Bu protokolün bir sınırlama sıyrık, çalışılan PtM'lerin aynı anda zenginleşebilmesi için benzer kimyalara sahip olması gerektiğidir14. Farklı antikor konjuge boncuklar için prosedürler benzer olmalıdır, benzer elüsasyon koşulları da dahil olmak üzere benzer çözücüler ve çözümler kullanarak, ve tercihen aynı satıcıdan. Bu nedenle, burada özetlenen yöntem sürekli bir örnek olarak asetilasyon ve süksinyas kullanır, her ikisi de antikor konjuge boncuklar kullanın (Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc). Bu yöntem teorik olarak herhangi bir sayıda PtM'ye uygulanabilmesine rağmen, protokolün bu konudaki tam sınırlamasını değerlendirmek için ek çalışmalara ihtiyaç olacaktır. Ayrıca, bu bir antikor tabanlı zenginleştirme yöntemi olduğu gibi, yöntem sadece PTM sitelerinin göreceli bir nicel sağlayabilir.
Mevcut çoklu PTM zenginleştirme yöntemleriile karşılaştırıldığında, bu iş akışı daha uygun ve uygun maliyetli bir alternatiftir. Bu deneyden, bu yöntemin etkinliğinin bireysel veya seri zenginleştirmeler gibi alternatif yöntemlerle son derece iyi karşılaştırıldığında olduğu gözlenmiştir. Şekil 2B, modifiye peptid pik alanları için ortanca CV aslında tek PTM zenginleştirmeler ve seri-PTM zenginleştirmeler13göre tek pot yöntemi azalmıştır gösterir. Ayrıca asetilasyon veya süksinilasyon için site düzeyinde ki nicelikleri değerlendiren deneysel sonuçları analiz ettik. Ayrıca, Spearman korelasyon analizi(Şekil 2C,D)tek potluk PTM zenginleştirme tek PTM zenginleştirme iş akışları benzer performans gösterdi. Bu aynı zamanda peptid ve parça düzeyinde korelasyonlar için de geçerliydi. Seri-PTM zenginleştirme ile bir-pot karşılaştırırken her üç korelasyon için yapılan aynı gözlem.
Bu protokol, araştırmacıların PTM crosstalk'a hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde büyüleyici biyolojik bilgiler edinmelerini sağlar. İş akışının DIA bileşeni araştırmacıların PTM'ler hakkında daha fazla bilgi sağlamasına olanak sağlar, çünkü site lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar ve PTM'lerin düşük site doluluk oranı gibi zorlukların üstesinden gelmektedir. Bu yöntem kullanılarak aynı anda kaç PtM'nin zenginleştirilebildiğini değerlendirmek için takip deneyleri yapılabilir. Bu iş akışının gelecekteki bir iyileştirme daha fazla site yerelleştirme ve PTM site doluluk analizini otomatikleştirmek için daha gelişmiş yazılım platformları geliştirilmesi içerebilir.

Çok sayıda çeviri sonrası modifikasyon, proteinleri ve yolları aktivite1,sinyalizasyon2ve ciro3,4üzerindeki etkilerle dinamik olarak düzenler. Örneğin, protein kinazları fosfat grupları5ilavesi ile aktive edilir veya devre dışı bırakılır ve histon asetilasyon ve diğer modifikasyonlar kromatin yapısını değiştirmek için bir mekanizma sağlar ve transkripsiyonel düzenleyici mekanizmalar olarak hizmet vermektedir6,7. Son yıllarda, kanıt birden fazla PTM konser de çalışmak ya da protein fonksiyonu veya aktivitesi8,9,10,11düzenlemek için rekabet monte edilmiştir. Bu nedenle, PTM crosstalk anlamak PTM araştırma ortaya çıkan bir ihtiyaçtır. Ancak, PTM sitelerini tanımlamak ve ölçmek için mevcut proteomik iş akışlarının çoğu, birden çok değişikliğin etkileşimi yerine tek değişikliklere odaklanır. Açıklanan iş akışı, birden fazla farklı PtM tarafından modifiye edilen spesifik protein modifikasyonu "sıcak noktalar" ve lizin artıklarını ilişkilendirir.
Aynı anda birden fazla PTM'leri incelemek için uygulanabilir yöntemler için bilim camiasında artan bir ihtiyaç vardır12. Küresel olarak belirlemek ve PTM birden fazla türde siteleri ölçmek için en yöntemleri yüksek maliyet ve doku miktarı nedeniyle12,13gerekli zor . Sadece çok PTM zenginleştirme deneyleri örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi açısından zaman alıcı, ancak bu çalışmalar genellikle protein büyük ve genellikle engelleyici miktarda gerektirir11. Burada açıklanan aynı anda zenginleştirme ve birden fazla PTM analizi için bir protokol, aynı zamanda bu engellerin birkaç adresleri ve büyük ölçekli PTM profilleme sağlar ve çeşitli PTM'ler arasında çapraz konuşma değerlendirme14. Bu bir-pot iş akışı biyomedikal araştırmacılar için pratik bir yol özetliyor küresel birden fazla PTMs profil, co-modifiye peptidler tanımlamak, ve verimli ve maliyet-etkin bir şekilde PTM crosstalk çalışma14,15.
Burada, bu yöntem ilk 50 yıl önce16üzerinde çalışıldı mitokondriyal protein aylasyonu inceleyerek sergilenir. Özellikle lizin asetilasyon17 ve süksinilasyon18üzerinde yoğunlaşmıştır , proteinler ve hatta peptid düzeyinde co-modifikasyon bu değişikliklerin birlikte oluşumu da dahil olmak üzere. Çalışma da sirtuin 5 (SIRT5) nakavt fare modeli kullandığından, asetilasyon ve süksinilasyon alanlarının zenginleşmesine odaklanmak için seçilmiştir. Bu karar, kısas ilasyon alanlarının SIRT5 desuccinylase'nin hedefi olması ve bu nedenle KO farelerde önemli bir düzenleme göstermesi nin beklendiği için alınmıştır. Her iki PTMs biyolojik olarak son zamanlarda Carrico ve ark.19tarafından özetlenen ilgilidir. Genel olarak, asetilasyon gen ekspresyonu ve metabolizması üzerinde önemli etkileri gösterir, ve succinylation kalp metabolizması ve fonksiyon düzenlemek için bildirilmiştir20.
Açıklanan protokol, düşük miktarda protein girdi materyali (örn. 1 mg protein lisat) ile gerçekleştirilebilir ve numune işleme, MS alımı ve veri analizi için harcanan süreyi azaltarak deneyin toplam süresini kısaltabilir. Şekil 1'debir iş akışı şeması verilmiştir. Ayrıca daha da düşük miktarlarda başlangıç materyali (100 μg'a kadar protein lisat, buna göre kullanılan boncuk miktarlarını azaltarak) kullandık ve bu da beklendiği gibi tanımlanmış acylated peptidlerin toplam verimini azaltıyor; ancak, hala son derece değerli sonuçlar ve ölçülebilir acylated peptidler sağlar.
Yukarıdan aşağıya veya orta aşağı iş akışları genellikle proteolitik sindirim yaklaşımları kullanmazken (ve böylece tek bir protein içinde birden fazla PtM'nin bağlantısını korurken), bu protokol PTM tanımlama ve nicelleştirme için ekstra derinlik ve duyarlılık kazanmak için peptid bazlı afinite zenginleştirme yaklaşımına odaklanır (Şekil 1). Buna ek olarak, bu peptit merkezli iş akışı, 1) spektral kitaplıklar oluşturmak için veriye bağımlı kazanım (DDA) kombinasyonu ve etiketsiz bir iş akışında doğru PTM niceliği için 2) veri bağımsız kazanım (DIA) dahil olmak üzere modern kütle spektrometresi yöntemlerikullanır.
DIA iş akışları, örneklenmiş m/z aralığı21'dekitüm peptit sinyallerini kapsamlı bir şekilde parçalayarak tipik DDA taramalar›n› n› örnekleme stochasticity'nin üstesinden gelecektir. Bu özellik, hangi belirli parça iyonlarının peptid içinde değiştirildiğine ilişkin bilgi edinmek daha kolay olduğundan, site lokalizasyonu açısından da son derece yararlıdır. Buna ek olarak, DIA iş akışları özdeş öncül iyonları ile küçük PTM-peptid isoformların tanımlanması ve nicelleştirilmesine olanak sağlar. DIA yöntemleri de kapsamlı her zaman ölçülen belirli karşılık gelen parça iyonları dayalı bir peptid içinde belirli bir PTM site lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Ancak, DDA yaklaşımları genellikle aynı öncül iyon için MS/MS örneklemesini dışlayan ve böylece küçük PTM isoformlarını kaçıran "dinamik dışlama" özelliklerini kullanır.
Burada açıklanan eşzamanlı zenginleştirme stratejisi, birden fazla PTM'nin küresel profilleme ve sayısallaştırılmasından, PTM çapraz konuşmasının incelenmesinden ve çeviri sonrası modifikasyonların dinamik etkileşimlerinin anlaşılmasından yararlanacak çalışmalar için idealdir. Tek bir kombine iş akışında birden fazla zenginleştirilmiş PTM'nin tanımlanması şu şekilde tanımlanmıştır: proteolitik peptidler içeren PTM'nin küresel, seri veya paralel zenginleştirilmesi veya alternatif olarak bozulmamış proteinlerin analizi. Asetiles ve süksinir seri zenginleştirme ile doğrudan karşılaştırıldığında, tek pot metodolojisinin verimliliği çok benzer14olarak kurulmuştur. Bu alternatif protokoller önemli miktarda başlangıç malzemesi ve zaman gerektirir ve son derece pahalı olabilir. Buna karşılık, tek pot protokolü sonraki analiz ve tanımlama ile birden fazla PTM zenginleştirme için ucuz ve verimli bir yöntem sağlar.
Fare karaciğer dokuları SIRT5 nakavt farelerden elde edilir ve burada başlangıç malzemesi olarak kullanılır. Bu protokol aynı zamanda farklı dokulardan veya hücre kültürü deneylerinden protein lisatları için de yapılabilir. Bu protokol dokulardan veya hücre kültürü peletlerinden elde edilen protein lisatlarına uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

Proteinlerin birden fazla çeviri sonrası modifikasyonları (PtM) eğitimi PTM crosstalk anlamak ve protein fonksiyonu içine daha bütünsel anlayışlar kazanmak için önemli bir adımdır. Çok PTM zenginleştirme çalışmalarının önemine rağmen, ptm'lerin birden fazla küresel proteomik analizini gerçekleştirmek için gereken harcamalar, zaman ve büyük protein miktarları nedeniyle, aynı anda birden fazla PTM araştırmak birkaç çalışma. Bu protokolde ayrıntılı olarak yer alan "tek pot" yakınlık zenginleştirme, peptidlerin eşzamanlı olarak tanımlanmasına ve ölçülmesiile, düşük miktarda numune içeren lizin kalıntıları ve süksinyon PTM'leri ile bu engelleri aşarak aşar. Giriş. Protokol, SIRT5 nakavt farelerin fare karaciğerlerinden protein lisatının hazırlanmasını, tripsin sindiriminin ifasını, PtM'ler için zenginleştirmeyi ve veribağımsız bir kazanım (DIA) iş akışı kullanarak kütle spektrometrik analizinin gerçekleştirilmesini içerir. Bu iş akışı aynı örnekten aynı anda iki PTM zenginleştirme sağlar, bu örnek büyük miktarlarda gerek kalmadan PTM crosstalk çalışma için pratik bir araç sağlar ve büyük ölçüde örnek hazırlanması için gerekli süreyi azaltır, veri edinimi ve analizi. İş akışının DIA bileşeni kapsamlı PTM'ye özgü bilgiler sağlar. DIA, farklı PTM yerelleştirme izoformlarını ayırt etmek için hesaplama lı olarak deşifre edilebilen kapsamlı parça iyonları setleri sağladığından, PTM site yerelleştirmesini incelerken bu özellikle önemlidir.

Şekil 1, fare karaciğerlerinden doku hasat, tripsin ile protein lisats isindirimi için 1 mg protein kullanarak, antikor konjuge boncuklar ile peptidler kuluçka, MS örnekleri edinme ve son olarak çeşitli kantitatif proteomik yazılım paketleri (akademik ve ticari) kullanarak verilerin DIA / SWATH analizi gerçekleştirmek de dahil olmak üzere iş akışının genel bir diyagramgösterir.
Şekil 2A, çoklu PTM zenginleştirme çalışmaları için şu anda kullanılmakta olan alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında, iş akışının zaman çizelgesini ve gerekli numune ve protein miktarlarını gösterir. Tek pot yöntemi bu alternatif yöntemlerin yarısı kadar ve yarım örnek sayısı ile yapılabilir. İki tek PTM zenginleştirme yöntemi ile karşılaştırıldığında, tek pot protokolü de protein miktarının yarısını gerektirir.
Bu protokolün uygulanabilir ve uygun maliyetli bir alternatif olduğu gösterilmiştir. Şekil 2B, modifiye peptid alanlar için ortanca varyasyon katsayısının (CV) tek pot yönteminde tek ptm ve seri PTM zenginleştirmelerine göre daha düşük olduğunu göstermektedir. Şekil 2C,D, tek potlu PTM ve tek PTM zenginleştirme yöntemlerini karşılaştırırken, iki modifikasyon için site düzeyindeki niceliklerin korelasyonları arasında kayda değer bir fark olmadığını göstermektedir. Bu durum peptid düzeyi ve parça düzeyi korelasyonları için de geçerlidir. Tek pot ve seri PTM zenginleştirmeleri karşılaştırırken her üç korelasyon için de aynı gözlem yapıldı. Basisty ve ark.14 tarafından hazırlanan yeni bir raporla ilişkili tüm temel MS ham verileri ve işlenmiş Excel sonuç sayfaları mevcuttur ve MassIVE (MSV00081906) ve ProteomeXchange 'den (PXD008640) indirilebilir.
Genel olarak, antikor zenginleştirme stratejileri, potansiyel epitop tıkanıklığı veya sınırlı özgüllük gibi bazı sınırlamalar gösterse de, bu çalışmada kullanılan antikorlar bağımsız olarak oluşturulan klonların karışımlarıdır ve böylece daha geniş aralıklar özellikleri.
Deneysel sonuçlar PTM çapraz konuşmasını tespit etme ve değerlendirme olasılığını belgelemektedir. Şekil 3, başarılı bir zenginleştirmeden elde edilen verileri görüntüler ve PTM çapraz konuşmasını görselleştiren birden fazla ve farklı asil modifikasyoniçeren bir peptid örneği gösterir. Şekil 3A bir lizin kalıntısı üzerinde asetiled ve diğer insuccinylated bir peptit gösterir, ve Şekil 3B her iki lizinde süksinat aynı peptid gösterir. Bu aynı lizin kalıntısı her iki aylation grupları ile değiştirilebilir olduğunu göstermektedir, ve bu sitede meydana gelen çapraz konuşma olasılığı vardır. Şekil 4, her iki değişikliği de taşımak için 7.1-7.3 bölümlerinde tanımlandığı şekilde tanımlanan lizin artıklarının sayısını göstererek olası PTM çapraz konuşmasına işaret etmektedir.
Şekil 5'in gösterdiği gibi, DIA PTM veri kümelerinin nicel proteomik yazılımla işlenmesi, hangi lizin kalıntılarının değiştirildiğini belirlememizi sağlar. Bu olası PTM crosstalk belirlenmesi için herhangi bir analiz için önemli bir adımdır site yerelleştirme olarak bilinen bir kavramdır. Şekil 5, 8.1-8.3 bölümlerinde (özellikle 8.3.2 ve 8.3. adımlarında) açıklandığı gibi görselleştirilebilen ve değerlendirilebilen her biri için doğrulayıcı ve çürütülen iyonlarla birlikte iki potansiyel izoform görüntüler. Bu bilgilere dayanarak, orijinal örnekte iki izoformdan hangisinin bulunduğunu güvenle tespit edebildik. Doğrulanmış izoform KQYGEAFEKacR'ın MS/MS spektrumu, 42 m/z (asetil grubunun artış kütlesi) ile kaymış olan asetil lisin kalıntısını içeren y iyonlarının (y2-y5)modifiye edilen peptiddeki spesifik lizin kalıntısını doğruladığını açıkça göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> Şekil 1: PTM'lerin tek potlu zenginleşmesi için tipik iş akışı. Doku (burada, karaciğerler) SIRT5 KO ve yabani tip (WT) farelerden hasat edilir ve proteinler lysed, peptidler içine tripsin-sindirilir ve desalted. Peptidler daha sonra süksinil ve asetil antikor boncuk kombinasyonları ile immünafinite ile zenginleştirilmiştir. Paralel MS iş akışları, aylaksasyon alanı tanımlaması (DDA-MS) ve site lokalizasyonu için zenginleştirilmiş asil içeren peptidlerin (protein normalizasyonu için) ve 2) hem 1) küçük lysate protein ekspresyonu değişikliklerini (protein normalizasyonu için) hem de küçük aliquotları ölçer ve ardından nicelleştirme (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> Şekil 2: Tek potiş iş akışının alternatif yöntemlerle karşılaştırılması. (A)Tek potlu iş akışı, seri PTM zenginleştirme ve iki tek PTM zenginleştirme için gereken zaman, maliyet ve malzemelerin karşılaştırılması. (B) Tek pot iş akışı, tek asetil-lizin PTM zenginleştirme ve tek süksin-lizin PTM zenginleştirme arasında CV'ler karşılaştırması. Tek pot iş akışından elde edilen asil peptid pik alanlarını ve tek PTM zenginleştirmelerini karşılaştıran spearman korelasyon analizi:(C) asetilasyon bölgeleri ve (D) süksinilasyon alanları için log2 tepe alanı sonuçlarının karşılık gelen arazileri. Regresyon eğimleri ve korelasyon faktörleri tek tek panellerde gösterilir14. Her bir koşul için iki bağımsız biyolojik kopya işlendi. Bu rakam Basisty ve ark.14'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> Şekil 3: Lizin kalıntılarının asetilasyon ve süksinilasyon modifikasyonları arasında çapraz konuşma. Aynı amino asit dizisini gösteren ancak farklı PTM'ler ile iki lizin kalıntısı modifiye edilmiş mitokondriyal 3-ketoasil-CoA thiolase gelen triptik peptidlerin MS/MS spektrumları. (A) Peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK ve (B) MS/MS of peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Bu rakam Basisty ve ark.14'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> Şekil 4: Protein komplekslerinde asetilve süksinli lizin artıkları arasında örtüşme ve çapraz konuşma. (A) Venn diyagramı 2.235 asetilasyon ve 2.173 süksinyon siteleri arasında çakışma gösteren. Bunlardan 943'ü hem asetilhem de süksildi. SIRT5 (de-succinylase) nakavt faresinden alınan karaciğer analiz edildi ve birçok süksinyalasyon alanı tespit edildi. Aslında, fare karaciğerinde normal olarak gözlenenden daha boldular (modifiye peptidler <0.05 Q değerinde filtrelendi). (B) Hem asetilhem de süksinyonlu siteleri içeren alt birimlerinin yüzdesini gösteren protein kompleksleri (koyu kırmızı çizgi Fisher'ın tam testinde belirlenen önemi temsil eder). (C) ATP synthase kompleksinin diyagramı: kırmızı protein alt birimleri hem asetillated hem de süksinlated siteleri içeren alt birimleri göstermektedir. Bu rakam Basisty ve ark.14'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> Şekil 5: Kantitatif proteomik yazılım PtM'lerin peptid site lokalizasyonunu deşifre eder. Peptidin MS/MS parçalanmasına bağlı olarak asetil grubunun modifiye olduğu spesifik lizin kalıntısı hakkında bilgi vermek mümkündür. Bu, yazılımın PTM'lerin site lokalizasyonu hakkında değerli bilgiler sunabilme yeteneğini sergiler. (A) Lizin kalıntısı modifikasyonu ve PTM site lokalizasyonu için iki olasılık: KQYGEAFEKacR (solda) ve KacQYGEAFEKR (sağda). Peptidin potansiyel site lokalizasyon izoformlarının her biri için "doğrulama" ve "çürütme" parça iyonları gösterilir. Bu bilgilere dayanarak, puanların doğrulanmaları ve çürütme puanları atanarak örnekte izoform KQYGEAFEKacR'nin varlığını doğrular. (B) Doğrulanmış izoform KQYGEAFEKacR'a karşılık gelen MS/MS spektrumu, asetil lisin kalıntısı (y2 ve üzeri) dahil olmak üzere tüm y iyonlarının +42 m/z artış kütlesi taşıdığını ve bu iyonların asetil modifikasyonuna karşılık geldiğini belirtir. Gözlenen b iyonları modifikasyon içermez. (C) Çıkarılan iyon kromatogram (XIC) y2 ve y3 iyonları kaynaklanan bol tepe alanları ile, her ikisi de teyit izoform KQYGEAFEKacR asetilasyon site makyaj <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Bu protokol, birden fazla PtM'nin antikorlarla eşzamanlı olarak zenginleştirilmesi ve ardından veri bağımsız toplama kütle spektrometresi analizinin site lokalizasyonu ve çapraz konuşma hakkında biyolojik bir içgörü elde etmek için yeni tekniği açıklamaktadır. Bu, peptidlerin asetilasyon ve süksinyon PtM'leri içeren dilimleme ile sadece az miktarda numune girişi ile eşzamanlı olarak tanımlanmasını ve nicelemesini sağlayan bir zaman ve uygun maliyetli tekniktir. Çeviri sonrası değişikliklerin izlenmesi, farklı hastalık durumlarını karakterize etme ve bunlarla mücadelede önemli bir adımdır.Bazı kanserlerin ve şeker hastalığının bu protein modifikasyonları ile yüksek oranda düzenlendiğinin farkındayız. Bu yöntem teorik olarak her yerde zenginleşme, fosforilasyon ve diğerleri gibi antikorları olan PtM'ler için geçerli olabilir. Ayrıca diğer doku tipleri veya hücre kültürü modelleri için geçerli olabilir.Bu tekniği kullanarak değerli veri elde etmek için anahtar tekrarlanabilirlik olduğunu. Bu, tüm adımların özellikle antikor boncukları içeren adımlarda çok dikkatli bir şekilde yapılmasını sağlayarak elde edilebilir. Başlamak için, 10 miligrama kadar proteini birleştiren C18 resin içeren kartuşlar elde edin.Bu kartuşları bir vakum aparatına sığdırın. Kartuşlara %19,8 su ile 800 mikrolitre asetonitril ve %0,2 formik asit ekleyin ve sıvıyı çekmek için vakum emmeye başlayın. Kartuşların tamamen kurumasını önleyerek bu adımı bir kez tekrarlayın.Vakum emme ile suya %0,2 formik asit 800 mikrolitre ekleyerek kartuşları dengeleyin. Bunu iki kez tekrarlayın. Vakum emme ile kartuşları üzerine yaklaşık 1.000 mikrolitre çözelti bir miligram peptidler yükleyin.Vakum emme altında suda% 0.2 formik asit 800 mikrolitre ile iki kez peptidler yıkayın. Sonra peptid toplamak için her kartuş altında 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpler idüzenleyin. Vakum emme altında, kartuşlardan gelen eute peptidler önce 800 mikrolitre %80 asetonitril ve %0,2 formik asit %19,8 suda, sonra aynı çözeltinin 400 mikrolitresi ile.Tuzsuz peptid örneklerini 2-3 saat boyunca vakumlu konsantratöründe tamamen kurutun. Şimdi, soğuk 1X immünafinit arıtma tampon 1.4 mililitre kurutulmuş peptidler resuspend. Girdap karıştırmak ve yaklaşık 7 bir pH sağlamak.Numuneleri 10,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Küçük bir pelet belirir. Antikor boncuk hazırlarken buz üzerinde bir kenara peptidler ayarlayın.100 mikrolitre K-asetil antikor boncuk bulamacı ve 100 mikrolitre K-succinyl antikor boncuk bulamacı içeren bir tüp içeren bir tüpe bir mililitre soğuk 1X PBS ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüm çözeltiyi yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca minyatür bir santrifüjde döndürün. Herhangi bir boncuk kapalı aspirating önlemek için özen PBS aspire.Yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Sonra, PBS yaklaşık 440 mikrolitre boncuk resuspend. Pipet boncuklar birkaç kez iyi karıştırmak için.200 mikrolitre precut ipuçları ile, transfer 100 her asetilizin antikor boncuk ve süksinillyin antikor boncuklar yeni bir tüp içine mikrolitre. Minyatür bir santrifüj de 30 saniye boyunca aşağı spin ve bir jel yükleyici ucu ile medya kapalı aspire. Boncuklar şimdi beyaza dönüyor.Pipet yıkanmış boncuklar üzerine doğrudan resuspended peptid ve ajitasyon ile bir gecede dört derece santigrat boncuk ile peptidler kuluçka. Sabahları, peptit örneklerini 2,000 kez g'de 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede döndürün. Bağlı olmayan peptidler içeren supernatant çıkarın ve istenirse gelecekteki deneyler için kaydedin.Beş kez ters çevirerek yıkamak ve karıştırmak için boncuklar soğuk 1X immünafinitasyon arınma tampon bir mililitre ekleyin. 2,000 kez g'de 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede dön. İmmünafinite saflaştırma solüsyonunu aspire edin ve immünafinitasyon yıkama yıkayın adım ını bir kez daha tekrarlayın.Sonra boncuksoğuk HPLC su bir mililitre ekleyin ve beş kez ters çevirerek karıştırın. 2,000 kez g'de 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede dön. Su aspire ve su yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın.Tüpün altında kalan suyu toplamak için 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 2,000 kez g'de ek bir süre döndürün. Düz uçlu jel yükleme ipuçları ile, toplanan herhangi bir ekstra su kapalı aspire. Boncuklar aspirating önlemek için dikkatli olun.Boncuklara suya 55 mikrolitre %0.15 trifloroasetik asit ekleyin. Bazen karıştırmak için tüpün altına dokunarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca boncuk kuluçka. Minyatür bir santrifüj içinde 30 saniye boyunca oda sıcaklığında boncuk spin.Yeni bir tüp içine eluted peptidler aktarmak için düz uçlu jel yükleme ucu kullanın. Boncuklara suya %0,15 trifloroasetik asit 45 mikrolitre ekleyin. Zaman zaman karıştırmak için tüpün altına dokunarak oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.Minyatür santrifüj de 30 saniye boyunca oda sıcaklığında boncuk spin. Düz uçlu jel yükleme ucu kullanarak ikinci elüasyonu çıkarın ve ilk elution ile birleştirin. Üzerinde taşıyan boncukları peletlemek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 12, 000 kez g'de kombine eluted peptidleri döndürün.Peptit numune solüsyonunu yeni bir 500 mikrolitrelik tüpe aktarın. Zenginleştirilmiş peptit karışımlarını C18 ön kolon çipine yüklemek için yükleme yöntemini oluşturun ve 10 dakika boyunca dakikada iki mikrolitrede a fazı ile yıkayarak peptidleri tekrar tuzdan arındırın. Peptitler analitik bir kolona aktarılır ve dakikada 300 nanolitre lik bir akış hızıyla, A ve B.Özellikle mobil faza göre %5 mobil faz B'den %35 mobil faz B'ye kadar doğrusal bir degrade kullanın.Daha sonra, mobil B fazını beş dakika içinde %80'e rampalayın ve 25 dakikalık bir yeniden dengeleme için %5 B'ye dönmeden önce sekiz dakika boyunca %80 B'de tutun. Ardından, veribağımlı edinme için bir MS enstrüman yöntemi oluşturun. Deney için, Ms1 öncül iyon tonu'nun M/Z 400'den 1,500'e ayarla.Süreyi 120 dakika olarak ayarlayın. Bir IDA denemesi oluşturun ve Tamam'ı tıklatın. Geçiş ölçütleri sekmesinde, saniyede iki ila beş ila 200 arasında yüklü durumların iyonları için MS/MS taramalarını tetiklemek için yoğunluk eşiğini ayarlayın. Öncül iyonların dinamik dışlanmasını 60 saniyeye ayarlayın.İkinci deneme için MS/MS ürün iyonu tonu,M2 100 ile 1, 500 arasında MS2 tarar. Parametreleri tıklatın ve çarpışma enerjisi beş e yayMak ayarlayın ve yüksek duyarlılık ürün iyon ton modunu seçin. Son olarak, örneği otoörnekleyiciye yerleştirin.Örnek sırayı gönderin ve veri bağımsız edinme için bir MS enstrüman yöntemi oluşturma ve iki enstrüman tarası deneyi tanımlama lc-MS/MS edinme yöntemlerini başlatın. 400 ile 1, 250 kütle arasında MS1 öncül iyon taramaları gerçekleştirin ve süreyi 120 dakikaya ayarlayın. Çarpışma enerjisinin 10'a ve birikim süresini 45 milisaniyeye ayarlayın ve ardından yüksek hassasiyetli ürün iyon tonu modunu seçin.Ardından, SWATH edinme pencerelerini yönteme doldurmak için 64 değişken pencere DIA SWATH edinme düzenini içeren bir metin dosyası içe aktarın. Bu satın alma şemasında, şarj ve genişlik için beş ila 90 kütle arasında değişen değişken pencereler 400 ila 1, 250 kütle nin tam kütle aralığında her biri 45 milisaniyelik birikim süresine sahip toplam 64 SWATH segmenti ile şarj etmek için artımlı adımlarla geçirilir. MS1 birikim süresini 0,25 saniyeye ayarlayın.Birlikte, MS1 taraması ve 64 MS2 taramaları şimdi 3,2 saniye toplam çevrim süresi vermelidir. Bu çalışmada, deneysel sonuçlar PTM çapraz konuşma tespit ve değerlendirme olasılığını belgelenmiştir. Bu tablo, iş akışının zaman çizelgesini ve gerekli numune ve protein miktarlarını gösterir.Tek pot yöntemi bu alternatif yöntemlerin yarısı kadar ve yarım örnek sayısı ile yapılabilir. Modifiye peptid alanları için ortalama varyasyon katsayısı tek pot yönteminde tek PTM ve seri PTM zenginleştirme daha düşüktü. Tek potluk PTM ve tek PTM zenginleştirme yöntemleri karşılaştırırken, iki değişiklik için site düzeyinde nicelik korelasyonları arasında kayda değer bir fark yoktu.Bu şekil, başarılı bir zenginleştirmeden elde edilen verileri görüntüler ve PTM çapraz konuşma görselleştiren birden fazla ve farklı asil değişiklikler içeren bir peptid için bir örnek göstermektedir. Bir lisin kalıntısı üzerinde bir peptit asetillenmiş ve diğerinde sükse lenmiş, burada ise aynı peptid her iki lizinde de sükse edilmiş. Bu, aynı lizin kalıntısının her iki aylasiyon grubuyla da değiştirilebilen ibaratede olabileceğini ve o bölgede çapraz konuşma olasılığı olduğunu göstermektedir.Her numunenin aynı miktarda boncuk içerdiğinden emin olmak ve peptid bağ boncuklarını yıkarken boncukların hiçbirinin kazara aspire edilmemesini sağlamak önemlidir. Spectronaut gibi yazılım araçlarında kütle spektrometresi tabanlı profil oluşturma ve veri analizi, PtM'lerin site lokalizasyonunu belirlemek, ölçmek ve gerçekleştirmek için bu yordamı izleyerek gerçekleştirilir. Eşzamanlı PTM zenginleştirme ile birlikte bu veri bağımsız satın alma iş akışı daha verimli PTM çapraz konuşma değerlendirmek ve PTM sinyal alaka daha iyi anlayışlar sağlamak için yollar açacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...