Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

نشكر فريق كورتيفا للدفيئة على توفير آذان غير ناضجة للذرة ، ومختبر إعداد ية وسائل الإعلام Corteva لتقديم المساعدة في صنع وسائل الإعلام ، ونينغ وانغ من كورتيفا للمساعدة في بناء Agrobacterium ، وكيونسوب لي من جامعة ولاية أيوا للمساعدة. تم دعم هذا المشروع جزئيًا من قبل برنامج أبحاث الجينوم النباتي للمؤسسة العلمية الوطنية ، ومنحة 1725122 و 1917138 إلى K.W.، ومن قبل برنامج التدريب البحثي للبحوث النباتية التنبؤية (منحة مؤسسة العلوم الوطنية DGE-1545453) إلى J.Z.، من قبل مشروع USDA NIFA Hatch #IOW04341، من قبل صناديق ولاية أيوا، ومركز الهندسة الحيوية للمحاصيل التابع لجامعة ولاية أيوا.

<ol>
	<li>Zhao, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+genetic+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens+in+maize.">High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.</a> Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).</li><li>Green, C. E., Phillips, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+regeneration+from+tissue+cultures+of+maize.">Plant regeneration from tissue cultures of maize.</a> Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).</li><li>Ji, Q., Xu, X., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+major+cereal+crops.">Genetic transformation of major cereal crops.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).</li><li>Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+(Zea+mays,+L).">Maize (Zea mays, L).</a> Agrobacterium Protocols. , 101-117 (2015).</li><li>Frame, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Agrobacterium-mediated+transformation+of+three+maize+inbred+lines+using+MS+salts.">Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts.</a> Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenic+regulators+Baby+boom+and+Wuschel+improve+monocot+transformation.">Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation.</a> The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotypes+independent+maize+transformation+via+direct+somatic+embryogenesis.">Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).</li><li>Boutilier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+BABY+BOOM+triggers+a+conversion+from+vegetative+to+embryonic+growth.">Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth.</a> The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).</li><li>Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+promotes+vegetative-to-embryonic+transition+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).</li><li>Jones, T. J., Kumar, S., Barone, P., Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+using+the+morphogenic+genes+Baby+Boom+and+Wuschel2.">Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2.</a> Transgenic Plants. , 81-93 (2019).</li><li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ternary+vector+system+for+Agrobacterium-mediated+rapid+maize+transformation.">An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation.</a> Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+acetolactate+synthase+gene+is+an+efficient+in+vitro+selectable+marker+for+the+genetic+transformation+of+Brassica+juncea+(Oilseed+Mustard).">Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard).</a> Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).</li><li>Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L., Gutteridge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+98140+corn+with+gat4621+and+hra+transgenes+to+glyphosate+and+ALS-inhibiting+herbicides.">Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides.</a> Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).</li><li>An, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+3'+control+region+of+the+potato+wound-inducible+proteinase+inhibitor+II+gene.">Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.</a> The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+nonbioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).</li><li>Passarinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Genes+Provide+Diverse+Entry+Points+into+Cell+Proliferation+and+Cell+Growth+Pathways.">Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).</li><li>Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+plant+terminator+sequences.">Novel plant terminator sequences.</a> Patent Number US2014/0130205. , (2014).</li><li>Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+is+required+for+shoot+and+floral+meristem+integrity+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.</a> Development. 122 (1), 87-96 (1996).</li><li>Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zm-AXIG1-specific+polynucleotides+and+methods+of+use.">Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use.</a> Patent Number WO2002006499. , (2002).</li><li>Hershey, H. P., Stoner, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNA+clones+for+RNA+species+induced+by+substituted+benzenesulfonamides+in+corn.">Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn.</a> Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).</li><li>Abremski, K., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+P1+site-specific+recombination.+Purification+and+properties+of+the+Cre+recombinase+protein.">Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).</li><li>Sun, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Function+Analysis+of+Small+Heat+Shock+Protein+Gene+ZmHSP17.7+from+Maize.">Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize.</a> ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+ColEl+as+a+molecular+vehicle+for+cloning+and+amplification+of+DNA.">Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).</li><li>Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn21,+flagship+of+the+floating+genome.">Transposon Tn21, flagship of the floating genome.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).</li><li>Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+sequence+determination+of+the+replicator+region+in+the+hairy-root-inducing+plasmid+pRiA+4b.">Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b.</a> Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).</li></ol>

أليسيا ماسترز، وليام غوردون كام، وتود جونز هم من موظفي Corteva Agriscience التي زودت البروتوكول وآذان الذرة من B73، Mo17، وW22 المستخدمة في هذه المقالة. المؤلفين Minjeong كانغ، مورغان ماكاو، جاكوب زوبريست، وكان وانغ ليس لديهم ما يكشف.

البروتوكولات التقليدية لتحويل الذرة تتبع نموذج عزل الأجنة الزيجوتية غير الناضجة لإنتاج أنسجة الكالوس المعدلة وراثيا، والتي يتم تجديدها في النباتات الخصبة4،6. في حين أن هذا فعال ، يمكن أن تكون البروتوكولات القائمة على الكالوس مضيعة للوقت ، وغالبًا ما يستغرق الأمر ما يصل إلى 3 أشهر حتى تنتج عملية زراعة الأنسجة النباتات. ما يجعل الأسلوب المعروض هنا مهمًا هو أنه خالٍ من الكالوس وفعال وسريع ويسمح بتجديد نباتات T0 في نصف الإطار الزمني تقريبًا. كما يبدو أن أقل اعتمادا على النمط الجيني، وبالتالي يمكن أن تكون فعالة لمعظم inbreds المتاحة للجمهور8،11.
وفي حين ينبغي اتباع جميع الخطوات بفعالية، فإن الإعداد الصحيح لوسائط الإعلام للنمو أمر حتمي. يجب إضافة مكونات وسائط النمو في المراحل الصحيحة، سواء قبل الأوتوكلاف أو ما بعد هُنا، لضمان أن تُستلم المواد النباتية التركيز المناسب للمواد الكيميائية. وهذا يضمن أن المركبات الحساسة مثل المضادات الحيوية لا تنهار. ومن المهم أيضا أن توضع المواد النباتية على وسط النمو الصحيح في كل مرحلة، كما هو مبين في البروتوكول. عدم وضع المواد على متوسط النمو السليم يمكن أن يؤدي إلى الموت المادي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تجنب وضع عدد كبير جدًا من الأجنة أو الأنسجة النامية على لوحات. في حين أن وضع ضعف عدد قطع الأنسجة قد يوفر تكلفة المواد الكيميائية وأطباق بيتري (وحتى مساحة الحاضنة) ، يمكن أن يمنع نمو الأنسجة في الأطباق المكتظة بشكل خطير. أثناء إجراء العدوى ، يجب التأكد من أن الكثافة البصرية لتعليق Agrobacterium مناسبة. إذا كانت كثافة التعليق البكتيري منخفضة للغاية، فقد لا تحدث عدوى مناسبة.
إن جودة مواد البدء ضرورية للنجاح في بروتوكولات التحويل. يجب أن تكون الأذنالمستخدمة في تشريح الأجنة صحية، مما يعني أن النبات الذي ينتجها صحي. كما يجب أن تمتلك مجموعة بذور كافية وأن تكون خالية من الآفات والأمراض. أيضا، لا ينبغي أن تستخدم Agrobacterium القديمة. يجب ألا يزيد عمر لوحة "الأم" عن أسبوعين. بعد هذه النقطة ، يجب أن تكون لوحة "الأم" الجديدة مخطوطة لبدء تجارب جديدة.
في حين تم إظهار هذا الأسلوب أن تكون أقل اعتماداً على النمط الجيني، فإنه لا يمكن افتراض أن كافة الأسطر ستكون ناجحة بنفس القدر. لا يزال هناك اختلاف بين الخطوط وكذلك الاختلافات في النجاح على أساس البناء المستخدم. كما أن التغير بين الأذنو الأذن والأذن أمر لا مفر منه عند العمل مع أجنة غير ناضجة، لذا من الناحية المثالية يجب أن تستخدم التجارب آذانًا متعددة لحساب ذلك. في هذا العمل ، كان أداء W22 الأصيل هو الأفضل ، مع تردد تحويل يُبعد هـو 14 ٪، يليه B73 و Mo17 (4٪ لكل منهما). وذكر لوي وآخرون8 باستخدام بروتوكول QuickCorn لتحويل B73 و Mo17. في هذا العمل، تراوحت ترددات التحويل بين 9% -50% لـ B73 و15%-35% لـ Mo17.
ويمكن أن تعزى إحدى الاحتمالات لترددات التحويل المنخفضة لـ B73 و Mo17 الملحوظة في هذا العمل إلى التقلبات الموسمية في نوعية الأذن. الفرق الآخر بين هذا العمل وعمل لوي وآخرون8 هو أن بنيات ناقلات مختلفة استخدمت هنا. في عمل لوي، لم تتم إزالة الجينات المورجينية من النباتات المتحولة، بل تم إسكاتها تنموياً في المراحل اللاحقة. في هذا العمل ، تمت إزالة الجينات المورفولوجية بعد 8 أيام من العدوى. من الممكن أن B73 و Mo17 قد تحتاج إلى وجود أطول من Bbm / Wus2 لتطوير الأجنة الجسدية.
باستخدام هذه الطريقة ، هناك إمكانية للحصول على نباتات الهروب غير المعدلة وراثيا ، والغرز متعددة الأبعاد ، والجينات المتحولة غير المهورة. لن يكون لهذه النباتات نمط ظاهري مختلف بشكل ملحوظ ، لذلك يلزم الكشف عن طريق PCR لتحديد ما إذا كان النبات معدل وراثيا. ولتحقيق ذلك، يمكن استخدام أجهزة تحديد أولي ة لـ PCR داخل المنطقة المنتاستئصال والتمهيديات المحيطة بالمنطقة المنتاستئصالة. كما يمكن أن تنتج التحولات المستقلة المتعددة نباتات من نفس الجنين غير الناضج، مما يجعل تحديد معدل الاسترداد المتحول المستقل الكلي أمرًا صعبًا. كان معيارنا هو حساب معدل التحول على أساس أخذ عينات من نبات واحد من كل جنين غير ناضج أنتج النباتات وقسمة هذا على عدد الأجنة المصابة. من شبه المؤكد أن هذه الطريقة تقلل من العدد الفعلي للأحداث المستقلة التي تم استردادها كزارع. ويتطلب التمييز بين الأحداث المستقلة من نفس الجنين تسلسل المناطق الحدودية حول الجينات المتحولة، وسيكون ذلك مكلفا ً للغاية ويستغرق وقتاً طويلاً بالنسبة لمعظم التطبيقات؛ على الرغم من ذلك، قد تكون هناك حالات تكون فيها هذه البيانات مفيدة.
وقد ثبت أن هذه الطريقة من التحول زراعة الأنسجة لتكون فعالة جدا، ولكن لا يزال يمكن أن تحدث مشاكل. وإذا كانت المواد النباتية لا تستجيب، فمن الممكن أن تكون هناك مشكلة في الخط الأصيل الخاص، مما يشير إلى أن متغيرات مثل تكوين وسائط النمو وتوقيت الاستزراع الفرعي تتطلب تعديلات. متغير آخر هو تصميم متجه السليم والبناء الدقيق للمتجه ، إذا تم تغيير المتجه الأصلي. يمكن أن يكون هناك أيضا مشاكل مع حساسية imazapyr، وبعض الخطوط هي أكثر حساسية من غيرها، وتركيز imazapyr قد تحتاج إلى تعديل لتحقيق النباتات التي تم تحويلها بنجاح.
وعلى مدى السنوات الثلاثين الماضية، تغيرت وأحرزت بروتوكولات زراعة أنسجة الذرة وتحويلها تقدما؛ ويعتقد أن هذا البروتوكول تقصير سوف تعزز هذا التقدم. هذه الطريقة فعالة للإعدادات الأكاديمية لأنها أقل استهلاكًا للوقت من الطرق التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يتطلب مشغلين مدربين تدريبا عاليا، مما يجعله أكثر قابلية للتوزيع على نطاق واسع بالمقارنة مع الأساليب التقليدية. في المستقبل ، يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع التكنولوجيات الجديدة مثل هندسة الجينوم.

التحول هو أداة أساسية لتقييم التعبير الجيني الأجنبي في الذرة وإنتاج خطوط الذرة المعدلة وراثيا لأغراض البحث والأغراض التجارية على حد سواء. الوصول إلى التحول الإنتاجية العالية يمكن أن يسهل الحاجة المتزايدة للذرة الجزيئية ودراسات البيولوجيا الخلوية1. والقدرة على تحويل أنواع المحاصيل وراثيا أمر حيوي للمختبرات العامة والخاصة على حد سواء. وهذا يسمح لكل من الفهم الأساسي لآليات تنظيم الجينات وكذلك تحسين المحاصيل على نطاق عالمي لدعم السكان المتزايدين باستمرار.
اكتشاف أن الأجنة غير ناضجة من الذرة يمكن استخدامها لإنتاج الكالوس regenerable نشأت في عام 19752. منذ هذا الوحي ، تطلبت معظم بروتوكولات تحويل الذرة القابلة للتوسع تشكيل واختيار callus قبل التجديد3. أثناء عملية التحول الجيني، يتم استزراع الأجنة غير الناضجة المصابة بالأجنةالزراعية أو اللاليستية الغير ناضجة على الوسائط للتحريض الجنيني على الكاموس. ثم يتم استزراع calli المستحث على وسائل الإعلام الانتقائية (على سبيل المثال ، التي تحتوي على مبيد أعشاب) بحيث تكون قطع الكالوس المتحولة فقط قادرة على البقاء على قيد الحياة. هذه المقاومة للمبيدات الأعشاب كالي المعدلة وراثيا المفترضة هي يستكثر وتجدد في النباتات. في حين أن هذه الطريقة فعالة ، إلا أن العملية طويلة وكثيفة العمالة ، ويمكن أن يستغرق الأمر أكثر من 3 أشهر لإكمال4. والأهم من ذلك، أن بروتوكولات تحويل الذرة التقليدية تمتلك قيدًا أكبر بكثير،أي أنه لا يمكن تحويل سوى عدد محدود من الأنماط الجينية للذرة 5و6.
لوي وآخرون7,8 ذكرت سابقا "QuickCorn" طريقة التحول التي خفضت ليس فقط إلى حد كبير مدة عملية التحول ولكن أيضا توسيع قائمة الأنماط الجينية القابلة للتحويل. طريقة QuickCorn يستخدم تقويم العظام الذرة(Zm-Bbm وZm-Wus2)من عوامل النسخ Arabidopsis BABY BOOM (BBM)9 وWUSCHEL (WUS)10. عندما أدرجت في نظام ناقلات التحول، هذه الجينات تعمل بشكل تآزري لتحفيز النمو الجنيني7.
ويستند بروتوكول QuickCorn الموصوفة في هذا العمل على البروتوكول في جونز وآخرون11، الذي كان تحسينا آخر للطريقة التي ذكرتها لوي وآخرون7،8. في هذه الدراسة ، سلالة Agrobacterium LBA4404 (Thy-) التي تؤوي ناقل ثنائي بناء PHP81430(الشكل 1)والتبعية plasmid PHP7153912 وتستخدم للتحول. يحتوي T-DNA من PHP81430 على المكونات الجزيئية التالية. (1) التحول الانتقائية علامة الجين Hra التعبير كاسيت. الذرة Hra (Zm-Hra)الجين هو تعديل الجين acetolactase (ALS) التي تتحمل مبيدات الأعشاب ALS المثبطة مثل sulfonylureas وimidazolinones13،14. وينظم الجين Zm-Hra من قبل المروج ALS الذرة الرفيعة8 ومثبط البروتينات البطاطس الثاني(دبوسالثاني) المنهي15. يحتوي T-DNA أيضا (2) كاسيت التعبير تمتلك التحول علامة للشاشة الجينات ZsGreen. وينظم هذا الجين البروتين الفلورسنت الأخضر ZsGreen من زوانثوس sp. الشعاب المرجانية16 من قبل مروج في بيهوم أوبيكيتين / intron والأرز ubiquitin المنهي.
بالإضافة إلى ذلك، يحتوي T-DNA على (3) الجين المورجينيجين Bbm كاسيت التعبير. BBM هو عامل النسخ المرتبطة نمو الجنين9،17. وينظم BBM من قبل الذرة فوسفوليبيد تورفيز البروتين(Pltp)المروج8 والأرز T28 المنهي18. Zm-Pltp هو جين مع تعبير قوي في ظهارة scutellar الجنين ، والشعر الحريري ، والخلايا الفرعية ورقة (يحيط خلايا الحرس) ، وانخفاض التعبير في الأعضاء التناسلية ، وليس التعبير في جذور8. كما أنه يحتوي على (4) الجين morphogenic Wus2 كاسيت التعبير. Wus2 هو آخر عامل النسخ المرتبطة بالحفاظ على meristem apical19. Zm-Wus2 تحت سيطرة مروج الذرة auxin-inducible(Zm-Axig1)20 والذرة In2-1 المنهي21. وأخيرا، يحتوي الحمض النووي T(5) على الكري- نظام إعادةالتركيب. الجين recombinase الكريات 22 تحت سيطرة الذرة الحرارة صدمة البروتين 17.7 (Hsp17.7)23 المروج والبطاطا دبوسالثاني المنهي. موقعين loxP (في نفس الاتجاه)24 الجناح أربعة أشرطة التعبير الجيني بما في ذلك ZsGreen، cre، Bbm وWus2.
ولأن وجود الجينات المورجينية غير مرغوب فيه لنضج النبات وذرية لاحقة، تم بناء نظام إعادة تركيب الكري-لوكسب الناجم عن الحرارة في الحمض النووي T لإزالة الجينات المورجينية من جينوم الذرة للسماح بتجديد الكالوس الطبيعي وتطوير النبات. عند المعالجة الحرارية ، يزيل تعبير بروتين CRE جميع الجينات المتحولة باستثناء جين اختيار Hra. يجب أن تكون التحويلات الناجحة مقاومة لمبيدات الأعشاب ولكن ZsGreen-negative. لزيادة تعزيز وتيرة التحول ، وسلالة Agrobacterium تؤوي أيضا بلازميد التبعي إضافية (PHP71539) التي لديها نسخ إضافية من الفوعة Agrobacterium (فير)الجينات12.
تختلف طريقة QuickCorn عن بروتوكولات تحويل الذرة التقليدية ، لأنها لا تنطوي على خطوة التعريفي الكالوس أثناء التحويل. خلال الأسبوع الأول بعد الإصابة بالبكتيريا الزراعية، تتطور الأجنة الجسدية على ظهارة scutellar للأجنة غير الناضجة المصابة. ثم يتم نقل الأجنة إلى وسط مع الهرمونات التي تشجع نضوج الأجنة وتشكيل تبادل لاطلاق النار. نقل سريع للأجنة الجسدية على النضج / اطلاق النار تشكيل المتوسطة يتخطى مرحلة كالوس التقليدية المستخدمة سابقا لتحويل الذرة ويسمح التوليد المباشر للنباتات T08. بالمقارنة مع أساليب تحويل الذرة المنشورة سابقا6، فإن طريقة QuickCorn أسرع وأكثر كفاءة وأقل اعتمادًا على النمط الجيني. باستخدام هذه الطريقة، عادة ما تكون النباتات المتجذرة جاهزة للنقل إلى التربة في غضون 5-7 أسابيع فقط، بدلاً من الأشهر الثلاثة أو أكثر التي تتطلبها البروتوكولات التقليدية. الغرض من هذه المقالة هو تقديم وصف متعمق وبيان توضيحي للطريقة ، مما يسمح للتكرار بشكل أسهل في بيئة المختبر الموجودة عادة في معظم المؤسسات الأكاديمية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

أظهرت هنا هو بروتوكول مفصل للتحول الوراثي Agrobacteriumبوساطة من خطوط الذرة الأصيلة باستخدام الجينات المورفيجينية طفرة بيبي (Bbm) وWuschel2 (Wus2). وينظم BBM من قبل الذرة الفوسفوليبيد المنتقلة جين(Pltp)المروج، وWus2 تحت سيطرة الذرة auxin-inducible(Axig1)المروج. سلالة Agrobacterium تحمل هذه الجينات المورفولوجية على نقل الحمض النووي (T-DNA) ونسخ إضافية من الفوعة الزراعية (vir)وتستخدم لتصيب الذرة الأجنة غير ناضجة explants. تتشكل الأجنة الجسدية على الكوتيلا من الأجنة المصابة ويمكن اختيارها عن طريق مقاومة مبيدات الأعشاب وتنبت في النباتات. يسمح نظام إعادة التركيب /اللوكسP المنشط بالحرارة المدمج في بناء الحمض النووي بإزالة الجينات المورجينية من جينوم الذرة خلال مرحلة مبكرة من عملية التحول. يمكن تحقيق ترددات تحويل ية تبلغ حوالي 14% و4% و4% (أعداد الأحداث المعدلة وراثياً المستقلة لكل 100 جنين مصاب) لـ W22 وB73 وMo17 على التوالي باستخدام هذا البروتوكول.

يظهر هنا بروتوكول خطوة بخطوة للتحول الوراثي بوساطة زراعيةلثلاثة خطوط ذرة عامة أصيلة (B73 و Mo17 و W22) التي كانت مهمة في مجال علم الوراثة الذرة. لم يكن من الممكن تحقيق التحول في الخطوط الثلاثة الأصيلة باستخدام بروتوكولات تحويل الذرة التقليدية5. ويبين الشكل 1 والشكل 2 مواد البناء والبداية، على التوالي، المستخدمة هنا. يتم حصاد الأذنين بشكل عام بعد 9-12 يومًا من التلقيح. IZEs مع أطوال تتراوح بين 1.5-2.0 ملم هي أفضل explants للتحول لهذا البروتوكول(الشكل 2).
بعد ثمانية أيام من العدوى ، تم تصور ZsGreen- التعبير عن الأجنة الجسدية تحت قناة GFP من المجهر الفلوري(الشكل 3). وخضعت هذه الهيئة للمعالجة الحرارية بعد 8 أيام من الإصابة (الخطوتان 5-1 و5-2). أدى هذا العلاج التعبير عن ReRE recombinase التي استأصلت Bbm، Wus2، cre، وأشرطة التعبير ZsGreen محاطة بين موقعي loxP (الشكل 1). ثم تم استزراع الأنسجة المعالجة بالحرارة على متوسط تكوين التصوير الذي يحتوي على imazapyr مبيد الأعشاب لاختيار الأنسجة المتحولة بعد إزالة الجينات المورجينية.
لوحظ تتكاثر الأنسجة مع الأجنة الناضجة أو براعم تبادل لاطلاق النار التي كانت مقاومة لimazapyr حوالي 3-4 أسابيع بعد العدوى(الشكل 4). كانت بعض الأنسجة المقاومة للإيمازابير سلبية بالنسبة لـ ZsGreen ، مما يشير إلى أن الختان بوساطة الكريةقد حدث على الأرجح في هذه الأنسجة(الشكل 4). بعد أن تم نقل الأنسجة إلى تأصيل حضانة متوسطة وخفيفة ، بدأت البراعم في التطور(الشكل 5). تم حصاد براعم النمو صحية وقوية مع جذور متطورة(الشكل 5). يبدو أن بعض الأنسجة لديها براعم متعددة(الشكل 5E ، F ، G). قد يكون هذا النوع من "عشبي" regenerant بسبب النباتات الكلونية لها أنماط تكامل متحولة متطابقة. التحليل البيولوجي الجزيئي مطلوب للنمط الجيني لهذه النباتات.
واستجابت جميع الخطوط العامة الأصيلة الثلاثة بشكل جيد باستخدام هذا البروتوكول وكذلك البناء المستخدم في هذا العمل. أنتجت W22 أعلى تردد من البراعم المقاومة للإيمازابير ، مع تردد حوالي 14٪ (حوالي 14 يطلق النار المعدلة وراثيا لكل 100 الأجنة غير ناضجة المصابة). أنتجت كل من B73 و Mo17 حوالي 4٪ براعم معدلة وراثيا. وتشير هذه الترددات إلى جميع البراعم المحورة وراثياً، بما في ذلك كلا النباتين اللذين يحملان الجينات المورجينية والنباتات ذات الجين المورجيني الذي أزيل عن طريق الختان بوساطة CRE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لمنطقة T-DNA من البلازميد الثنائية PHP81430. RB = الحدود اليمنى T-DNA; loxP = CRE إعادة الدمج الهدف الموقع؛ Axig1الموالية:Wus2 = الذرة auxin- المروج inducible(Zm-Axig1)+ Zm-Wus2 + الذرة In2-1 المنهي؛ Pltppro:Zm-Bbm = بروتين فوسفوليبيد الذرة(Zm-Pltp)المروج + Zm-Bbm + الأرز T28 المنهي(Os-T28)؛ Hsppro:cre = بروتين صدمة حرارة الذرة 17.7 المروج(Zm-Hsp17.7)+ الكريات المؤن recombinase + مثبط البروتينات البطاطس الثاني(pinII)المنهي؛ يوبيبرو:ZsGreen = مروج أوبيكيتين الذرة الرفيعة / intron(Sb-Ubi)+ البروتين الفلوري الأخضر ZsGreen الجينات + الأرز ubiquitin المنهي(Os-Ubi)؛ Hra كاسيت = الذرة الرفيعة acetolactase synthase(Sb-Als)المروج + الذرة Hra(Zm-Hra)الجينات + pinII المنهي؛ LB = يسار الحدود T-DNA; colE1، تكرار أصل بلازميد ColE125؛ المواصفاتR = spectinomycin الجينات المقاومة aadA1 من Tn21 لاختيار البكتيريا26؛ Rep A, B, C = تكرار الأصل من pRiA4 من rhizogenes Agrobacterium27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> الشكل 2: مواد البدء. B73 آذان حصاد 12 يوما بعد التلقيح(A). الأجنة غير الناضجة من B73(B)، Mo17(C)، وW22(D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> الشكل 3: تطور الأنسجة على راحة متوسطة 1 أسبوع بعد الإصابة. الأجنة (8 أيام بعد العدوى) تحت مجهر الفلورية (مرشح GFP) تظهر GFP تعبر عن الأجنة الجسدية من Mo17(A)و W22(B). تطوير الأنسجة (B73) تحت الحقل الساطع(C)ومرشح GFP(D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> الشكل 4: تطوير الأنسجة على متوسط النضج مع الاختيار. لوحة نضوج W22(A). تطوير الأنسجة (Mo17، 15 يوما بعد العدوى) تحت حقل مشرق(B)ومرشح GFP(C). تطوير الأنسجة (Mo17، 28 يوما بعد العدوى) تحت حقل مشرق(D)ومرشح GFP(E). تشير السهام إلى تجديد الأنسجة التي تفتقر إلى التعبير GFP ، مما يشير إلى استئصال جين ZsGreen بين مواقع loxP بعد نشاط بروتين CRE الناجم عن الحرارة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> الشكل 5: تطوير الأنسجة على تأصيل وسائل الإعلام. يطلق النار على W22 (أ) ، B73(B)، وMo17(C ، D). حدث مع يطلق النار على عدة (regenerants العشبية) من B73(E)وW22(F، G). يطلق النار مع جذور B73(H)وW22(أنا). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: المؤلفات الإعلامية لتحويل الذرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على اليمين للتحميل).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

يمكن استخدام الجينات المورجينية النباتية لتحسين التحول الوراثي للأنماط الجينية المتمردة. وصف هنا هو بروتوكول التحول الوراثي بوساطة Agrobacterium(QuickCorn) لثلاثة خطوط ذرة عامة هامة أصيلة.

البكتريا الزراعية-بوساطة تحويل الجنين غير الناضج من خطوط الذرة المستعبدة المستنعين باستخدام الجينات المورجينية

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

ولا يمكن تحويل معظم خطوط الذرة الأصيلة وراثيا باستخدام بروتوكولات التحول التقليدية. هنا، نحن وصف طريقة تحويل QuickCorn التي هي سريعة وأقل تعتمد على النمط الجيني. طريقة QuickCorn يستخدم عوامل النسخ الذرة بوم وWUSCHEL.عندما تدمج في نظام ناقلات التحول، تعمل هذه الجينات بشكل تآزري لتحفيز نمو الجنين. على عكس بروتوكولات تحويل الذرة التقليدية، لا تتضمن طريقة QuickCorn خطوة تحريضية أثناء التحول. تحتوي منطقة T-DNA للمتجه الثنائي المستخدم في عملنا على ثلاثة مكونات رئيسية، وهي جينات المورفوجين، ومورثات العلامات، ونظام إعادة التضمين.وقد أُدرج نظام إعادة الدمج الناجم عن الحرارة في الحمض النووي T-DNA لإزالة الجينات المورفوجينية من جينوم الذرة للسماح بتجديد اللقاش الطبيعي في تطوير النباتات. حوالي يومين إلى ثلاثة أيام بعد ظهور الحرير وإذا حبوب اللقاح سوف تكون متاحة في اليوم التالي، وقطع الحرير وقشر مع 70٪ من الايثانول معقمة مقص، ما يقرب من 2 1/2 سم تحت نهاية أوراق قشر، حيث تظهر الحرير، وتغطي الحرير مع كيس تبادل لاطلاق النار. بمجرد خروج النشثر من شرابة ، غطي شرابة بحقيبة شرابة ، ووضع مقطع ورق غير زلق في قاعدة الحقيبة حول الساق.في صباح اليوم التالي لوضع كيس شرابة، ثني بلطف النبات، والاستفادة من الحقيبة لتشجيع حبوب اللقاح ليتم الافراج عنهم. ثم إزالة كيس شرابة، وأضعاف الجزء العلوي من الحقيبة أكثر لمنع حبوب اللقاح من الهروب. لتللقي نبات المتلقي، وفضح الحرير، وصب حبوب اللقاح بسرعة من كيس شرابة على الحرير.تغطية الأذن الملقحة على الفور مع كيس شرابة، وتأمين قاعدة من الحقيبة حول ساق مع المواد الغذائية. للتحقق من حجم الجنين غير الناضج ، بعد تسعة إلى 12 يومًا من التلقيح ، اسحب القشرة برفق لفضح حبات الأذن في حوالي 1/3 إلى 1/4 من محيط الأذن وحوالي 1/3 من المسافة أسفل الأذن. استخدم مشرطًا لشريحة قبعة نواة واحدة تظهر مشابهة لغالبية حبات أخرى في الحجم واللون، واستخدم ملعقة مع مسطرة لاستخراج الجنين.ثم استخدم المسطرة أو الفرجار لقياس طول الجنين. في غضون يوم إلى أربعة أيام من الحصاد، وإزالة قشور والحرير من آذان حصادها، وإدراج مقبض مناسب في الجزء العلوي أو قاعدة كل أذن. غمر الأذنين في حاوية كبيرة من محلول تبييض التطهير في غطاء تدفق معقم مع مقبض تواجه ما يصل.بعد 20 دقيقة، شطف الأذنين ثلاث مرات مع حجم سخي من الماء المقطر العقيمة الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل قبل السماح للأذنين لتجف لعدة دقائق. بعد ذلك، قم بتعبئة أنبوب ميكروسنتر 2 ملليلتر لكل أذن مع 700A المتوسطة السائلة، واستخدام مشرط معقمة لإزالة أعلى واحد إلى ملليمترين من كل تاج نواة لفضح endosperm من الأذن. حدد مكان الجنين غير الناضج داخل النواة على الجانب الذي يواجه طرف الأذن، بالقرب من المرفق بالكوب.بالنسبة للمعالج العلوي والمشغلين باليد اليمنى ، بقية الأذن على طبق بيتري معقمة كبيرة ، وإدراج ملعقة صغيرة في endosperm في أبعد من برحام الجنين. التواء بلطف إلى أعلى لإزاحة endosperm وفضح الجنين، واستخدام ملعقة لوضع بعناية الجنين في أنبوب واحد من 700A المتوسطة السائلة. بالنسبة لمشغلي معالج القاعدة الذين يمسكون الأذن باليد اليسرى، أدخل ملعقة صغيرة في إندوسبيرم في أبعد من الجنين، وقم بالالتفاف بلطف للأعلى لإزاحة إندوسبيرم.لثقافة الأجنة في ثقافة تعليق Agrobacterium ، وجمع البكتيريا من لوحة عمل أعدت حديثا في 10 ملليلتر من 700A المتوسطة السائلة ، ودوامة لتعليق ثقافة البكتيريا تماما. قياس الكثافة البصرية في الطول الموجي من 550 نانومتر، وغسل الأجنة مع ملليلتر واحد من 700A المتوسطة الطازجة. اغمر الأجنة في ملليلتر واحد من تعليق Agrobacterium ، ودوة على إعداد منخفض لمدة 30 ثانية.تسوية الأجنة على مقاعد البدلاء مع الأنابيب في اتجاه أفقي لمدة خمس دقائق قبل نقل محتويات كاملة من كل أنبوب على لوحات فردية من 562V المشتركة زراعة المتوسطة. دوامة بلطف لوحات لتوزيع الأجنة بالتساوي، وpirate الزائدة تعليق Agrobacterium. توجيه الأجنة بعناية مع الجانب على شكل قبة تواجه، مع الحرص على تجنب إتلاف الأجنة.ثم ضع لوحات في صناديق بلاستيكية لاحتضان بين عشية وضحاها في 21 درجة مئوية في الظلام. في صباح اليوم التالي، نقل بعناية الأجنة المصابة على يستريح 605T المتوسطة، ووضع حوالي 30 الأجنة لكل لوحة، scutellum الجانب حتى، لاحتضان لمدة أربعة إلى 10 أيام في 26 درجة مئوية في الظلام. في حوالي سبعة أيام، يمكن ملاحظة تطور الجنين الجسدي على سطح scutellum zygotic.في نهاية فترة الراحة، ضع صندوق الأجنة في حاضنة 45 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 70٪، لمدة ساعتين، تليها حضانة لمدة ساعة إلى ساعتين عند 26 درجة مئوية في الظلام. في نهاية الحضانة، مكان 10 إلى 15 الأجنة غير ناضجة صدمت الحرارة على لوحات الفردية من اطلاق النار تشكيل المتوسطة تكملها 05 ملليغرام لكل لتر من imazapyr مبيدات الأعشاب كعامل انتقائي. قم بإزالة أي كوليوبtileز بعناية حسب الحاجة، وارجع الأجنة إلى الحاضنة المظلمة 26 درجة مئوية لمدة أسبوعين.في نهاية الحضانة، نقل حوالي ثماني قطع من الأنسجة لكل لوحة على تجذير لوحات متوسطة لاحتضان لمدة أسبوع إلى أسبوعين مع 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام عند 27 درجة مئوية. كما المزارعات تطوير، وضع واحدة أقوى بلانتليت تحتوي على كل من يطلق النار وجذور قوية على لوحات الفردية من المتوسط التأصيل تحت الضوء لمدة سبعة إلى 14 يوما آخر. السماح للبراعم التي لم يتم تطويرها بشكل كامل أن تكون محتضنة على نفس الوسيلة لمدة أسبوع إلى أسبوعين آخر حتى تكون جاهزة ليتم نقلها إلى التربة.كما يصبح النبات أكثر قوة، شطف الجذور مع مياه الصنبور لإزالة أجار. ثم زرع النباتات الفردية في الأواني ثلاثة بوصة تحتوي على الركيزة قبل ترطيب التربة في علبة مع ثقوب استنزاف، ووضع صينية في غرفة النمو مع أو بدون قبة رطوبة بلاستيكية. بعد 9 إلى 14 يومًا من نقل الوعاء ، زرع كل بلانتليت مع التربة في وعاء 1.5 جالون.إضافة الأسمدة التي تسيطر عليها الإفراج عن وعاء، والحفاظ على النباتات في الدفيئة. عندما تبدأ براعم الأذن في الظهور من المصنع، استخدم حقيبة تبادل لإطلاق النار شبه شفافة لتغطية البراعم بحيث يمكن ملاحظة الحرير الناشئ دون إزالة الحقيبة. ثم تلقيح النباتات في المرحلة المناسبة من التنمية كما هو موضح.وعادة ما يتم حصاد آذان الذرة بعد تسعة إلى 12 يوما من التلقيح. الأجنة غير الناضجة التي تتراوح أطوالها بين 1.5 و2 ملليمترات هي أفضل explants للتحول لهذا البروتوكول. بعد ثمانية أيام من العدوى، يمكن تصور الأجنة الجسدية التعبيرية ZsGreen بواسطة المجهر الفلوري.العلاج الحراري بعد ثمانية أيام من العدوى يدفع التعبير إعادة الكومبينيز cre، مما يؤدي إلى استئصال الجينات المورفوجين، cre، وZsGreen الشرائط التعبير يحيط بين موقعين loxP. بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من الثقافة على اطلاق النار تشكيل المتوسطة التي تحتوي على مبيد الأعشاب، وتكاثر الأنسجة مع الأجنة النضج أو تبادل لاطلاق النار براعم مقاومة لمبيد الأعشاب يمكن ملاحظتها. قد تكون بعض الأنسجة المقاومة لمبيد الأعشاب سلبية بالنسبة لZsGreen ، مما يشير إلى أن الختان بوساطة العقيد من المرجح أن يحدث في هذه الأنسجة.بعد نقل الأنسجة إلى تأصيل حضانة المتوسطة والخفيفة ، يمكن حصادها صحية ، قوية ، وبراعم النمو مع جذور متطورة. لاحظ أن بعض الأنسجة قد يبدو أن لديها براعم متعددة ربما بسبب النباتات التخفي وجود أنماط التكامل transgene متطابقة. ويمكن لطريقة QuickCorn أن تحسن إلى حد كبير كفاءة تحويل الذرة وتوسع قائمة الأنماط الجينية القابلة للتحويل.ويمكن أن يستنسخ البروتوكول بنجاح من قبل الباحثين الذين لا يقل تدريبهم عن تحويل الذرة. باستخدام طريقة QuickCorn ، يجب أن تكون النباتات المتجذرة جاهزة للانتقال إلى التربة في غضون خمسة إلى سبعة أسابيع فقط بعد يوم العدوى. انتبه إلى التركيبة المتوسطة وتوقيت الثقافات الفرعية ودرجة الحرارة وظروف الإضاءة.كما أن جودة مواد البدء ضرورية للتحول الناجح. المواد الكيميائية، ومحلول التبييض، ومبيد الأعشاب المستخدمة في هذا البروتوكول هي الخطر الحيوي. يرجى التأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء استخدامها.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

تقنية حقن الأجنة لتحرير الجينات في القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

قابلية النقل القابلة للتطوير لبروتوبلاستات ميزوفيل الذرة

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Advancing Gene Editing in Bamboo Leaves for Sustainable Plastic Alternatives (Video) | JoVE

في بلانتا التعبير الجيني وتحرير الجينات في أوراق الخيزران موسو

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

أغماد الذرة المنفصلة لتصوير الخلايا الحية للعدوى بمسببات أمراض الذرة الورقية الفطرية

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...