Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Nous remercions l’équipe de serre de Corteva d’avoir fourni des oreilles immatures au maïs, le laboratoire de préparation des médias de Corteva pour avoir fourni de l’aide pour la fabrication des médias, Ning Wang de Corteva pour son aide dans la construction d’Agrobacterium et Keunsub Lee de l’Université d’État de l’Iowa pour l’aide. Ce projet a été financé en partie par le National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 et 1917138 à K.W., par Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) à J.Z., par le projet usDA NIFA Hatch #IOW04341, par des fonds de l’État de l’Iowa, et par Crop Bioengineering Center de l’Université d’État de l’Iowa.

<ol>
	<li>Zhao, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+genetic+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens+in+maize.">High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.</a> Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).</li><li>Green, C. E., Phillips, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+regeneration+from+tissue+cultures+of+maize.">Plant regeneration from tissue cultures of maize.</a> Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).</li><li>Ji, Q., Xu, X., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+major+cereal+crops.">Genetic transformation of major cereal crops.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).</li><li>Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+(Zea+mays,+L).">Maize (Zea mays, L).</a> Agrobacterium Protocols. , 101-117 (2015).</li><li>Frame, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Agrobacterium-mediated+transformation+of+three+maize+inbred+lines+using+MS+salts.">Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts.</a> Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenic+regulators+Baby+boom+and+Wuschel+improve+monocot+transformation.">Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation.</a> The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotypes+independent+maize+transformation+via+direct+somatic+embryogenesis.">Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).</li><li>Boutilier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+BABY+BOOM+triggers+a+conversion+from+vegetative+to+embryonic+growth.">Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth.</a> The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).</li><li>Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+promotes+vegetative-to-embryonic+transition+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).</li><li>Jones, T. J., Kumar, S., Barone, P., Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+using+the+morphogenic+genes+Baby+Boom+and+Wuschel2.">Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2.</a> Transgenic Plants. , 81-93 (2019).</li><li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ternary+vector+system+for+Agrobacterium-mediated+rapid+maize+transformation.">An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation.</a> Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+acetolactate+synthase+gene+is+an+efficient+in+vitro+selectable+marker+for+the+genetic+transformation+of+Brassica+juncea+(Oilseed+Mustard).">Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard).</a> Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).</li><li>Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L., Gutteridge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+98140+corn+with+gat4621+and+hra+transgenes+to+glyphosate+and+ALS-inhibiting+herbicides.">Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides.</a> Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).</li><li>An, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+3'+control+region+of+the+potato+wound-inducible+proteinase+inhibitor+II+gene.">Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.</a> The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+nonbioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).</li><li>Passarinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Genes+Provide+Diverse+Entry+Points+into+Cell+Proliferation+and+Cell+Growth+Pathways.">Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).</li><li>Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+plant+terminator+sequences.">Novel plant terminator sequences.</a> Patent Number US2014/0130205. , (2014).</li><li>Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+is+required+for+shoot+and+floral+meristem+integrity+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.</a> Development. 122 (1), 87-96 (1996).</li><li>Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zm-AXIG1-specific+polynucleotides+and+methods+of+use.">Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use.</a> Patent Number WO2002006499. , (2002).</li><li>Hershey, H. P., Stoner, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNA+clones+for+RNA+species+induced+by+substituted+benzenesulfonamides+in+corn.">Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn.</a> Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).</li><li>Abremski, K., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+P1+site-specific+recombination.+Purification+and+properties+of+the+Cre+recombinase+protein.">Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).</li><li>Sun, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Function+Analysis+of+Small+Heat+Shock+Protein+Gene+ZmHSP17.7+from+Maize.">Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize.</a> ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+ColEl+as+a+molecular+vehicle+for+cloning+and+amplification+of+DNA.">Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).</li><li>Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn21,+flagship+of+the+floating+genome.">Transposon Tn21, flagship of the floating genome.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).</li><li>Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+sequence+determination+of+the+replicator+region+in+the+hairy-root-inducing+plasmid+pRiA+4b.">Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b.</a> Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).</li></ol>

Alicia Masters, William Gordon-Kamm et Todd Jones sont des employés de Corteva Agriscience qui ont fourni le protocole et les oreilles de maïs de B73, Mo17 et W22 utilisés dans cet article. Les auteurs Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist et Kan Wang n’ont rien à révéler.

Les protocoles traditionnels pour la transformation du maïs suivent le paradigme de l’isolation des embryons zygotiques immatures pour produire des tissus callus transgéniques, qui sont régénérés en plantes fertiles4,6. Bien que cela soit efficace, les protocoles à base de callus peuvent prendre beaucoup de temps, et il faut souvent jusqu’à 3 mois pour que le processus de culture tissulaire produise des plantes. Ce qui rend la méthode présentée ici significative, c’est qu’elle est sans callus, efficace, rapide, et permet la régénération des plantes T0 dans environ la moitié du temps. Il semble également être moins dépendant du génotype et peut donc être efficace pour la plupart des consanguins accessibles au public8,11.
Bien que toutes les étapes doivent être suivies efficacement, une préparation correcte des médias de croissance est impérative. Les composants des supports de croissance doivent être ajoutés aux étapes correctes, avant et après l’autoclave, pour s’assurer que le matériel végétal reçoit la bonne concentration de produits chimiques. Cela permettra de s’assurer que les composés sensibles comme les antibiotiques ne se décomposent pas. Il est également important que le matériel végétal soit placé sur le bon milieu de croissance à chaque étape, comme indiqué dans le protocole. Ne pas placer de matériel sur le bon milieu de croissance peut entraîner la mort matérielle. En outre, il faut éviter de placer trop d’embryons ou de développer des tissus sur des assiettes. Bien que le placement de deux fois plus de morceaux de tissu peut économiser le coût des produits chimiques et des plats Petri (et même l’espace incubateur), la croissance des tissus dans les plaques surpeuplées peut être sérieusement inhibée. Lors de l’exécution de l’infection, il faut s’assurer que la densité optique de la suspension Agrobacterium est appropriée. Si la densité de suspension bactérienne est trop faible, une infection appropriée peut ne pas se produire.
La qualité des matériaux de départ est essentielle au succès des protocoles de transformation. Les oreilles utilisées pour la dissection des embryons doivent être saines, ce qui signifie que la plante qui les produit est saine. Ils doivent également posséder un ensemble de semences adéquat et être exempts de ravageurs et de maladies. En outre, l’ancien Agrobacterium ne doit pas être utilisé. L’assiette « mère » ne doit pas avoir plus de 2 semaines. Après ce point, une nouvelle plaque de « mère » devrait être strié pour commencer de nouvelles expériences.
Bien qu’il ait été démontré que cette méthode dépend moins du génotype, on ne peut pas présumer que toutes les lignes seront également réussies. Il peut encore y avoir des variations entre les lignes ainsi que des différences de succès basées sur la construction utilisée. La variabilité de l’oreille à l’oreille est également inévitable lorsque l’on travaille avec des embryons immatures, donc idéalement, les expériences devraient utiliser plusieurs oreilles pour expliquer cela. Dans ce travail, la race W22 a obtenu les meilleurs résultats, avec une fréquence de transformation de plus de 14 %, suivie de B73 et Mo17 (4 % chacune). Lowe et coll.8 ont déclaré utiliser le protocole QuickCorn pour la transformation B73 et Mo17. Dans ce travail, les fréquences de transformation variaient de 9% à 50% pour le B73 et de 15%-35% pour le Mo17.
Une possibilité pour les fréquences de transformation inférieures pour B73 et Mo17 observées dans ce travail peut être attribuée à la fluctuation saisonnière de la qualité de l’oreille. Une autre différence entre ce travail et celui de Lowe et coll.8 est que différentes constructions vectorielles ont été utilisées ici. Dans les travaux de Lowe, les gènes morphogènes n’ont pas été retirés des plantes transformées, mais plutôt réduits au silence dans les derniers stades. Dans ce travail, les gènes morphogènes ont été enlevés 8 jours après l’infection. Il est possible que B73 et Mo17 aient besoin d’une plus longue présence de Bbm/Wus2 pour le développement d’embryons somatiques.
En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir des plantes d’évacuation non transgéniques, des insertions multimériques et des transgènes non-transgéniques. Ces plantes n’auront pas un phénotype sensiblement différent, de sorte que la détection par PCR est nécessaire pour déterminer si une plante est transgénique. Pour ce faire, les amorces PCR dans la région excisée et les amorces qui bordent la région excisée peuvent être utilisées. De multiples transformations indépendantes peuvent également produire des plantes à partir du même embryon immature, ce qui rend difficile la détermination du taux total de récupération des transformateurs indépendants. Notre norme a été de calculer un taux de transformation basé sur l’échantillonnage d’une plante à partir de chaque embryon immature qui a produit des plantes et de diviser par le nombre d’embryons infectés. Cette méthode sous-estime presque certainement le nombre réel d’événements indépendants récupérés sous forme de plantules. La discrimination entre les événements indépendants d’un même embryon nécessite le séquençage des régions frontalières autour des transgènes, ce qui sera prohibitif et long pour la plupart des applications; cependant, il peut y avoir des cas dans lesquels ces données sont utiles.
Cette méthode de transformation de la culture tissulaire s’est avérée très efficace, mais des problèmes peuvent encore se produire. Si le matériel végétal ne répond pas, il est possible qu’il y ait un problème avec la lignée consanguine particulière, ce qui suggère que des variables telles que la composition des médias de croissance et le moment de la subculturing nécessitent des ajustements. Une autre variable est la conception appropriée des vecteurs et la construction précise du vecteur, si le vecteur d’origine est modifié. Il peut également y avoir des problèmes avec la sensibilité à l’imazapyr, car certaines lignes sont plus sensibles que d’autres, et la concentration d’imazapyr peut avoir besoin d’être ajustée pour atteindre avec succès des plantes transformées.
Au cours des 30 dernières années, la culture des tissus de maïs et les protocoles de transformation ont changé et progressé; et on croit que ce protocole raccourci fera avancer cette progression. Cette méthode est efficace pour les milieux académiques parce qu’elle prend moins de temps que les méthodes traditionnelles. En outre, elle n’exige pas d’opérateurs hautement qualifiés, ce qui la rend plus favorable à une distribution généralisée par rapport aux méthodes traditionnelles. À l’avenir, cette méthode pourra être combinée avec de nouvelles technologies telles que l’ingénierie génomique.

La transformation est un outil de base pour évaluer l’expression des gènes étrangers dans le maïs et produire des lignées de maïs génétiquement modifiées à des fins de recherche et commerciales. L’accès à une transformation à haut débit peut faciliter le besoin accru d’études de biologie moléculaire et cellulaire du maïs1. La capacité de transformer génétiquement les espèces cultivées est vitale pour les laboratoires publics et privés. Cela permet à la fois une compréhension fondamentale des mécanismes de régulation des gènes ainsi que l’amélioration des cultures à l’échelle mondiale pour soutenir une population en croissance constante.
La découverte que des embryons immatures provenant du maïs pourraient être utilisés pour la production de callus régenerable a pris naissance en 19752. Depuis cette révélation, la plupart des protocoles évolutifs de transformation du maïs ont nécessité la formation et la sélection des calus avant la régénération3. Pendant le processus de transformation génétique, les embryons immatures infectés ou biolistic-bombardés d’Agrobacteriumsont cultivés sur des médias pour l’induction embryogénique de callus. Les calli induits sont ensuite cultivés sur des supports sélectifs (p. ex., contenant un herbicide) de sorte que seules les morceaux de callus transformés peuvent survivre. Ces calli transgéniques putatifs résistants aux herbicides sont en vrac et régénérés en plantes. Bien que cette méthode soit efficace, le processus est long et laborieux, et il peut prendre plus de 3 mois pour terminer4. Plus important encore, les protocoles conventionnels de transformation du maïs possèdent une limitation beaucoup plus grande, c’est-à-dire que seul un nombre limité de génotypes de maïs peuvent être transformés5,6.
Lowe et coll.7,8 ont déjà signalé une méthode de transformation « QuickCorn » qui a non seulement considérablement réduit la durée du processus de transformation, mais a également élargi la liste des génotypes transformables. La méthode QuickCorn utilise des orthologs de maïs (Zm-Bbm et Zm-Wus2) des facteurs de transcription d’Arabidopsis BABY BOOM (BBM)9 et WUSCHEL (WUS)10. Lorsqu’ils sont incorporés dans le système vectoriel de transformation, ces gènes travaillent en synergie pour stimuler la croissance embryonnaire7.
Le protocole QuickCorn décrit dans ce travail était basé sur le protocole dans Jones et al11, qui était une amélioration supplémentaire de la méthode rapportée par Lowe et al7,8. Dans la présente étude, une souche D’Agrobacterium LBA4404 (Thy-) hébergeant une construction vectorielle binaire PHP81430 (figure 1) et un plasmide accessoire PHP7153912 sont utilisés pour la transformation. L’ADN T de PHP81430 contient les composants moléculaires suivants. (1) La cassette d’expression sélective de gène de marqueur de transformation Hra. Le gène du maïs Hra (Zm-Hra) est un gène modifié de la synthase acétolactase (SLA) qui tolère les herbicides inhibiteurs de la SLA tels que les sulfonylurères et les imidazolinones13,14. Le gène Zm-Hra est régulé par le promoteur de sorgho ALS8 et inhibiteur de la protéase de pomme de terre II (pinII) terminateur15. Le T-ADN contient également (2) une cassette d’expression possédant le gène marqueur sérigraphiable de transformation ZsGreen. Ce gène de protéine fluorescente verte ZsGreen de Zoanthus sp. corail de récif16 est réglé par un promoteur d’ubiquitine de sorgho/intron et le terminateur d’ubiquitine de riz.
En outre, le T-ADN contient (3) le gène morphogénique Bbm expression cassette. Bbm est un facteur de transcription associé au développement de l’embryon9,17. Bbm est réglementé par la protéine de transfert phospholipide de maïs (Pltp) promoteur8 et riz T28 terminator18. Zm-Pltp est un gène avec une forte expression dans l’épithélium scutellar embryon, poils de soie, et les cellules subsidiaires de feuilles (flanking les cellules de garde), faible expression dans les organes reproducteurs, et aucune expression dans les racines8. Il contient également (4) le gène morphogénique Wus2 cassette d’expression. Wus2 est un autre facteur de transcription associé au maintien du mériistem apaïque19. Zm-Wus2 est sous le contrôle d’un promoteur de maïs auxin-inductible (Zm-Axig1)20 et le maïs In2-1 terminator21. Enfin, l’ADN T contient (5) le système de recombinaison cre-loxP. Le gène cre recombinase22 est sous le contrôle de la protéine de choc thermique du maïs 17,7 (Hsp17.7)23 promoteur et pomme de terre pinII terminator. Deux sites loxP (dans la même orientation)24 flanc quatre cassettes d’expression génique, y compris ZsGreen, cre, Bbm et Wus2.
Étant donné que la présence des gènes morphgéniques n’est pas souhaitée pour la maturité des plantes et la progéniture subséquente, le système de recombinaison cre-loxP induit par la chaleur a été intégré dans l’ADN T pour éliminer les gènes morphogènes du génome du maïs afin de permettre la régénération normale des callus et le développement des plantes. Lors du traitement thermique, l’expression de la protéine CRE élimine tous les transgènes à l’exception du gène de sélection Hra. Les transformateurs réussis doivent être résistants aux herbicides, mais ZsGreen-négatif. Pour améliorer encore la fréquence de transformation, la souche Agrobacterium abrite également un plasmide accessoire supplémentaire (PHP71539) qui a des copies supplémentaires de virulence Agrobacterium (vir) gènes12.
La méthode QuickCorn est différente des protocoles conventionnels de transformation du maïs, car elle n’implique pas une étape d’induction du callus pendant la transformation. Au cours de la première semaine après l’infection par Agrobacterium, les embryons somatiques se développent sur l’épithélium scutellar des embryons immatures infectés. Les embryons sont ensuite transférés vers un milieu avec des hormones qui encouragent la maturation des embryons et la formation de pousses. Le transfert rapide des embryons somatiques sur le milieu de maturation/formation de pousse saute le stade traditionnel de callus précédemment utilisé pour la transformation du maïs et permet la génération directe de plantes T08. Par rapport aux méthodes de transformation du maïs publiées précédemment6, la méthode QuickCorn est plus rapide, plus efficace et moins dépendante du génotype. En utilisant cette méthode, les plantes enracinées sont généralement prêtes à être transférées dans le sol en seulement 5-7 semaines, plutôt que les trois mois ou plus requis par les protocoles traditionnels. Le but de cet article est de fournir une description et une démonstration approfondies de la méthode, permettant une reproduction plus facile dans un cadre de laboratoire généralement trouvé dans la plupart des établissements universitaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

Démontré ici est un protocole détaillé pour Agrobacterium-négociétransformation génétique des lignées consanguines de maïs en utilisant des gènes morphogènes Baby boom (Bbm) et Wuschel2 (Wus2). Le bbm est réglementé par le promoteur du gène de transfert de phospholipides de maïs (Pltp), et Wus2 est sous le contrôle d’un promoteur de l’élin-inductible au maïs (Axig1). Une souche d’Agrobacterium portant ces gènes morphgéniques sur l’ADN de transfert (ADN T) et des copies supplémentaires des gènes de virulence d’Agrobacterium (vir) sont employées pour infecter des explants immatures d’embryon de maïs. Les embryons somatiques se forment sur la scutella des embryons infectés et peuvent être sélectionnés par résistance aux herbicides et germés en plantes. Un système de recombinaison cre/loxP activé par la chaleur intégré à la construction de l’ADN permet d’éliminer les gènes morphogènes du génome du maïs au cours d’une étape précoce du processus de transformation. Des fréquences de transformation d’environ 14 %, 4 % et 4 % (nombre d’événements transgéniques indépendants pour 100 embryons infectés) peuvent être atteintes pour les W22, B73 et Mo17, respectivement, en utilisant ce protocole.

Il est démontré ici un protocole étape par étape pourla transformation génétique de trois lignées de maïs de race publique (B73, Mo17 et W22) qui ont été importantes dans le domaine de la génétique du maïs. La transformation des trois lignées consanguines n’a pas pu être réalisée en utilisant les protocoles conventionnels de transformation du maïs5. La figure 1 et la figure 2 montrent les matériaux de construction et de démarrage, respectivement, utilisés ici. Les oreilles sont généralement récoltées 9-12 jours après la pollinisation. Les EE Dont la longueur varie entre 1,5 et 2,0 mm sont les meilleures explantations pour la transformation de ce protocole (Figure 2).
Huit jours après l’infection, des embryons somatiques exprimant ZsGreenont été visualisés sous le canal GFP d’un microscope fluorescent (Figure 3). Les EDE infectées ont été soumises à un traitement thermique 8 jours après l’infection (étapes 5.1 et 5.2). Ce traitement a induit l’expression de la recombinase CRE qui a excisé les cassettes d’expression Bbm, Wus2, cre, et ZsGreen flanquées entre les deux sites loxP (Figure 1). Les tissus traités à la chaleur ont ensuite été cultivés sur le milieu de formation de pousses contenant l’herbicide imazapyr pour la sélection des tissus transformés après l’élimination des gènes morphogènes.
Des tissus proliférants avec des embryons en maturation ou des bourgeons de pousse résistants à l’imazapyr ont été observés environ 3-4 semaines après l’infection (figure 4). Certains tissus résistants à l’imazapyr étaient négatifs pour ZsGreen, ce quisuggère que l’excision à médiation crécérée s’est probablement produite dans ces tissus (figure 4). Après que les tissus ont été déplacés à l’incubation moyenne et légère d’enracinement, les pousses ont commencé à se développer (figure 5). Des pousses saines et vigoureuses avec des racines bien développées ont été récoltées (Figure 5). Certains tissus semblaient avoir plusieurs pousses(Figure 5E,F,G). Ce type de régénération « herbeuse » peut être dû à des plantes clonales ayant des modèles d’intégration transgéniques identiques. Une analyse biologique moléculaire est nécessaire pour génotyper ces plantes.
Les trois lignées de consanguins publiques ont bien répondu en utilisant ce protocole ainsi que la construction utilisée dans ce travail. W22 a produit la fréquence la plus élevée de pousses résistantes aux imazapyrs, avec une fréquence d’environ 14 % (environ 14 pousses transgéniques pour 100 embryons immatures infectés). B73 et Mo17 ont produit environ 4 % de pousses transgéniques. Ces fréquences indiquent toutes les pousses transgéniques, y compris les plantes porteuses des gènes morphgéniques et des plantes dont le gène morphogène est éliminé par l’excision médiée par le CRE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la région T-ADN du plasmide binaire PHP81430. RB - bordure droite t-ADN; loxP - CRE recombinase site cible; Axig1pro:Wus2 - promoteur auxin-inductible de maïs (Zm-Axig1) - Zm-Wus2 - maïs In2-1 terminateur; Pltppro:Zm-Bbm - protéine de transfert phospholipide de maïs (Zm-Pltp) promoteur - Zm-Bbm - riz T28 terminator (Os-T28); Hsppro:cre - protéine de choc thermique de maïs 17,7 promoteur (Zm-Hsp17.7) - gène de recombinase de cre - inhibiteur de protéase de pomme de terre II (pinII) terminateur ; Ubipro:ZsGreen - sorghum ubiquitin promoter/intron (Sb-Ubi) - protéine fluorescente verte ZsGreen gène - rice ubiquitin terminator (Os-Ubi); Cassette de Hra - sorgho acetolactase synthase (Sb-Als) promoteur - maïs Hra (Zm-Hra) gène - pinII terminator; LB - frontière T-ADN gauche; colE1, origine de réplication du plasmide ColE125; SpecR - gène résistant à la spectinomycine aadA1 de Tn21 pour la sélection des bactéries26; Rep A,B,C - origine de réplication de pRiA4 d’Agrobacterium rhizogenes27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> Figure 2 : Matériaux de départ. B73 oreilles récoltées 12 jours après la pollinisation (A). Embryons immatures de B73 (B), Mo17 (C), et W22 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> Figure 3 : Développement tissulaire sur le repos moyen 1 semaine après l’infection. Embryons (8 jours après l’infection) sous un microscope à florescence (filtre GFP) montrant des embryons somatiques de Mo17 (A) et W22 (B). Tissu en développement (B73) sous le champ lumineux (C) et le filtre GFP (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> Figure 4 : Développement tissulaire sur le milieu de maturation avec sélection. Une plaque de maturation W22 (A). Tissu en développement (Mo17, 15 jours après l’infection) sous le filtre de champ lumineux (B) et GFP (C). Tissu en développement (Mo17, 28 jours après l’infection) sous le filtre de champ lumineux (D) et DeFp (E). Les flèches indiquent des tissus régénérants qui manquent d’expression de GFP, suggérant l’excision du gène zsGreen entre les emplacements de loxP après l’activité induite par la chaleur de protéine de CRE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> Figure 5 : Développement tissulaire sur les supports d’enracinement. Pousses de W22 (A), B73 (B), et Mo17 (C,D). Événement avec plusieurs pousses (regènes herbeux) de B73 (E) et W22 (F,G). Pousses avec des racines de B73 (H) et W22 (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Tableau 1 : Compositions médiatiques pour la transformation du maïs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Les gènes morphogènes végétaux peuvent être utilisés pour améliorer la transformation génétique des génotypes récalcitrants. Décrit ici est un protocole de transformation génétique Agrobacterium-négocié(QuickCorn) pour trois lignées de maïs de maïs public importants consanguins.

Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

La plupart des lignées consanguis de maïs ne peuvent pas être génétiquement transformées à l’aide de protocoles de transformation conventionnels. Ici, nous décrivons une méthode de transformation QuickCorn qui est rapide et moins dépendante du génotype. La méthode QuickCorn utilise les facteurs de transcription du maïs BABY BOOM et WUSCHEL.Lorsqu’ils sont incorporés dans le système vectoriel de transformation, ces gènes fonctionnent en synergie pour stimuler la croissance embryogénique. Contrairement aux protocoles conventionnels de transformation du maïs, la méthode QuickCorn n’implique pas d’étape d’induction du callus pendant la transformation. La région T-ADN du vecteur binaire utilisé dans nos travaux contient trois composants clés, les gènes morphogéniques, les gènes marqueurs et le système de recombinaison cre/loxP.Le système de recombinaison cre/loxP induit par la chaleur a été inclus dans l’ADN T pour enlever les gènes morphogéniques du génome du maïs afin de permettre la régénération normale du callus dans le développement des plantes. Environ deux à trois jours après l’apparition des soies et si le pollen sera disponible le lendemain, coupez les soies et l’enveloppe avec des ciseaux stérilisés à 70 %, à environ 2 1/2 centimètres au-dessous de l’extrémité des feuilles d’enveloppe, où les soies émergent, et recouvrez la soie d’un sac à pousses. Une fois que les anthères sortent d’un gland, recouvrez le gland d’un sac à glands et placez un trombone non dérapage à la base du sac autour de la tige.Le matin après avoir placé le sac de gland, pliez doucement la plante, et appuyez sur le sac pour encourager le pollen à être libéré. Retirez ensuite le sac à glands et pliez le dessus du sac pour empêcher le pollen de s’échapper. Polliniser une plante bénéficiaire, exposer les soies et verser rapidement le pollen du sac de gland sur les soies.Couvrez immédiatement l’oreille pollinée avec le sac de gland, et fixez la base du sac autour de la tige avec des agrafes. Pour vérifier la taille immature de l’embryon, neuf à 12 jours après la pollinisation, tirez doucement vers le bas de l’enveloppe pour exposer les grains à environ 1/3 à 1/4 de la circonférence de l’oreille et environ 1/3 de la distance vers le bas de l’oreille. Utilisez un scalpel pour couper le capuchon d’un seul noyau qui semble similaire à la majorité des autres grains en taille et en couleur, et utilisez une spatule avec une règle pour extraire l’embryon.Ensuite, utilisez la règle ou un étrier pour mesurer la longueur de l’embryon. Dans un délai d’un à quatre jours après la récolte, retirez les enveloppes et les soies des oreilles récoltées et insérez une poignée appropriée dans le haut ou la base de chaque oreille. Submergez les oreilles dans un grand récipient de solution d’eau de Javel de désinfection dans un capot stérile d’écoulement laminaire avec la poignée orientée vers le haut.Après 20 minutes, rincer les oreilles trois fois avec un volume généreux d’eau distillée stérile fraîche pendant cinq minutes par lavage avant de laisser sécher les oreilles pendant plusieurs minutes. Ensuite, remplissez un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres par oreille avec un milieu liquide de 700A, et utilisez un scalpel stérile pour enlever le haut d’un à deux millimètres de chaque couronne de noyau pour exposer l’endosperme de l’oreille. Localiser l’embryon immature dans le noyau sur le côté faisant face à la pointe de l’oreille, près de l’attache à l’épi.Pour le maître-chien supérieur et les opérateurs droitiers, reposez l’oreille sur une grande boîte stérile de Petri, et insérez une micro spatule dans l’endosperme dans le péricarpe le plus éloigné de l’embryon. Tordez doucement vers le haut pour déloger l’endosperme et exposer l’embryon, et utilisez la spatule pour placer soigneusement l’embryon dans un tube de 700A milieu liquide. Pour les opérateurs de manutention de base tenant l’oreille avec la main gauche, insérez une micro spatule dans l’endosperme dans le péricarpe le plus éloigné de l’embryon, et tordez doucement vers le haut pour déloger l’endosperme.Pour la culture des embryons dans une culture de suspension Agrobacterium, recueillir les bactéries d’une plaque de travail fraîchement préparée en 10 millilitres de 700A milieu liquide, et vortex pour suspendre complètement la culture des bactéries. Mesurez la densité optique à une longueur d’onde de 550 nanomètres et lavez les embryons avec un millilitre de milieu frais de 700A. Plongez les embryons dans un millilitre de suspension Agrobacterium et vortex sur un réglage bas pendant 30 secondes.Régler les embryons sur le banc avec les tubes dans une orientation horizontale pendant cinq minutes avant de transférer l’ensemble du contenu de chaque tube sur des plaques individuelles de 562V milieu de co-culture. Faites tourbillonner doucement les plaques pour répartir uniformément les embryons et aspirez l’excès de suspension Agrobacterium. Orientez soigneusement les embryons avec le côté en forme de dôme face vers le haut, en prenant soin d’éviter d’endommager les embryons.Placez ensuite les plaques dans des boîtes en plastique pour une incubation nocturne à 21 degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain matin, transférez soigneusement les embryons infectés sur le milieu de repos 605T, placez environ 30 embryons par plaque, côté scutellum vers le haut, pour une incubation de quatre à dix jours à 26 degrés Celsius dans l’obscurité. Vers sept jours, le développement de l’embryon somatique peut être observé à la surface du scutellum zygotique.À la fin de la période de repos, placer la boîte d’embryons dans un incubateur de 45 degrés Celsius avec une humidité relative de 70 % pendant deux heures, suivie d’une incubation d’une à deux heures à 26 degrés Celsius dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, placer 10 à 15 embryons immatures choqués par la chaleur sur des plaques individuelles de milieu de formation de pousses complétées par 05 milligrammes par litre de l’herbicide imazapyr comme agent sélectif. Retirez soigneusement les coleoptiles au besoin et retournez les embryons dans l’incubateur sombre de 26 degrés Celsius pendant deux semaines.À la fin de l’incubation, transférer environ huit morceaux de tissu par plaque sur des plaques moyennes d’enracinement pour une incubation d’une à deux semaines avec 16 heures de lumière et huit heures d’obscurité à 27 degrés Celsius. Au fur et à mesure que les plantules se développent, placez une plante plus forte contenant à la fois des pousses et des racines vigoureuses sur des plaques individuelles de milieu d’enracinement sous lumière pendant encore sept à 14 jours. Permettre aux pousses qui ne sont pas complètement développées d’être incubées sur le même milieu pendant encore une à deux semaines jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être déplacées vers le sol.À mesure que la plante devient plus vigoureuse, rincer les racines à l’eau du robinet pour enlever l’agar. Transplantez ensuite les plantes individuelles dans des pots de trois pouces contenant un substrat sans sol pré-mouillé dans un plateau avec des trous de vidange, et placez le plateau dans une chambre de croissance avec ou sans dôme d’humidité en plastique. Neuf à 14 jours après le transfert du pot, transplantez chaque plantlet avec du sol dans un pot de 1,5 gallon.Ajouter un engrais à libération contrôlée dans la casserole et maintenir les plantes dans la serre. Lorsque les pousses d’oreille commencent à émerger de la plante, utilisez un sac de shoot semi-transparent pour couvrir les pousses afin que les soies émergentes puissent être observées sans enlever le sac. Polliniser ensuite les plantes au stade approprié du développement tel que démontré.Les épis de maïs sont généralement récoltés neuf à 12 jours après la pollinisation. Les embryons immatures dont la longueur se situe entre 1,5 et 2 millimètres sont les meilleures explants pour la transformation de ce protocole. Huit jours après l’infection, les embryons somatiques exprimant ZsGreen peuvent être visualisés par microscopie par fluorescence.Le traitement thermique huit jours après l’infection induit l’expression cre recombinase, ayant pour résultat l’excision du gène morphogenic, cre, et des cassettes d’expression de ZsGreen flanquées entre les deux emplacements de loxP. Après trois à quatre semaines de culture sur le milieu de formation des pousses contenant de l’herbicide, on peut observer des tissus proliférants avec des embryons mûrissants ou des bourgeons de pousse résistants à l’herbicide. Certains tissus résistants aux herbicides peuvent être négatifs pour ZsGreen, ce qui suggère que l’excision cré-médiée s’est probablement produite dans ces tissus.Après avoir fait passer les tissus à l’incubation moyenne et légère de l’enracinement, on peut récolter des pousses saines, vigoureuses et en croissance aux racines bien développées. Notez que certains tissus peuvent sembler avoir plusieurs pousses peut-être en raison de plantes clonales ayant des modèles d’intégration transgénique identiques. La méthode QuickCorn peut grandement améliorer l’efficacité de la transformation du maïs et élargir la liste des génotypes transformables.Le protocole peut être reproduit avec succès par des chercheurs ayant une formation minimale sur la transformation du maïs. En utilisant la méthode QuickCorn, les plantes enracinées devraient être prêtes à être transférées dans le sol en seulement cinq à sept semaines après le jour de l’infection. Faites attention à la composition moyenne, au moment des sous-cultures et aux conditions de température et d’éclairage.La qualité des matériaux de départ est également essentielle à la réussite de la transformation. Les produits chimiques, la solution d’eau de Javel et l’herbicide utilisés dans ce protocole sont biodangereux. S’il vous plaît assurez-vous de porter l’équipement de protection personnelle approprié pendant leur utilisation.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Recherche

Biologie

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: détection d&#39;altérations numériques et structurelles dans les 24 chromosomes de l&#39;homme en utilisant simultanément un dosage FISH Novel OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Transformation génétique médiée, production transgénique et application pour l’étude du développement de la reproduction masculine dans le riz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Advancing Gene Editing in Bamboo Leaves for Sustainable Plastic Alternatives (Video) | JoVE

À Planta Expression génique et édition de gènes dans les feuilles de bambou moso

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

ï»¿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia (Video) | JoVE 

Imagerie de coupes transversales de Primordia de feuilles de maïs