Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Wir danken dem Corteva Gewächshausteam für die Bereitstellung von Mais unreifen Ohren, dem Corteva Media Prep Lab für die Bereitstellung von Medien, Ning Wang aus Corteva für die Unterstützung beim Agrobacterium-Konstrukt und Keunsub Lee von der Iowa State University für Unterstützung. Dieses Projekt wurde teilweise unterstützt durch das National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 und 1917138 an K.W., durch Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) an J.Z., durch das USDA NIFA Hatch Projekt #IOW04341, durch State of Iowa Fonds und durch Crop Bioengineering Center der Iowa State University.

<ol>
	<li>Zhao, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+genetic+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens+in+maize.">High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.</a> Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).</li><li>Green, C. E., Phillips, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+regeneration+from+tissue+cultures+of+maize.">Plant regeneration from tissue cultures of maize.</a> Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).</li><li>Ji, Q., Xu, X., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+major+cereal+crops.">Genetic transformation of major cereal crops.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).</li><li>Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+(Zea+mays,+L).">Maize (Zea mays, L).</a> Agrobacterium Protocols. , 101-117 (2015).</li><li>Frame, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Agrobacterium-mediated+transformation+of+three+maize+inbred+lines+using+MS+salts.">Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts.</a> Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenic+regulators+Baby+boom+and+Wuschel+improve+monocot+transformation.">Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation.</a> The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotypes+independent+maize+transformation+via+direct+somatic+embryogenesis.">Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).</li><li>Boutilier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+BABY+BOOM+triggers+a+conversion+from+vegetative+to+embryonic+growth.">Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth.</a> The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).</li><li>Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+promotes+vegetative-to-embryonic+transition+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).</li><li>Jones, T. J., Kumar, S., Barone, P., Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+using+the+morphogenic+genes+Baby+Boom+and+Wuschel2.">Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2.</a> Transgenic Plants. , 81-93 (2019).</li><li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ternary+vector+system+for+Agrobacterium-mediated+rapid+maize+transformation.">An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation.</a> Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+acetolactate+synthase+gene+is+an+efficient+in+vitro+selectable+marker+for+the+genetic+transformation+of+Brassica+juncea+(Oilseed+Mustard).">Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard).</a> Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).</li><li>Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L., Gutteridge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+98140+corn+with+gat4621+and+hra+transgenes+to+glyphosate+and+ALS-inhibiting+herbicides.">Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides.</a> Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).</li><li>An, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+3'+control+region+of+the+potato+wound-inducible+proteinase+inhibitor+II+gene.">Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.</a> The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+nonbioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).</li><li>Passarinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Genes+Provide+Diverse+Entry+Points+into+Cell+Proliferation+and+Cell+Growth+Pathways.">Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).</li><li>Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+plant+terminator+sequences.">Novel plant terminator sequences.</a> Patent Number US2014/0130205. , (2014).</li><li>Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+is+required+for+shoot+and+floral+meristem+integrity+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.</a> Development. 122 (1), 87-96 (1996).</li><li>Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zm-AXIG1-specific+polynucleotides+and+methods+of+use.">Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use.</a> Patent Number WO2002006499. , (2002).</li><li>Hershey, H. P., Stoner, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNA+clones+for+RNA+species+induced+by+substituted+benzenesulfonamides+in+corn.">Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn.</a> Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).</li><li>Abremski, K., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+P1+site-specific+recombination.+Purification+and+properties+of+the+Cre+recombinase+protein.">Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).</li><li>Sun, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Function+Analysis+of+Small+Heat+Shock+Protein+Gene+ZmHSP17.7+from+Maize.">Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize.</a> ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+ColEl+as+a+molecular+vehicle+for+cloning+and+amplification+of+DNA.">Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).</li><li>Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn21,+flagship+of+the+floating+genome.">Transposon Tn21, flagship of the floating genome.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).</li><li>Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+sequence+determination+of+the+replicator+region+in+the+hairy-root-inducing+plasmid+pRiA+4b.">Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b.</a> Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).</li></ol>

Alicia Masters, William Gordon-Kamm und Todd Jones sind Mitarbeiter von Corteva Agriscience, die das Protokoll und die Maisohren von B73, Mo17 und W22 geliefert haben, die in diesem Artikel verwendet werden. Die Autoren Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist und Kan Wang haben nichts zu verraten.

Traditionelle Protokolle für die Maistransformation folgen dem Paradigma der Isolierung unreifer zygotischer Embryonen zur Herstellung von transgenem Kalusgewebe, das zu fruchtbaren Pflanzen regeneriert wird4,6. Während dies wirksam ist, können Callus-basierte Protokolle zeitaufwändig sein, und es dauert oft bis zu 3 Monate, bis der Gewebekulturprozess Pflanzen produziert. Was die hier vorgestellte Methode signifikant macht, ist, dass sie callusfrei, effizient, schnell ist und die Regeneration von T0-Pflanzen in etwa der Hälfte des Zeitrahmens ermöglicht. Es scheint auch weniger genotypabhängig zu sein und kann somit für die meisten öffentlich verfügbaren Inzuchten wirksam sein8,11.
Während alle Schritte effektiv befolgt werden sollten, ist eine korrekte Vorbereitung der Wachstumsmedien unerlässlich. Wachstumsmedienkomponenten müssen in den richtigen Stadien hinzugefügt werden, sowohl vor als auch nach dem Autoklaven, um sicherzustellen, dass das Pflanzenmaterial die richtige Konzentration von Chemikalien erhält. Dadurch wird sichergestellt, dass empfindliche Verbindungen wie Antibiotika nicht abbauen. Es ist auch wichtig, dass Pflanzenmaterial in jeder Phase auf das richtige Wachstumsmedium gelegt wird, wie im Protokoll angegeben. Das Nicht-Aufstellen von Material auf das richtige Wachstumsmedium kann zum materiellen Tod führen. Darüber hinaus sollte vermieden werden, zu viele Embryonen oder die Entwicklung von Geweben auf Platten zu platzieren. Während das Platzieren von doppelt so vielen Gewebestücken die Kosten für Chemikalien und Petrischalen (und sogar inkubatorRaum) sparen kann, kann das Wachstum von Gewebe in überfüllten Platten ernsthaft gehemmt werden. Bei der Durchführung der Infektion sollte sichergestellt werden, dass die optische Dichte der Agrobacterium Suspension angemessen ist. Wenn die bakterielle Suspensionsdichte zu niedrig ist, kann eine richtige Infektion nicht auftreten.
Die Qualität der Ausgangsmaterialien ist entscheidend für den Erfolg von Transformationsprotokollen. Ohren, die für die Embryosektion verwendet werden, müssen gesund sein, was bedeutet, dass die Pflanze, die sie produziert, gesund ist. Sie müssen auch über ein angemessenes Saatgutset verfügen und schädlings- und krankheitsfrei sein. Auch sollte altes Agrobacterium nicht verwendet werden. Die "Mutter"-Platte sollte nicht mehr als 2 Wochen alt sein. Danach sollte eine neue "Mutter"-Platte gestreift werden, um neue Experimente zu beginnen.
Obwohl sich gezeigt hat, dass diese Methode weniger genotypabhängig ist, kann nicht davon ausgegangen werden, dass alle Linien gleichermaßen erfolgreich sein werden. Es kann immer noch Unterschiede zwischen den Linien sowie Unterschiede im Erfolg basierend auf dem verwendeten Konstrukt geben. Ohr-zu-Ohr-Variabilität ist auch bei der Arbeit mit unreifen Embryonen unvermeidbar, daher sollten Experimente idealerweise mehrere Ohren verwenden, um dies zu berücksichtigen. In dieser Arbeit schnitt die inzuchtw22 am besten ab, mit einer Transformationshäufigkeit von über 14 %, gefolgt von B73 und Mo17 (jeweils 4 %). Lowe et al.8 berichteten mit dem QuickCorn-Protokoll für die B73- und Mo17-Transformation. In dieser Arbeit reichten die Transformationsfrequenzen von 9%-50% für B73 und 15%-35% für Mo17.
Eine Möglichkeit für die niedrigeren Transformationsfrequenzen für B73 und Mo17, die in dieser Arbeit beobachtet wurden, kann auf saisonale Ohrqualitätsschwankungen zurückgeführt werden. Ein weiterer Unterschied zwischen dieser Arbeit und der von Lowe et al.8 ist, dass hier verschiedene Vektorkonstrukte verwendet wurden. In Lowes Arbeit wurden morphogene Gene nicht aus den transformierten Pflanzen entfernt, sondern in den späteren Stadien entwicklungsfördernd. In dieser Arbeit wurden die morphogenen Gene 8 Tage nach der Infektion entfernt. Es ist möglich, dass B73 und Mo17 eine längere Präsenz von Bbm/Wus2 für die Entwicklung somatischer Embryonen benötigen.
Mit dieser Methode besteht die Möglichkeit, nicht-transgene Entweichungspflanzen, multimere Einfügungen und nicht verbrauchende Transgene zu erhalten. Diese Pflanzen haben keinen deutlich anderen Phänotyp, daher ist die Detektion durch PCR erforderlich, um festzustellen, ob eine Pflanze transgen ist. Um dies zu erreichen, können PCR-Primer innerhalb der verbraucheten Region und Primer, die die verbrauchsteuernde Region flankieren, verwendet werden. Mehrere unabhängige Transformationen können auch Pflanzen aus demselben unreifen Embryo produzieren, was die Bestimmung einer völlig unabhängigen transformativen Rückgewinnungsrate erschwert. Unser Standard war es, eine Transformationsrate auf der Grundlage der Probenahme einer Pflanze aus jedem unreifen Embryo, der Pflanzen produzierte, zu berechnen und diese durch die Anzahl der infizierten Embryonen zu dividieren. Diese Methode unterschätzt mit ziemlicher Sicherheit die tatsächliche Anzahl unabhängiger Ereignisse, die als Pflanzen zurückgewonnen werden. Die Diskriminierung unabhängiger Ereignisse desselben Embryos erfordert die Sequenzierung von Grenzregionen um Transgene, und dies wird für die meisten Anwendungen unerschwinglich teuer und zeitaufwändig sein; Es kann jedoch Fälle geben, in denen diese Daten nützlich sind.
Diese Methode der Gewebekulturtransformation hat sich als sehr effektiv erwiesen, aber Es können immer noch Probleme auftreten. Wenn Pflanzenmaterial nicht reagiert, ist es möglich, dass es ein Problem mit der jeweiligen Inzuchtlinie gibt, was darauf hindeutet, dass Variablen wie die Zusammensetzung der Wachstumsmedien und der Zeitpunkt der Subkultivierung Anpassungen erfordern. Eine weitere Variable ist das richtige Vektordesign und die genaue Vektorkonstruktion, wenn der ursprüngliche Vektor geändert wird. Es kann auch Probleme mit imazapyr Empfindlichkeit sein, da einige Linien empfindlicher als andere sind, und die Konzentration von Imazapyr muss möglicherweise angepasst werden, um erfolgreich transformierte Pflanzen zu erreichen.
In den letzten 30 Jahren haben sich die Maisgewebekultur und die Transformationsprotokolle verändert und sind vorangekommen; und es wird angenommen, dass dieses verkürzte Protokoll diese Progression weiter vorantreiben wird. Diese Methode ist für akademische Umgebungen wirksam, da sie weniger zeitaufwändig ist als herkömmliche Methoden. Darüber hinaus verlangt sie keine hochqualifizierten Bediener, was eine breitere Verbreitung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ermöglicht. In Zukunft kann diese Methode mit neuen Technologien wie genome engineering kombiniert werden.

Die Transformation ist ein grundlegendes Instrument zur Bewertung der Fremdgenexpression in Mais und zur Herstellung genetisch veränderter Maislinien sowohl für Forschungs- als auch für kommerzielle Zwecke. Der Zugang zu einer Transformation mit hohem Durchsatz kann den erhöhten Bedarf an molekularen und zellulären Biologiestudien für Mais erleichtern1. Die Fähigkeit, Pflanzenarten genetisch zu transformieren, ist sowohl für öffentliche als auch für private Laboratorien von entscheidender Bedeutung. Dies ermöglicht sowohl ein grundlegendes Verständnis der Genregulationsmechanismen als auch eine verbesserung der Kulturen auf globaler Ebene, um eine ständig wachsende Bevölkerung zu unterstützen.
Die Entdeckung, dass unreife Embryonen aus Mais zur Herstellung von regenerierbarem Callus verwendet werden könnten, entstand 19752. Seit dieser Enthüllung erforderten die meisten skalierbaren Maistransformationsprotokolle die Bildung und Selektion von Callus vor der Regeneration3. Während des Prozesses der genetischen Transformation werden Agrobacterium-infizierteoder biolistisch-bombardierte unreife Embryonen auf Medien für embryogene Callus-Induktion kultiviert. Induzierte Calli werden dann auf selektiven Medien kultiviert (z.B. mit einem Herbizid), so dass nur transformierte Callusstücke überleben können. Diese herbizidresistenten, vermeintlichen transgenen Calli werden aufgeschüttet und zu Pflanzen regeneriert. Während diese Methode wirksam ist, ist der Prozess lang und arbeitsintensiv, und es kann bis zu 3 Monate dauern, um4abzuschließen. Noch wichtiger ist, dass herkömmliche Maistransformationsprotokolle eine viel größere Begrenzung besitzen, d.h. nur eine begrenzte Anzahl von Maisgenotypen kann5,6transformiert werden.
Lowe et al.7,8 berichtete zuvor über eine "QuickCorn"-Transformationsmethode, die nicht nur die Dauer des Transformationsprozesses stark reduzierte, sondern auch die Liste der transformierbaren Genotypen erweiterte. Die QuickCorn-Methode verwendet Mais-Orthologs (Zm-Bbm und Zm-Wus2) der Arabidopsis-Transkriptionsfaktoren BABY BOOM (BBM)9 und WUSCHEL (WUS)10. Wenn sie in das Transformationsvektorsystem integriert sind, arbeiten diese Gene synergistisch, um das embryogene Wachstum zu stimulieren7.
Das in dieser Arbeit beschriebene QuickCorn-Protokoll basierte auf dem Protokoll in Jones et al11, das eine weitere Verbesserung der von Lowe et al7berichtetenMethodedarstellte, 8. In der vorliegenden Studie wird ein Agrobacterium-Stamm LBA4404(Thy-) verwendet, der ein binäres Vektorkonstrukt PHP81430 (Abbildung 1) und zubehörplasmaPHdes PHP7153912 beherbergt. Die T-DNA von PHP81430 enthält die folgenden molekularen Komponenten. (1) Das transformationsselektive Markergen Hra-Expressionskassette. Das Mais-Hra- (Zm-Hra)-Gen ist ein modifiziertes Acetolactase-Synthase-Synthase-Gen (ALS), das tolerant gegenüber ALS-hemmenden Herbiziden wie Sulfonylharnstoff und Imidazolinonen13,14ist. Das Zm-Hra-Gen wird durch den Sorghum ALS-Promotor8 und den Kartoffelproteinase-Inhibitor II(PinII) Terminator15reguliert. Die T-DNA enthält auch (2) eine Expressionskassette, die das transformationsbildbare Markergen ZsGreenbesitzt. Dieses grüne fluoreszierende Proteingen ZsGreen aus Zoanthus sp. riffkoralle16 wird durch einen Sorghum-Ubiquitin-Promotor/Intron- und Reis-Ubiquitin-Terminator reguliert.
Zusätzlich enthält die T-DNA (3) das morphogene Gen Bbm Expressionskassette. Bbm ist ein Transkriptionsfaktor im Zusammenhang mit der Embryoentwicklung9,17. Bbm wird durch das Maisphospholipid Transferase Protein (Pltp) Promoter8 und Reis T28 Terminator18reguliert. Zm-Pltp ist ein Gen mit starker Expression im Embryo-Scutellar-Epithel, Seidenhaaren und Blattnebenzellen (flankierend in den Wachzellen), geringer Expression in Fortpflanzungsorganen und ohne Expression in den Wurzeln8. Es enthält auch (4) das morphogene Gen Wus2 Expressionskassette. Wus2 ist ein weiterer Transkriptionsfaktor, der mit der Aufrechterhaltung des apikalen Meristes19verbunden ist. Zm-Wus2 steht unter der Kontrolle eines Mais-Auxin-induzierbaren Promotors (Zm-Axig1)20 und Mais In2-1 Terminator21. Schließlich enthält die T-DNA (5) das Cre- LoxP-Rekombinationssystem. Das Cre-Rekombinatoase-Gen22 steht unter der Kontrolle des Mais-Wärmeschockproteins 17.7 (Hsp17.7)23 Promoter und KartoffelpinII Terminator. Zwei loxP-Standorte (in der gleichen Ausrichtung)24 flankieren vier Genexpressionskassetten einschließlich ZsGreen, cre, Bbm und Wus2.
Da das Vorhandensein der morphogenen Gene für die Pflanzenreife und die nachfolgende Nachkommennichten nicht erwünscht ist, wurde das wärmeinduzierte Cre-LoxP-Rekombinationssystem in die T-DNA integriert, um morphogene Gene aus dem Maisgenom zu entfernen, um eine normale Callusregeneration und Pflanzenentwicklung zu ermöglichen. Bei der Wärmebehandlung entfernt die Expression des CRE-Proteins alle Transgene mit Ausnahme des Hra-Selektionsgens. Erfolgreiche Transformanten sollten herbizidresistent, aber ZsGreen-negativsein. Um die Transformationshäufigkeit weiter zu verbessern, enthält der Agrobacterium-Stamm auch ein zusätzliches Zubehörplasmid (PHP71539), das zusätzliche Kopien der Agrobacterium-Virulen (vir) Gene12enthält.
Die QuickCorn-Methode unterscheidet sich von herkömmlichen Maistransformationsprotokollen, da sie während der Transformation keinen Callus-Induktionsschritt beinhaltet. In der ersten Woche nach der Infektion mit Agrobacteriumentwickeln sich auf dem Scutellar-Epithel der infizierten unreifen Embryonen somatische Embryonen. Die Embryonen werden dann auf ein Medium mit Hormonen übertragen, die die Embryoreifung und Triebbildung fördern. Die schnelle Übertragung der somatischen Embryonen auf das Reifungs-/Triebbildungsmedium überspringt das traditionelle Callusstadium, das bisher für die Maisumwandlung verwendet wurde, und ermöglicht die direkte Erzeugung von T0-Pflanzen8. Im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Maistransformationsmethoden6ist die QuickCorn-Methode schneller, effizienter und weniger genotypabhängig. Mit dieser Methode sind verwurzelte Pflanzen in der Regel bereit, in nur 5-7 Wochen auf den Boden zu übertragen, anstatt die drei oder mehr Monate, die von traditionellen Protokollen erforderlich sind. Der Zweck dieses Artikels besteht darin, eine ausführliche Beschreibung und Demonstration der Methode bereitzustellen, um eine einfachere Replikation in einer Laborumgebung zu ermöglichen, die typischerweise in den meisten akademischen Einrichtungen zu finden ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

Gezeigt wird hier ein detailliertes Protokoll für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation von Mais-Inzuchtlinien mit morphogenen Genen Baby boom (Bbm) und Wuschel2 (Wus2). Bbm wird durch den Maisphospholipid-Transferase-Gen (Pltp) Promotor reguliert, und Wus2 ist unter der Kontrolle eines Mais-Auxin-induzierbaren (Axig1) Promotors. Ein Agrobacterium-Stamm, der diese morphogenen Gene auf Transfer-DNA (T-DNA) und Extrakopien von Agrobacterium-Virulen (vir) trägt, wird verwendet, um maisunreife Embryo-Explanten zu infizieren. Somatische Embryonen bilden sich auf den Scutella infizierter Embryonen und können durch Herbizidresistenz ausgewählt und in Pflanzen gekeimt werden. Ein wärmeaktiviertes Cre/LoxP-Rekombinationssystem, das in das DNA-Konstrukt integriert ist, ermöglicht die Entfernung morphogener Gene aus dem Maisgenom in einem frühen Stadium des Transformationsprozesses. Transformationsfrequenzen von ca. 14%, 4% und 4% (Anzahl unabhängiger transgener Ereignisse pro 100 infizierte Embryonen) können für W22, B73 und Mo17 mit diesem Protokoll erreicht werden.

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation von drei öffentlichen Mais-Inzuchtlinien (B73, Mo17 und W22) demonstriert, die im Bereich der Maisgenetik signifikant waren. Die Transformation der drei Inzuchtlinien konnte mit den herkömmlichen Maistransformationsprotokollen5nicht erreicht werden. Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die hier verwendeten Konstruktions- bzw. Ausgangsmaterialien. Ohren werden in der Regel 9-12 Tage nach der Bestäubung geerntet. IZEs mit Längen zwischen 1,5 und 2,0 mm sind die besten Explanten für die Transformation für dieses Protokoll (Abbildung 2).
Acht Tage nach der Infektion wurden ZsGreen-extierendesomatische Embryonen unter dem GFP-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops visualisiert (Abbildung 3). Infizierte IZEs wurden 8 Tage nach der Infektion einer Wärmebehandlung unterzogen (Schritte 5.1 und 5.2). Diese Behandlung induzierte die Expression von CRE-Rekombinat, die die Bbm- Wus2, creund ZsGreen Ausdruck Kassetten flankiert zwischen den beiden loxP-Standorten (Abbildung 1). Die wärmebehandelten Gewebe wurden dann auf einem Triebbildungsmedium kultiviert, das das Herbizid Imazapyr zur Selektion des transformierten Gewebes nach morphogener Genentfernung enthält.
Vermehrende Gewebe mit reifenden Embryonen oder Triebknospen, die gegen Imazapyr resistent waren, wurden etwa 3-4 Wochen nach der Infektion beobachtet (Abbildung 4). Einige Imazapyr-resistente Gewebe waren negativ für ZsGreen, was darauf hindeutet, dass in diesen Geweben wahrscheinlich eine kre-vermittelteExzision aufgetreten ist ( Abbildung4). Nachdem das Gewebe in die Wurzelmedium- und Lichtinkubation verschoben wurde, begannen sich die Triebe zu entwickeln (Abbildung 5). Gesunde und kräftig wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln wurden geerntet (Abbildung 5). Einige Gewebe schienen mehrere Triebe zu haben (Abbildung 5E,F,G). Diese Art von "grasigem" Regenerant kann auf klonale Pflanzen mit identischen Transgenintegrationsmustern zurückzuführen sein. Molekularbiologische Analysen sind erforderlich, um diese Pflanzen zu genotypisieren.
Alle drei öffentlichen Inzuchtlinien reagierten gut mit diesem Protokoll sowie dem in dieser Arbeit verwendeten Konstrukt. W22 produzierte die höchste Häufigkeit von Imazapyr-resistenten Trieben mit einer Häufigkeit von etwa 14% (ca. 14 transgene Triebe pro 100 infizierte unreife Embryonen). Sowohl B73 als auch Mo17 produzierten etwa 4% transgene Triebe. Diese Frequenzen zeigen alle transgenen Triebe an, einschließlich der beiden Pflanzen, die die morphogenen Gene tragen, und Pflanzen mit dem morphogenen Gen, das durch die CRE-vermittelte Exzision entfernt wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der T-DNA-Region des binären Plasmids PHP81430. RB = rechte T-DNA-Grenze; loxP = CRE-Rekombinator-Zielstandort; Axig1pro:Wus2 = Mais-Auxin-induzierbarer Promotor (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + Mais In2-1 Terminator; Pltppro:Zm-Bbm = Maisphospholipid Transferase Protein (Zm-Pltp) Promoter + Zm-Bbm + Reis T28 Terminator (Os-T28); Hsppro:cre = Mais-Wärmeschockprotein 17,7 Promotor (Zm-Hsp17.7) + Cre-Rekombinator-Gen + Kartoffelproteinase-Inhibitor II (pinII) Terminator; Ubipro:ZsGreen = sorghum ubiquitin promoter/intron (Sb-Ubi) + grünes fluoreszierendes Protein ZsGreen Gen + Reis Ubiquitin Terminator (Os-Ubi); Hra Kassette = Sorghum acetolactase synthase (Sb-Als) Promoter + Mais Hra (Zm-Hra) gen + pinII Terminator; LB = linke T-DNA-Grenze; colE1, Replikationsursprung des Plasmids ColE125; SpecR = spectinomycinresistentes Gen aadA1 von Tn21 zur Bakteriumauswahl26; Rep A,B,C = Replikationsursprung aus pRiA4 von Agrobacterium rhizogenes27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> Abbildung 2: Ausgangsmaterialien. B73 Ohren geerntet 12 Tage nach der Bestäubung (A). Unreife Embryonen von B73 (B), Mo17 (C) und W22 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> Abbildung 3: Gewebeentwicklung auf Ruhemedium 1 Woche nach der Infektion. Embryonen (8 Tage nach der Infektion) unter einem Blütenmikroskop (GFP-Filter) mit GFP-Exzessen somatischer Embryonen von Mo17 (A) und W22 (B). Entwicklung von Gewebe (B73) unter Hellem Feld (C) und GFP-Filter (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> Abbildung 4: Gewebeentwicklung auf Reifungsmedium mit Auswahl. Eine W22 Reifungsplatte (A). Entwicklung von Gewebe (Mo17, 15 Tage nach der Infektion) unter Hellem Feld (B) und GFP-Filter (C). Entwicklung von Gewebe (Mo17, 28 Tage nach der Infektion) unter Hellem Feld (D) und GFP-Filter (E). Pfeile weisen auf regenerierende Gewebe hin, denen die GFP-Expression fehlt, was auf die Exzision des ZsGreen-Gens zwischen den LoxP-Standorten nach hitzeinduzierter CRE-Proteinaktivität hindeutet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> Abbildung 5: Gewebeentwicklung auf Verwurzelungsmedien. Triebe von W22 (A), B73 (B) und Mo17 (C,D). Event mit mehreren Trieben (grasige Regeneranten) von B73 (E) und W22 (F,G). Triebe mit Wurzeln von B73 (H) und W22 (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Medienzusammensetzungen für die Maisumwandlung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Pflanzenmorphogene können verwendet werden, um die genetische Transformation widerspenstiger Genotypen zu verbessern. Beschrieben wird hier ein Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation (QuickCorn) Protokoll für drei wichtige öffentliche Mais-Inzuchtlinien.

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Die meisten Mais-Inzuchtlinien können nicht mit herkömmlichen Transformationsprotokollen genetisch transformiert werden. Hier beschreiben wir eine QuickCorn-Transformationsmethode, die schnell und weniger genotypabhängig ist. Die QuickCorn-Methode verwendet Mais-Transkriptionsfaktoren BABY BOOM und WUSCHEL.Wenn diese Gene in das Transformationsvektorsystem integriert sind, arbeiten sie synergistisch, um das embryogene Wachstum zu stimulieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Maistransformationsprotokollen beinhaltet die QuickCorn-Methode während der Transformation keinen Callus-Induktionsschritt. Die T-DNA-Region des binären Vektors, der in unserer Arbeit verwendet wird, enthält drei Schlüsselkomponenten, morphogene Gene, Markergene und das Cre/LoxP-Rekombinationssystem.Das wärmeinduzierte Cre/LoxP-Rekombinationssystem wurde in die T-DNA aufgenommen, um die morphogenen Gene aus dem Maisgenom zu entfernen, um eine normale Callusregeneration in der Pflanzenentwicklung zu ermöglichen. Etwa zwei bis drei Tage, nachdem Seiden entstanden sind und wenn Pollen am nächsten Tag verfügbar sein werden, schneiden Sie die Seiden und Schale mit 70% Ethanol-sterilisierten Scheren, etwa 2 1/2 Zentimeter unter dem Ende der Schalenblätter, wo die Seiden auftauchen, und bedecken Sie die Seide mit einem Schießbeutel. Sobald Anthers aus einer Quaste auftauchen, bedecken Sie die Quaste mit einer Quastetasche und legen Sie eine rutschige Büroklammer an die Basis der Tasche um den Stiel.Am Morgen nach dem Platzieren der Quaste Tasche, sanft biegen Sie die Pflanze, und tippen Sie auf den Beutel, um Pollen zu fördern, freigesetzt werden. Entfernen Sie dann den Quastenbeutel und falten Sie die Oberseite des Beutels um, um zu verhindern, dass Pollen entweichen. Um eine Empfängerpflanze zu bestäubern, setzen Sie die Seiden aus und gießen Sie schnell Pollen aus dem Quastenbeutel auf die Seiden.Bedecken Sie sofort das bestäubte Ohr mit dem Quastenbeutel und sichern Sie die Basis der Tasche um den Stiel mit Heftklammern. Um die unreife Embryogröße neun bis zwölf Tage nach der Bestäubung zu überprüfen, ziehen Sie die Schale vorsichtig nach unten, um die Kerne bei etwa 1/3 bis 1/4 des Umfangs des Ohres und etwa 1/3 des Abstands nach unten des Ohres freizulegen. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Kappe eines einzelnen Kernels abzuschneiden, der der Mehrheit der anderen Kerne in Größe und Farbe ähnelt, und verwenden Sie einen Spachtel mit einem Lineal, um den Embryo zu extrahieren.Verwenden Sie dann das Lineal oder einen Bremssattel, um die Länge des Embryos zu messen. Innerhalb von ein bis vier Tagen nach der Ernte die Schalen und Seiden von den geernteten Ohren entfernen und einen geeigneten Griff in die Oberseite oder die Basis jedes Ohres einfügen. Tauchen Sie die Ohren in einen großen Behälter mit Desinfektionsbleichlösung in einer sterilen laminaren Durchflusshaube mit nach oben gerichtetem Griff ein.Nach 20 Minuten die Ohren dreimal mit einem großzügigen Volumen an frischem sterilem destilliertem Wasser für fünf Minuten pro Wäsche abspülen, bevor die Ohren mehrere Minuten trocknen. Als nächstes füllen Sie ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr pro Ohr mit 700A flüssigem Medium, und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die oberen ein bis zwei Millimeter jeder Kernkrone zu entfernen, um das Endosperm des Ohres freizulegen. Suchen Sie den unreifen Embryo im Kern auf der Seite mit Blick auf die Ohrspitze, in der Nähe der Befestigung an der Cob.Für Top-Handler und Rechtshänder, ruhen Sie das Ohr auf eine große sterile Petrischale, und legen Sie einen Mikro-Spachtel in das Endosperm in der Perikarpfen am weitesten weg vom Embryo. Drehen Sie vorsichtig nach oben, um das Endosperm zu vertreiben und den Embryo freizulegen, und verwenden Sie den Spachtel, um den Embryo vorsichtig in eine Röhre mit 700A flüssigem Medium zu legen. Für Basishandler, die das Ohr mit der linken Hand halten, legen Sie einen Mikrospachtel in das Endosperm in den Pericarp, der am weitesten vom Embryo entfernt ist, und drehen Sie sich sanft nach oben, um das Endosperm zu lösen.Um die Embryonen in einer Agrobacterium Suspensionskultur zu kultivieren, sammeln Sie Bakterien aus einer frisch zubereiteten Arbeitsplatte in 10 Milliliter 700A flüssiges Medium und Wirbel, um die Bakterienkultur vollständig auszusetzen. Messen Sie die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern und waschen Sie die Embryonen mit einem Milliliter frischem 700A-Medium. Tauchen Sie die Embryonen in einen Milliliter Agrobacterium Suspension, und Wirbel auf einer niedrigen Einstellung für 30 Sekunden.Setzen Sie die Embryonen mit den Rohren in horizontaler Ausrichtung fünf Minuten lang auf die Bank, bevor Sie den gesamten Inhalt jedes Rohres auf einzelne Platten des 562V-Anbaumediums übertragen. Wirbeln Sie die Platten sanft, um die Embryonen gleichmäßig zu verteilen, und saugen Sie die überschüssige Agrobacterium Suspension an. Richten Sie die Embryonen sorgfältig mit der kuppelförmigen Seite nach oben aus, wobei Darauf geachtet wird, dass die Embryonen nicht beschädigt werden.Dann legen Sie Teller in Plastikboxen für eine nächtliche Inkubation bei 21 Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Morgen, sorgfältig übertragen infizierte Embryonen auf ruhende Medium 605T, legen Sie etwa 30 Embryonen pro Platte, scutellum Seite nach oben, für eine vier- bis 10-Tage-Inkubation bei 26 Grad Celsius im Dunkeln. Nach etwa sieben Tagen kann die somatische Embryoentwicklung auf der Oberfläche des zygotischen Scutellums beobachtet werden.Am Ende der Ruhezeit stellen Sie die Schachtel mit Embryonen in einen 45-Grad-Celsius-Inkubator mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit für zwei Stunden, gefolgt von einer ein- bis zweistündigen Inkubation bei 26 Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation 10 bis 15 hitzegeschockte unreife Embryonen auf einzelne Platten des Triebbildungsmediums legen, ergänzt um 05 Milligramm pro Liter des Herbizids Imazapyr als selektives Mittel. Entfernen Sie vorsichtig alle Kolotile nach Bedarf, und bringen Sie die Embryonen für zwei Wochen in den 26-Grad-Grad-Celsius-Dunkelbrutschrank zurück.Am Ende der Inkubation etwa acht Gewebestücke pro Platte auf verwurzelende Mittelplatten für eine ein- bis zweiwöchige Inkubation mit 16 Stunden Licht und acht Stunden Dunkelheit bei 27 Grad Celsius übertragen. Wenn sich Pflanzenentwickeln entwickeln, legen Sie ein stärkeres Pflanzgefäß, das sowohl Triebe als auch kräftige Wurzeln enthält, weitere sieben bis 14 Tage unter Licht auf einzelne Platten des Wurzelmediums. Lassen Sie Triebe, die noch nicht vollständig entwickelt sind, für weitere ein bis zwei Wochen auf demselben Medium bebrütet werden, bis sie bereit sind, auf den Boden zu bewegt zu werden.Wenn die Pflanze kräftiger wird, spülen Sie die Wurzeln mit Leitungswasser ab, um Agar zu entfernen. Dann verpflanzen Sie die einzelnen Pflanzen in Drei-Zoll-Töpfe, die ein vorbenetztes bodenloses Substrat in einer Schale mit Abflusslöchern enthalten, und legen Sie das Tablett in eine Wachstumskammer mit oder ohne Kunststoff-Feuchtigkeitskuppel. Neun bis 14 Tage nach dem Topftransfer jede Pflanze mit Erde in einen 1,5-Gallonen-Topf transplantieren.Fügen Sie einen kontrolliert freigesetzten Dünger in den Topf und halten Sie die Pflanzen im Gewächshaus. Wenn Ohrsprossen aus der Pflanze zu entstehen beginnen, verwenden Sie eine halbtransparente Schießtasche, um die Triebe zu bedecken, so dass die entstehenden Seiden beobachtet werden können, ohne den Beutel zu entfernen. Dann bestäubisieren Sie die Pflanzen in der entsprechenden Entwicklungsstufe, wie gezeigt.Die Maisohren werden in der Regel neun bis zwölf Tage nach der Bestäubung geerntet. Unreife Embryonen mit Längen zwischen 1,5 und zwei Millimetern sind die besten Explants für die Transformation für dieses Protokoll. Acht Tage nach der Infektion können ZsGreen-extierende somatische Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden.Die Wärmebehandlung acht Tage nach der Infektion induziert eine crerekombinatore Expression, was zur Exzision der morphogenen Gen-, Cre- und ZsGreen-Expressionskassetten führt, die zwischen den beiden LoxP-Standorten flankiert sind. Nach drei bis vier Wochen Kultur auf Triebbildung Medium mit Herbizid, vermehrenden Geweben mit reifenden Embryonen oder Triebknospen resistent gegen das Herbizid kann beobachtet werden. Einige der herbizidresistenten Gewebe können für ZsGreen negativ sein, was darauf hindeutet, dass in diesen Geweben wahrscheinlich eine kreidevermittelte Exzision aufgetreten ist.Nach der Verschiebung des Gewebes auf Wurzelmedium und leichte Inkubation können gesunde, kräftige, wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln geerntet werden. Beachten Sie, dass einige Gewebe möglicherweise mehrere Triebe haben, die möglicherweise auf klonale Pflanzen mit identischen Transgenintegrationsmustern zurückzuführen sind. Die QuickCorn-Methode kann die Effizienz der Maistransformation erheblich verbessern und die Liste der transformierbaren Genotypen erweitern.Das Protokoll kann von Forschern mit minimaler Maisumwandlung erfolgreich reproduziert werden. Mit der QuickCorn-Methode sollten verwurzelte Pflanzen in nur fünf bis sieben Wochen nach dem Tag der Infektion bereit sein, auf den Boden zu übertragen. Achten Sie auf die mittlere Zusammensetzung, das Timing der Subkulturen und die Temperatur- und Lichtverhältnisse.Die Qualität der Ausgangsstoffe ist auch für eine erfolgreiche Transformation unerlässlich. Die in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien, Bleichlösungen und Herbizide sind biogefährlich. Bitte achten Sie darauf, die entsprechende persönliche Schutzausrüstung während des Gebrauchs zu tragen.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Forschung

Biologie

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Skalierbare Transfektion von Mais-Mesophyll-Protoplasten

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Advancing Gene Editing in Bamboo Leaves for Sustainable Plastic Alternatives (Video) | JoVE

In Planta Genexpression und Gen-Editierung in Moso-Bambusblättern

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...