Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Ringraziamo il team della serra Di Corteva per aver fornito orecchie immature di mais, il laboratorio di preparazione dei media Corteva per aver fornito assistenza nella realizzazione dei media, Ning Wang di Corteva per l'aiuto del costrutto Agrobacterium e Keunsub Lee dell'Iowa State University per assistenza. Questo progetto è stato parzialmente sostenuto dal National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 e 1917138 a K.W., dal programma di ricerca sulle piante predittive Fenomics Research (National Science Foundation Grant DGE-1545453) a J. . . . . #IOW04341 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Alicia Masters, William Gordon-Kamm e Todd Jones sono dipendenti di Corteva Agriscience che ha fornito il protocollo e le orecchie di mais di B73, Mo17 e W22 utilizzate in questo articolo. Gli autori Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob e Kan Wang non hanno nulla da rivelare.

I protocolli tradizionali per la trasformazione del mais seguono il paradigma di isolare gli embrioni zigiti immaturi per produrre tessuto callo sogengenico transgenico, che viene rigenerato in piante fertili4,6. Mentre questo è efficace, protocolli callus-based possono richiedere molto tempo, e spesso ci vogliono fino a 3 mesi per il processo di coltura dei tessuti per produrre piante. Ciò che rende significativo il metodo qui presentato è che è senza callus, efficiente, veloce e consente la rigenerazione delle piante T0 in circa la metà dei tempi. Sembra anche essere meno dipendente dal genotipo e può quindi essere efficace per la maggior parte degli inbred disponibili pubblicamente8,11.
Mentre tutti i passaggi devono essere seguiti in modo efficace, una corretta preparazione dei media di crescita è imperativa. I componenti dei mezzi di crescita devono essere aggiunti nelle fasi corrette, sia pre che post-autoclave, per garantire che il materiale vegetale riceva la corretta concentrazione di sostanze chimiche. Questo garantirà che composti sensibili come antibiotici non si rompono. È inoltre importante che il materiale vegetale sia collocato sul mezzo di crescita corretto in ogni fase, come indicato nel protocollo. Non mettere materiale sul mezzo di crescita corretto può causare la morte materiale. Inoltre, si dovrebbe evitare di mettere troppi embrioni o di sviluppare tessuti su lastre. Mentre il posizionamento di pezzi di tessuto il doppio può risparmiare il costo di sostanze chimiche e piatti Petri (e anche lo spazio di incubatrice), la crescita del tessuto in piastre sovraffollate può essere seriamente inibita. Durante l'esecuzione dell'infezione, dovrebbe essere assicurato che la densità ottica della sospensione Agrobacterium sia appropriata. Se la densità delle sospensioni batteriche è troppo bassa, potrebbe non verificarsi un'infezione corretta.
La qualità dei materiali di partenza è essenziale per il successo nei protocolli di trasformazione. Le orecchie utilizzate per la dissezione dell'embrione devono essere sane, il che significa che la pianta che le produce è sana. Devono anche possedere un set di semi adeguato ed essere privi di parassiti e malattie. Inoltre, il vecchio Agrobacterium non deve essere utilizzato. Il piatto "madre" non dovrebbe essere più di 2 settimane. Dopo questo punto, una nuova piastra "madre" dovrebbe essere striata per iniziare nuovi esperimenti.
Sebbene questo metodo sia meno dipendente dal genotipo, non si può presumere che tutte le righe avranno lo stesso successo. Ci possono ancora essere variazioni tra le linee e differenze di successo in base al costrutto utilizzato. La variabilità da orecchio a orecchio è inevitabile anche quando si lavora con embrioni immaturi, quindi idealmente gli esperimenti dovrebbero usare più orecchie per spiegare questo. In questo lavoro, W22 inbred ha ottenuto il meglio, con una frequenza di trasformazione di oltre il 14%, seguita da B73 e Mo17 (4% ciascuno). Lowe et al.8 ha riferito utilizzando il protocollo QuickCorn per la trasformazione B73 e Mo17. In questo lavoro, le frequenze di trasformazione variavano dal 9%-50% per B73 e dal 15%-35% per Mo17.
Una possibilità per le frequenze di trasformazione più basse per B73 e Mo17 osservate in questo lavoro può essere attribuita alla fluttuazione stagionale della qualità dell'orecchio. Un'altra differenza tra questo lavoro e quello di Lowe et al.8 è che qui sono stati utilizzati diversi costrutti vettoriali. Nel lavoro di Lowe, i geni morfogenici non sono stati rimossi dalle piante trasformate, ma piuttosto silenziati in modo equisì nelle fasi successive. In questo lavoro, i geni morfogenici sono stati rimossi 8 giorni dopo l'infezione. È possibile che B73 e Mo17 possano aver bisogno di una presenza più lunga di Bbm/Wus2 per lo sviluppo di embrioni somatici.
Utilizzando questo metodo, c'è la possibilità di ottenere piante di fuga non transgeniche, inserimenti multimeerici e transgeni non espatriati. Queste piante non avranno un fenotipo notevolmente diverso, quindi è necessario il rilevamento da parte della PCR per determinare se una pianta è transgenica. Per raggiungere questo obiettivo, possono essere impiegati primer PCR all'interno della regione eccitata e primer che fiancheggiano la regione eccitata. Molteplici trasformazioni indipendenti possono anche produrre piante dallo stesso embrione immaturo, rendendo difficile la determinazione del tasso totale di recupero dei trasformativi indipendenti. Il nostro standard è stato quello di calcolare un tasso di trasformazione basato sul campionamento di una pianta da ogni embrione immaturo che produceva piante e dividendolo per il numero di embrioni infetti. Questo metodo sottovaluta quasi certamente il numero effettivo di eventi indipendenti recuperati come piantine. La discriminazione tra eventi indipendenti dello stesso embrione richiede il sequenziamento delle regioni di confine intorno ai transgeni, e questo sarà proibitivo e dispendioso in termini di tempo per la maggior parte delle applicazioni; però, ci possono essere casi in cui questi dati sono utili.
Questo metodo di trasformazione della coltura tissutale si è dimostrato molto efficace, ma i problemi possono ancora verificarsi. Se il materiale vegetale non risponde, è possibile che ci sia un problema con la particolare linea inbred, suggerendo che variabili come la composizione dei media di crescita e i tempi di subcultura richiedano regolazioni. Un'altra variabile è la progettazione corretta del vettore e la costruzione accurata del vettore, se il vettore originale viene modificato. Ci possono essere anche problemi con la sensibilità imazapyr, come alcune linee sono più sensibili di altri, e la concentrazione di imazapyr potrebbe essere necessario essere regolato per raggiungere le piante trasformate con successo.
Negli ultimi 30 anni, la cultura dei tessuti di mais e i protocolli di trasformazione sono cambiati e progrediti; e si ritiene che questo protocollo abbreviato favorirà questa progressione. Questo metodo è efficace per le impostazioni accademiche perché richiede meno tempo rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, non richiede operatori altamente qualificati, il che lo rende più suscettibile alla distribuzione diffusa rispetto ai metodi tradizionali. In futuro, questo metodo può essere combinato con nuove tecnologie come l'ingegneria genomica.

La trasformazione è uno strumento di base per valutare l'espressione genica estranea nel mais e produrre linee di mais geneticamente modificate sia per scopi di ricerca che commerciali. L'accesso alla trasformazione ad alta produttività può facilitare la maggiore necessità di studi di biologia molecolare e cellulare di mais1. La capacità di trasformare geneticamente le specie di colture è vitale sia per i laboratori pubblici che per quelli privati. Ciò consente sia una comprensione fondamentale dei meccanismi di regolazione genica sia un miglioramento delle colture su scala globale per sostenere una popolazione in continua crescita.
La scoperta che gli embrioni immaturi dal mais potrebbero essere utilizzati per la produzione di callo rigenerabile originata nel 19752. Da questa rivelazione, i protocolli di trasformazione del mais più scalabili hanno richiesto la formazione e la selezione del callo prima della rigenerazione3. Durante il processo di trasformazione genetica, gli embrioni immaturi infettati o bombardati biolistici vengono coltivati su supporti per l'induzione del callo embrionale. I calli indotti vengono poi coltivati su supporti selettivi (ad esempio, contenenti un erbicida) in modo che solo i pezzi di callo trasformati siano in grado di sopravvivere. Questi calli transgenici putgenici resistenti agli erbicidi vengono gonfiati e rigenerati in piante. Mentre questo metodo è efficace, il processo è lungo e laborioso, e può richiedere fino a 3 mesi per completare4. Ancora più importante, i protocolli convenzionali di trasformazione del mais possiedono una limitazione molto più ampia, cioè solo un numero limitato di genotipi di mais può essere trasformato5,6.
Lowe et al.7,8 hanno riferito in precedenza un metodo di trasformazione "QuickCorn" che non solo ha ridotto notevolmente la durata del processo di trasformazione, ma ha anche ampliato l'elenco dei genotipi trasformabili. Il metodo QuickCorn utilizza ortolologi di mais (sm-Bbm e zm-Wus2) dei fattori di trascrizione dell'Arabidopsis BABY BOOM (BBM)9 e WUSCHEL (WUS)10. Quando vengono incorporati nel sistema vettoriale di trasformazione, questi geni lavorano sinergicamente per stimolare la crescita embriogenica7.
Il protocollo QuickCorn descritto in questo lavoro si basava sul protocollo in Jones et al11, che è stato un ulteriore miglioramento del metodo riportato da Lowe et al7,8. Nel presente studio, un ceppo di Agrobacterium LBA4404(Thy-) che ospita un costrutto vettoriale binario PHP81430 (Figura 1) e plasmide accessorio PHP7153912 vengono utilizzati per la trasformazione. Il DNA T di PHP81430 contiene i seguenti componenti molecolari. (1) Il gene del marcatore selettivo di trasformazione Hra expression cassette. Il gene di mais Hra èun gene di sinteassi dell'acetolactassi modificato (ALS) che è tollerante agli erbicidi inibitori della SLA come il sulfonylureas e imidazolinones13,14. Il gene sèm-Hra è regolato dal promotore di Sorhum ALS8 e dall'inibitore della proteina di patate II(pinII) terminatore15. Il DNA T contiene anche (2) una cassetta di espressione che possiede il gene marcatore schermato di trasformazione . Questo gene di proteine fluorescenti verdi , sGreen di zoanthus sp. corallo barriera16 è regolato da un sorgomo promotore/intron e riso ubiquitin terminatore.
Inoltre, il DNA T contiene (3) la cassetta di espressione Bbm del gene morfogenico. Bbm è un fattore di trascrizione associato allo sviluppo embrionale9,17. Bbm è regolato dalla proteina trasferiresate di fosfolipidi di mais (Pltp) promotore8 e riso T28 terminator18. Lo zm-Pltp è un gene con una forte espressione nell'epitelio di scutellare embrione, peli di seta e cellule sussidiariche delle foglie (che fiancheggiano le cellule di guardia), bassa espressione negli organi riproduttivi e nessuna espressione nelle radici8. Contiene anche (4) la cassetta dell'espressione Wus2 del gene morfogenico. Wus2 è un altro fattore di trascrizione associato alla manutenzione del meristemapicale 19. Il promotore di mais auxine-inducible di mais (sm-Axig1)20 e il mais In2-1 terminator21. Infine, il T-DNA contiene (5) il sistema di ricombinazione cre-loxP. Il gene22 della crema ricombinase è sotto il controllo della proteina shock termico di mais 17.7 (Hsp17.7)23 promotore e schiacciante dipatate perno II terminatore. Due siti loxP (nello stesso orientamento)24 fiancheggiano quattro cassette di espressione genica, tra cui sGreen, cre, Bbm e Wus2.
Poiché la presenza dei geni morfogenici non è desiderata per la maturità delle piante e la successiva progenie, il sistema di ricombinazione cre-loxP indotto dal calore è stato integrato nel DNA T per rimuovere i geni morfogenici dal genoma del mais per consentire la normale rigenerazione del callo e lo sviluppo delle piante. Durante il trattamento termico, l'espressione della proteina CRE rimuove tutti i transgeni ad eccezione del gene di selezione Hra. I trasformazioni di successo dovrebbero essere resistenti agli erbicidi, ma -negativi per ilverde. Per migliorare ulteriormente la frequenza di trasformazione, il ceppo Agrobacterium ospita anche un plasmide accessorio aggiuntivo (PHP71539) che ha copie extra di geni agrobacterium virulence (vir)12.
Il metodo QuickCorn è diverso dai protocolli convenzionali di trasformazione del mais, in quanto non comporta una fase di induzione del callus durante la trasformazione. Durante la prima settimana dopo l'infezione da Agrobacterium, embrioni somatici si sviluppano sull'epitelio scuereo degli embrioni immaturi infetti. Gli embrioni vengono poi trasferiti su un mezzo con ormoni che incoraggiano la maturazione dell'embrione e la formazione dei germogli. Trasferire rapidamente gli embrioni somatici sul mezzo di maturazione/formazione dei germogli salta lo stadio tradizionale del callo precedentemente utilizzato per la trasformazione del mais e consente la generazione diretta di piante T08. Rispetto ai metodi di trasformazione del mais pubblicati in precedenza6, il metodo QuickCorn è più veloce, più efficiente e meno dipendente dal genotipo. Utilizzando questo metodo, le piante radicate sono in genere pronte per essere trasferite sul suolo in appena 5-7 settimane, piuttosto che i tre o più mesi richiesti dai protocolli tradizionali. Lo scopo di questo articolo è fornire una descrizione approfondita e una dimostrazione del metodo, consentendo una replica più semplice in un ambiente di laboratorio che si trova in genere nella maggior parte delle istituzioni accademiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

Dimostrata qui è un protocollo dettagliato per la trasformazione genetica mediata di lineeinbred di mais con geni morfogenici Baby boom (Bbm) e Wuschel2 (Wus2). Bbm è regolato dal promotore del gene del puritacolo di mais (Pltp) e Wus2 è sotto il controllo di un promotore indotto da auxina di mais (Axig1). Un ceppo di Agrobacterium che trasporta questi geni morfogeni sul DNA di trasferimento (T-DNA) e copie extra di virulenza di Agrobacterium (vir) sono utilizzati per infettare espiante embrionali immature di mais. Gli embrioni somatici si formano sulla scutella degli embrioni infetti e possono essere selezionati dalla resistenza agli erbicidi e germinati in piante. Un sistema di ricombinazione cre/loxP attivato a caldo integrato nel costrutto del DNA consente di rimuovere i geni morfogeni dal genoma del mais durante una fase iniziale del processo di trasformazione. Le frequenze di trasformazione di circa il 14%, 4% e 4% (numero di eventi transgenici indipendenti ogni 100 embrioni infetti) possono essere raggiunte rispettivamente per W22, B73 e Mo17 utilizzando questo protocollo.

Divenuto qui è un protocollo passo-passo per la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium- di tre linee pubbliche di mais (B73, Mo17 e W22) che sono state significative nel campo della genetica del mais. La trasformazione delle tre linee inbred non è stato possibile ottenere utilizzando protocolli convenzionali di trasformazione del mais5. Figura 1 e Figura 2 Mostra il costrutto e materiali di partenza, rispettivamente, utilizzato qui. Le orecchie sono generalmente raccolte 9-12 giorni dopo l'impollinazione. Le IE con lunghezze comprese tra 1,5-2,0 mm sono i migliori espianti per la trasformazione per questo protocollo (Figura 2).
Otto giorni dopo l'infezione, gli embrioni somatici che esprimono il green sono stati visualizzati sotto il canale GFP di un microscopio fluorescente (Figura 3). Le IE infette sono state sottoposte a trattamento termico 8 giorni dopo l'infezione (passaggi 5.1 e 5.2). Questo trattamento ha indotto l'espressione di RIcombinante CRE che ha esitato le cassette di espressione Bbm, Wus2, cree sGreen affiancate tra i due siti loxP (Figura 1). I tessuti trattati termicamente sono stati poi coltivati su un mezzo di formazione di germogli contenente l'erbicida imazapyr per la selezione del tessuto trasformato dopo la rimozione del gene morfogenico.
Tessuti che proliferano con embrioni in maturazione o germogli di tiro resistenti all'imazapyr sono stati osservati circa 3-4 settimane dopo l'infezione (Figura 4). Alcuni tessuti imazapyr-resistente erano negativi per sGreen, suggerendo chel'escissione mediata cremata probabilmente si è verificato in questi tessuti (Figura 4). Dopo che i tessuti sono stati spostati nel mezzo di radicamento e nell'incubazione leggera, i germogli hanno iniziato a svilupparsi (Figura 5). Sono stati raccolti germogli di crescita sani e vigorosi con radici ben sviluppate (Figura 5). Alcuni tessuti sembravano avere più germogli (Figura 5E,F,G). Questo tipo di rigenerazione "erba" può essere dovuto alle piante clonali che hanno modelli identici di integrazione transgenica. Per genotili queste piante è necessaria un'analisi biologica molecolare.
Tutte e tre le linee pubbliche inbred hanno risposto bene utilizzando questo protocollo così come il costrutto utilizzato in questo lavoro. W22 ha prodotto la più alta frequenza di germogli resistenti agli imazapyr, con una frequenza di circa il 14% (circa 14 germogli transgenici per 100 embrioni immaturi infetti). Sia B73 che Mo17 hanno prodotto circa il 4% di germogli transgenici. Queste frequenze indicano tutti i germogli transgenici, comprese entrambe le piante che trasportano i geni morfogenici e le piante con il gene morfogenico rimosso dall'escissione mediata dal CRE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della regione T-DNA del plasmide binario PHP81430. RB - bordo destra T-DNA; loxP - sito di destinazione ricombinano CRE; Axig1pro:Wus2 - promotore auxina inducibile di mais (.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pltppro:Proteina promotrice di trasferimentodi fosforesi di mais ( , ) promotrice di mais ()- sm-Bbm , riso T28 terminatore (Os-T28); Hsppro: cre -promotrice di shock termico di mais 17,7 (sm-Hsp17.7) , gene ricombinante della crema , inibitore della proteina di patate II (pinI)terminatore; Ubipro:sGreen , sorghum ubiquitin promotore/intron (Sb-Ubi) , proteina fluorescente verde , gene verde , terminatore di ubiquitina di riso (Os-Ubi); Hra cassetta - sorghum acetolactase synthase (Sb-Als) promotore di mais Hra (sm-Hra) - terminatore pinII; LB - bordo T-DNA sinistro; colE1, origine replicare del plasmide ColE125; SpecR - Gene resistente alla spettronomina aadA1 da Tn21 per la selezione del batterio26; Rep A,B,C - origine della replica da pRiA4 di Agrobacterium rhizogenes27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> Figura 2: Materiali di partenza. Orecchie B73 raccolte 12 giorni dopo l'impollinazione (A). Embrioni immaturi di B73 (B), Mo17 (C) e W22 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> Figura 3: Sviluppo dei tessuti su media a riposo 1 settimana dopo l'infezione. Embrioni (8 giorni dopo l'infezione) al microscopio a florescenza (filtro GFP) che mostra GFP che esprime embrioni somatici di Mo17 (A) e W22 (B). Tessuto in via di sviluppo (B73) sotto il campo luminoso (C) e il filtro GFP (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> Figura 4: Sviluppo dei tessuti sul mezzo di maturazione con selezione. Piastra di maturazione W22 (A). Tessuto in via di sviluppo (Mo17, 15 giorni dopo l'infezione) sotto il filtro a campo luminoso (B) e GFP (C). Tessuto in via di sviluppo (Mo17, 28 giorni dopo l'infezione) sotto il filtro a campo luminoso (D) e GFP (E). Le frecce indicano la rigenerazione dei tessuti che mancano di espressione GFP, suggerendo l'escissione del gene verde tra i siti loxP dopo l'attività proteica CRE indotta dal calore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> Figura 5: Sviluppo di tessuti su supporti radicanti. Spara di W22 (A), B73 (B) e Mo17 (C,D). Evento con più germogli (rigeneranti erbosi) di B73 (E) e W22 (F,G). Spara con radici di B73 (H) e W22 (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Composizioni multimediali per la trasformazione del mais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>

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Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

I geni morfogenici delle piante possono essere utilizzati per migliorare la trasformazione genetica dei genotipi recalcitranti. Descritto qui è un protocollo di trasformazione genetica mediata agrobatterica(QuickCorn) per tre importanti linee pubbliche di mais.

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

La maggior parte delle linee di mais inbred non può essere trasformata geneticamente utilizzando protocolli di trasformazione convenzionali. Qui viene descritto un metodo di trasformazione QuickCorn che è veloce e meno dipendente dal genotipo. Il metodo QuickCorn utilizza i fattori di trascrizione del mais BABY BOOM e WUSCHEL.Quando incorporati nel sistema vettoriale di trasformazione, questi geni lavorano sinergiticamente per stimolare la crescita embriogenica. A differenza dei protocolli convenzionali di trasformazione del mais, il metodo QuickCorn non comporta una fase di induzione del callo durante la trasformazione. La regione T-DNA del vettore binario utilizzato nel nostro lavoro contiene tre componenti chiave, geni morfogenici, geni marcatori e il sistema di ricombinazione cre/loxP.Il sistema di ricombinazione cre/loxP indotto dal calore è stato incluso nel T-DNA per rimuovere i geni morfogenici dal genoma del mais per consentire la normale rigenerazione del callo nello sviluppo delle piante. Circa due o tre giorni dopo l'emergere delle sete e se il polline sarà disponibile il giorno seguente, tagliare le sete e la buccia con forbici sterilizzate con etanolo al 70%, circa 2 1/2 centimetri sotto l'estremità delle foglie della buccia, dove emergono le sete, e coprire la seta con un sacchetto di germogli. Una volta che le anthers emergono da una nappa, coprire la nappa con un sacchetto di nappa e posizionare una graffetta non skid alla base del sacchetto intorno al gambo.La mattina dopo aver posizionato il sacchetto della nappa, piegare delicatamente la pianta e toccare il sacchetto per incoraggiare il rilascio di polline. Quindi rimuovere il sacchetto di nappa e piegare la parte superiore della borsa per evitare che il polline fuorievi. Per impollinare una pianta ricevente, esporre le sete e versare rapidamente il polline dal sacchetto di nappa sulle sete.Coprire immediatamente l'orecchio impollinato con il sacchetto di nappa e fissare la base del sacchetto intorno al gambo con graffette. Per controllare la dimensione dell'embrione immaturo, da nove a 12 giorni dopo l'impollinazione, tirare delicatamente giù la buccia per esporre i chicchi a circa 1/3 a 1/4 della circonferenza dell'orecchio e circa 1/3 della distanza lungo l'orecchio. Usa un bisturi per tagliare il tappo di un singolo kernel che appare simile alla maggior parte degli altri chicchi per dimensioni e colore, e usa una spatola con un righello per estrarre l'embrione.Quindi utilizzare il righello o una pinza per misurare la lunghezza dell'embrione. Entro uno o quattro giorni dalla raccolta, rimuovere le bucce e le sete dalle orecchie raccolte e inserire un manico appropriato nella parte superiore o nella base di ogni orecchio. Immergere le orecchie in un grande contenitore di soluzione di candeggina di disinfezione in un cappuccio a flusso laminare sterile con la maniglia rivolta verso l'alto.Dopo 20 minuti, sciacquare le orecchie tre volte con un generoso volume di acqua distillata sterile fresca per cinque minuti per lavaggio prima di lasciare asciugare le orecchie per diversi minuti. Quindi, riempire un tubo di microcentrifugo a due millilitri per orecchio con mezzo liquido 700A e utilizzare un bisturi sterile per rimuovere da uno a due millimetri superiore di ogni corona del nocciolo per esporre l'endosperma dell'orecchio. Individuare l'embrione immaturo all'interno del nocciolo sul lato rivolto verso la punta dell'orecchio, vicino all'attacco alla sfera.Per gli operatori top handler e destrorso, appoggia l'orecchio su una grande piastra di Petri sterile e inserisci una micro spatola nell'endosperma nel pericarpo più lontano dall'embrione. Torcere delicatamente verso l'alto per rimuovere l'endosperma e esporre l'embrione e utilizzare la spatola per posizionare con cura l'embrione in un tubo di mezzo liquido 700A. Per gli operatori del conduttore di base che tengono l'orecchio con la mano sinistra, inserire una micro spatola nell'endosperma nel pericarpo più lontano dall'embrione e torcere delicatamente verso l'alto per spostare l'endosperma.Per coltura degli embrioni in una coltura di sospensione agrobatterio, raccogliere batteri da una piastra di lavoro preparata al momento in 10 millilitri di mezzo liquido 700A e vortice per sospendere completamente la coltura batterica. Misurare la densità ottica ad una lunghezza d'onda di 550 nanometri e lavare gli embrioni con un millilitro di mezzo fresco 700A. Immergere gli embrioni in un millilitro di sospensione Agrobacterium e vortice su un ambiente basso per 30 secondi.Depositare gli embrioni sul banco con i tubi in orientamento orizzontale per cinque minuti prima di trasferire l'intero contenuto di ogni tubo su singole piastre di mezzo di co-coltivazione da 562V. Ruotare delicatamente le piastre per distribuire gli embrioni in modo uniforme e aspirare la sospensione agrobatterio in eccesso. Orientare attentamente gli embrioni con il lato a forma di cupola rivolto verso l'alto, facendo attenzione a evitare di danneggiare gli embrioni.Quindi posizionare le piastre in scatole di plastica per un'incubazione notturna a 21 gradi Celsius al buio. La mattina dopo, trasferire accuratamente embrioni infetti su mezzo di riposo 605T, posizionare circa 30 embrioni per piastra, lato scutello verso l'alto, per un'incubazione da quattro a 10 giorni a 26 gradi Celsius al buio. A circa sette giorni, lo sviluppo somatico dell'embrione può essere osservato sulla superficie dello scutello zigotico.Alla fine del periodo di riposo, posizionare la scatola degli embrioni in un incubatore Celsius di 45 gradi con umidità relativa del 70% per due ore, seguita da un'incubazione da una a due ore a 26 gradi Celsius al buio. Alla fine dell'incubazione, posizionare da 10 a 15 embrioni immaturi scioccati dal calore su singole piastre di mezzo di formazione del germoglio integrate con 05 milligrammi per litro dell'erbicida imazapyr come agente selettivo. Rimuovere con cura eventuali coleoptile in base alle esigenze e riportare gli embrioni all'incubatore scuro Celsius di 26 gradi per due settimane.Alla fine dell'incubazione, trasferire circa otto pezzi di tessuto per piastra su piastre medie di radicamento per un'incubazione da una a due settimane con 16 ore di luce e otto ore di buio a 27 gradi Celsius. Man mano che le plantle si sviluppano, posiziona una plantlet più forte contenente sia germogli che radici vigorose su singole piastre di mezzo radicante sotto la luce per altri sette-14 giorni. Lasciare che i germogli che non sono completamente sviluppati siano incubati sullo stesso mezzo per un'altra o due settimane fino a quando non sono pronti per essere spostati nel terreno.Man mano che la pianta diventa più vigorosa, sciacquare le radici con acqua del rubinetto per rimuovere l'agar. Quindi trapiantare le singole piante in vasi da tre pollici contenenti un substrato senza suolo pre-bagnato in un vassoio con fori di scarico e posizionare il vassoio in una camera di crescita con o senza cupola di umidità plastica. Da nove a 14 giorni dopo il trasferimento in vaso, trapiantare ogni plantlet con il terreno in una pentola da 1,5 galloni.Aggiungere un fertilizzante a rilascio controllato alla pentola e mantenere le piante nella serra. Quando i germogli auricolari iniziano a emergere dalla pianta, usa una borsa da sparo semitrasparente per coprire i germogli in modo che le sete emergenti possano essere osservate senza rimuovere la borsa. Quindi impollinare le piante nella fase appropriata di sviluppo come dimostrato.Le orecchie di mais vengono generalmente raccolte da nove a 12 giorni dopo l'impollinazione. Embrioni immaturi con lunghezze che vanno da 1,5 a due millimetri sono i migliori espianto per la trasformazione per questo protocollo. Otto giorni dopo l'infezione, gli embrioni somatici che esprimono ZsGreen possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza.Il trattamento termico otto giorni dopo l'infezione induce l'espressione della cre ricombinasi, con conseguente escissione delle cassette di espressione del gene morfogenico, cre e ZsGreen affiancate tra i due siti loxP. Dopo tre o quattro settimane di coltura su un mezzo di formazione di germogli contenente erbicida, si possono osservare tessuti proliferi con embrioni maturi o gemme di germogli resistenti all'erbicida. Alcuni dei tessuti resistenti agli erbicidi possono essere negativi per ZsGreen, suggerendo che l'escissione cre-mediata si sia probabilmente verificata in questi tessuti.Dopo aver trasferito i tessuti al mezzo di radicamento e all'incubazione leggera, è possibile raccogliere germogli sani, vigorosi e in crescita con radici ben sviluppate. Si noti che alcuni tessuti possono sembrare avere più germogli probabilmente a causa di piante clonali con schemi di integrazione transgene identici. Il metodo QuickCorn può migliorare notevolmente l'efficienza di trasformazione del mais ed espandere l'elenco dei genotipi trasformabili.Il protocollo può essere riprodotto con successo dai ricercatori con una formazione minima sulla trasformazione del mais. Utilizzando il metodo QuickCorn, le piante radicate dovrebbero essere pronte per il trasferimento al suolo in sole cinque o sette settimane dopo il giorno dell'infezione. Prestare attenzione alla composizione media, alla tempistica delle sottoculture e alle condizioni di temperatura e illuminazione.La qualità delle materie prime è essenziale anche per una trasformazione di successo. Le sostanze chimiche, la soluzione di candeggina e l'erbicida utilizzati in questo protocollo sono pericolosi per il rischio biologico. Si prega di assicurarsi di indossare l'attrezzatura di protezione personale appropriata durante il loro utilizzo.

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