Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

私たちは、トウモロコシの未熟な耳を提供してくれたコルテバ温室チーム、メディアを作るための支援を提供するためのコルテバメディア準備ラボ、アグロバクテリウム構造の助けを求めてコルテバからニンワン、アイオワ州立大学のキューサブ・リーに支援を提供してくれたことに感謝します。このプロジェクトは、国立科学財団植物ゲノム研究プログラムがK.W.に1725122と1917138を与え、予測植物フェノミクス研究研修プログラム(国立科学財団グラントDGE-1545453)からJ.Z #IOW04341.に部分的に支援されました。

<ol>
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アリシア・マスターズ、ウィリアム・ゴードン・カム、トッド・ジョーンズは、この記事で使用されているB73、Mo17、およびW22のプロトコルとトウモロコシの耳を提供したコルテバ・アグリサイエンスの従業員です。著者のミンジョン・カン、モーガン・マッコー、ジェイコブ・ゾブリスト、カン・ワンは何も開示していない。

トウモロコシ変換のための伝統的なプロトコルは、未熟な接合性胚を単離してトランスジェニックカルス組織を生成するというパラダイムに従い、これは肥沃な植物4、6に再生される。これは効果的ですが、カルスベースのプロトコルは時間がかかり、組織培養プロセスが植物を生産するのに最大3ヶ月かかることがよくあります。ここで提示された方法が重要なのは、コールスフリーで効率的で迅速であり、約半分の時間枠でT0植物の再生を可能にすることです。また、遺伝子型依存性が低いように見えるので、ほとんどの公的に入手可能な近親交配8,11に有効です。
すべての手順を効果的に実行する必要がありますが、成長メディアの正しい準備が不可欠です。成長培地成分は、植物材料が化学物質の適切な濃度を受け取ることを確実にするために、前と後の両方のオートクレーブの正しい段階で添加する必要があります。これは、抗生物質のような敏感な化合物が分解しないことを保証します。また、プロトコルに示すように、各段階で植物材料を正しい成長培地に配置することも重要です。適切な成長媒体に材料を置かないと、物質的な死を引き起こす可能性があります。さらに、あまりにも多くの胚を置くか、プレート上の組織を開発することは避けるべきです。2倍の組織片を置くことは、化学物質やペトリ皿(さらにはインキュベータースペース)のコストを節約することができますが、過密プレート内の組織の成長は深刻に阻害される可能性があります。感染を行う間、アグロバクテリウム懸濁液の光学密度が適切であることを保証すべきである。細菌懸濁液密度が低すぎると、適切な感染が起こらない可能性があります。
出発材料の品質は、変換プロトコルの成功に不可欠です。胚解剖に使用される耳は健康でなければならず、それらを産生する植物は健康であることを意味する。彼らはまた、適切な種子セットを所有し、害虫や無病でなければなりません。また、古いアグロバクテリウムは使用しないでください。「母」プレートは生後2週間以下でなければなりません。この時点で、新しい実験を開始するために、新しい「母」プレートをストリークする必要があります。
この方法は、より少ない遺伝子型依存であることが示されているが、すべての行が等しく成功するとは考えられない。使用されているコンストラクトに基づく成功の違いだけでなく、ライン間の変動が依然として存在する可能性があります。未熟な胚を扱う場合、耳から耳への変動も避けられないので、理想的には複数の耳を使ってこれを考慮する必要があります。この研究では、近交配W22が最高のパフォーマンスを発揮し、〜14%以上の変換頻度で、次いでB73とMo17(各約4%)が続いた。Loweら8は、B73およびMo17変換のためのクイックコーンプロトコルを使用して報告した。この作業では、変換周波数はB73の場合は9%から50%、Mo17では15%~35%の範囲でした。
この研究で観察されたB73およびMo17の低い変換周波数の1つの可能性は、季節的な耳の品質変動に起因する可能性がある。Loweら8のこの作品との違いは、ここで異なるベクトル構築物が使用された点です。ロウの研究では、形態素遺伝子は形質転換された植物から取り除かれたのではなく、後の段階で発達的に沈黙した。この研究では、形態素遺伝子は感染後8日後に除去された。B73とMo17は、体細胞胚の発生のためにBbm / Wus2のより長い存在を必要とする可能性があります。
この方法を用いて、非トランスジェニックエスケープ植物、多量体挿入、および非興奮性トランスジーンを得る可能性がある。これらの植物は顕著に異なる表現型を有しないので、PCRによる検出は、植物がトランスジェニックであるかどうかを判断するために必要とされます。これを達成するために、切除領域内のPCRプライマーおよび切除領域に隣接するプライマーを採用することができる。複数の独立した形質転換は、同じ未熟な胚から植物を産生することもできるので、全独立形変容体の回復速度の決定は困難である。私たちの基準は、植物を生産した各未熟胚から1つの植物をサンプリングし、これを感染した胚の数で割ることに基づいて形質転換率を計算することでした。この方法は、プラントレットとして回収された独立したイベントの実際の数をほぼ確実に過小評価しています。同じ胚からの独立した事象間の差別は、トランスジーンの周りの境界領域をシーケンシングする必要があり、これはほとんどのアプリケーションにとって非常に高価で時間がかかります。ただし、これらのデータが役立つ場合もあります。
この組織培養変換の方法は非常に有効であることが証明されていますが、問題は依然として発生する可能性があります。植物材料が応答しない場合、特定の近交線に問題がある可能性があり、成長培地組成やサブカルリングのタイミングなどの変数が調整を必要とすることを示唆している。元のベクトルが変更された場合、もう一つの変数は、適切なベクトル設計と正確なベクトル構築です。いくつかのラインは他のものよりも敏感であり、イマザピルの濃度は正常に形質転換された植物を達成するために調整する必要があるかもしれないので、イマザピル感受性にも問題があるかもしれません。
過去30年間で、トウモロコシ組織培養および形質転換プロトコルは変化し、進歩してきました。この短縮されたプロトコルは、この進行をさらに進めると考えられています。この方法は、従来の方法よりも時間がかからず、学術的な設定に有効です。また、高度な訓練を受けたオペレータを要求しないため、従来の方法と比較して広範囲に分布することがより適しています。今後、この方法はゲノム工学などの新しい技術と組み合わせることができます。

形質転換は、トウモロコシの外来遺伝子発現を評価し、研究と商業目的の両方で遺伝子組み換えトウモロコシラインを生産するための基本的なツールです。高スループット変換へのアクセスは、トウモロコシ分子および細胞生物学研究の必要性の増加を促進することができます1.作物種を遺伝的に変換する能力は、公立および民間の両方の研究所にとって不可欠です。これにより、遺伝子調節メカニズムの基本的な理解と、増え続ける人口を支える地球規模での作物改善の両方が可能になります。
トウモロコシからの未熟な胚が生殖可能なカルスの産生に使用できるという発見は、1975年2年に始まった。この啓示以来、ほとんどのスケーラブルなトウモロコシ変換プロトコルは、再生3の前にカルスの形成と選択を必要としてきました。遺伝的形質転換の過程で、アグロバクテリウム感染または生物的爆撃を受けた未熟胚は、胚発生カルス誘導のために培地上で培養される。誘発されたカリは、選択的培地(例えば、除草剤を含む)で培養され、変換されたカルス片だけが生き残ることができるようになる。これらの除草剤耐性推定トランスジェニックカリは、増量され、植物に再生されます。この方法は有効ですが、プロセスは長く、労働集約的であり、4を完了するのに3ヶ月以上かかることがあります。さらに重要なことに、従来のトウモロコシ変換プロトコルははるかに大きな制限を有し、すなわち、限られた数のトウモロコシ遺伝子型のみが5,6に変換できる。
Lowe et al.7,8は、変換プロセスの期間を大幅に短縮するだけでなく、変換可能な遺伝子型のリストを拡張した "QuickCorn" 変換方法を以前に報告しました。クイックコーン法は、赤対数転写因子ベビーブーム(BBM)9およびWUS(WUS)10のトウモロコシオルソログ(Zm-BbmおよびZm-Wus2)を利用する。形質転換ベクター系に組み込まれると、これらの遺伝子は、胚発生成長を刺激するために相乗的に働く7。
この作品で説明したQuickCornプロトコルはジョーンズら11のプロトコルに基づいており、Lowe etal7,8によって報告された方法のさらなる改善であった。本研究では、バイナリベクトル構造PHP81430(図1)とアクセサリープラスミドPHP7153912を有するアグロバクテリウム株LBA4404(Thy-)を変換に使用している。PHP81430のT-DNAには、以下の分子成分が含まれています。(1)形質転換選択的マーカー遺伝子Hra発現カセット。このトウモロコシのフラ(Zm-Hra)遺伝子は、スルホニル尿素およびイミダゾリノン類などのALS阻害除草剤に耐性のあるアセトルラクターゼ(ALS)遺伝子を13、14に変更した。Zm-Hra遺伝子はソルガムALSプロモーター8およびジャガイモプロテイナーゼ阻害剤II(ピンII)ターミネータ15によって調節される。T-DNAには、(2)形質スクリーンマーカー遺伝子ZsGreenを有する発現カセットも含まれる。この緑色蛍光タンパク質遺伝子ZsGreenはゾアンサスspサンゴ礁16から、ソルガムユビキチンプロモーター/イントロンおよび米ユビキチンターミネーターによって調節される。
また、T-DNAには(3)形態素性遺伝子Bbm発現カセットが含まれる。Bbmは、胚発生9、17に関連する転写因子である。Bbmは、トウモロコシリン脂質トランスファーーゼタンパク質(Pltp)プロモーター8および米T28ターミネーター18によって調節される。Zm−Pltpは、胚スキュテラー上皮、絹毛、および葉子会社細胞(ガード細胞に隣接する)において強い発現を有する遺伝子であり、生殖器官における低発現、および根8における発現がない。また、(4)形態素遺伝子Wus2発現カセットを含有する。Wus2は、尖部メリステム19の維持に関連する別の転写因子である。Zm-Wus2は、トウモロコシオーキシン誘導性プロモーター(Zm-Axig1)20およびトウモロコシIn2-1ターミネーター21の制御下にある。最後に、T-DNAは(5)cre-loxP再結合系を含む。 また、cre recombinase遺伝子22は、トウモロコシ熱ショックタンパク質17.7(Hsp17.7)23プロモーター及びポテトピンIIターミネーターの制御下にある。2つのloxP部位(同じ向き)24はZsGreen、cre、BbmおよびWus2を含む4つの遺伝子発現カセットを隣接する。 
形態形成遺伝子の存在は植物の成熟とその後の子孫には望まれていないため、熱誘発性cre-loxP組み換えシステムがT-DNAに組み込まれ、正常なカルスの再生と植物の発達を可能にするためにトウモロコシゲノムから形態形成遺伝子を除去しました。熱処理の際、CREタンパク質の発現は、Hra選択遺伝子を除くすべての遺伝子のトランス遺伝子を除去する。成功した形質転換体は除草剤耐性であるべきであるが、ZsGreen-陰性である。形質転換頻度をさらに高めるために、アグロバクテリウム株はまた、アグロバクテリウム病原(vir)遺伝子12の余分なコピーを有する追加の付属プラスミド(PHP71539)を収容する。
QuickCornメソッドは、変換中にカルス誘導ステップを伴わないため、従来のトウモロコシ変換プロトコルとは異なります。アグロバクテリウム感染後の最初の週に、体細胞胚は感染した未熟な胚のスキュテーラー上皮に発生する。その後、胚は胚の成熟と芽形成を促すホルモンを持つ培地に移される。体細胞胚を急速に成熟/撃つ形成媒体に移すため、トウモロコシの形質転換に以前に使用されていた伝統的なカルス段階をスキップし、T0植物8の直接生成を可能にする。以前に公開されたトウモロコシ変換法6と比較して、QuickCorn法はより速く、より効率的で、より少ない遺伝子型依存である。この方法を使用して、根付いた植物は、通常、従来のプロトコルで必要とされる3ヶ月以上ではなく、わずか5〜7週間で土壌に移す準備ができています。この記事の目的は、この方法の詳細な説明とデモンストレーションを提供し、ほとんどの学術機関で一般的に見られる実験室の設定で簡単に複製できるようにすることです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

ここで実証されたアグロバクテリウム媒介性遺伝子の近交線の形態形成遺伝子ベビーブーム(Bbm)とWuschel2(Wus2)を使用した間近線の詳細なプロトコルである。Bbmは、トウモロコシリン脂質トランスファーゼ遺伝子(Pltp)プロモーターによって調節され、Wus2はトウモロコシオーキシン誘導性(Axig1)プロモーターの制御下にある。これらの形態形成遺伝子を移動DNA(T-DNA)に搭載するアグロバクテリウム株とアグロバクテリウム病原(vir)遺伝子の余分なコピーは、未熟な胚のトウモロコシに感染するために使用されます。体細胞性胚は、感染した胚のスキューテラ上に形成され、除草剤耐性によって選択され、植物に発芽することができる。DNAコンストラクトに組み込まれた熱活性化cre/loxP組換えシステムにより、形質転換プロセスの初期段階でトウモロコシゲノムから形態素遺伝子を除去することができます。このプロトコルを使用して、W22、B73、Mo17に対して、約14%、4%、および4%(感染した100個の感染した胚当たりの独立したトランスジェニック事象の数)の変換頻度をそれぞれ達成することができる。

ここで実証されたのは、トウモロコシ遺伝学の分野で重要であった3つの公共トウモロコシ近交系(B73、Mo17、およびW22)のアグロバクテリウム媒介遺伝変換のためのステップバイステップのプロトコルです。3つの近親線の変換は、従来のトウモロコシ変換プロトコル5を使用して達成できませんでした。図1と図2は、ここで使用される構成材料と出発材料をそれぞれ示しています。耳は一般的に受粉後9-12日後に収穫される。1.5 ~ 2.0 mm の範囲の長さの IZ は、このプロトコルの変換に最適なエクスプラントです (図 2)。
感染から8日後、ZsGreen-発現体細胞胚を蛍光顕微鏡のGFPチャネルで可視化した(図3)。感染したIZEsは、感染後8日後に熱処理を行った(ステップ5.1および5.2)。この治療は、2つのロクスプ部位の間に挟まれたBbm、Wus2、cre、及びZsGreen発現カセットを摘出するCREリコンビナーゼの発現を誘導した(図1)。 熱処理された組織は、形態素遺伝子除去後の形質転換組織の選択のために除草剤イマザピルを含む芽形成培地上で培養した。
イマザピルに耐性であった成熟胚または芽を有する増殖組織は、感染後3〜4週間前後で観察された(図4)。いくつかのイマザピル耐性組織はZsGreenに対して陰性であり、これらの組織でcre-媒介切除が起こりそうな可能性が示唆されている(図4)。組織を発根培地と光インキュベーションに移動した後、撃ち子が発達し始めた(図5)。よく発達した根を持つ健康で活発な成長の芽を収穫した(図5)。いくつかの組織は、複数の芽を持っているように見えました (図 5E,F,G).このタイプの「草むし」再生は、同一の遺伝子導入パターンを有するクローン植物に起因し得る。これらの植物を遺伝子型化するには分子生物学的分析が必要である。
3つのパブリック近親交配ラインはすべて、このプロトコルとこの作業で使用される構造を使用してうまく反応しました。W22は、イマザピル耐性芽の最も高い頻度を産生し、頻度は約14%(感染した100個の未熟胚あたり約14個のトランスジェニック芽)を有する。B73とMo17の両方が約4%のトランスジェニック芽を生成しました。これらの周波数は、形態形成遺伝子を運ぶ植物とCRE媒介性切除によって除去された形態形成遺伝子を有する植物の両方を含むすべてのトランスジェニック芽を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> 図1:バイナリプラスミドPHP81430のT-DNA領域の概略図RB = 右 T-DNA 境界;loxP = CREリコンビナーゼターゲットサイト;Axig1プロ:Wus2 = トウモロコシオーキシン誘導プロモーター (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + トウモロコシIn2-1ターミネーター;Pltpプロ:Zm-Bbm = トウモロコシリン脂質トランスファーゼタンパク質 (Zm-Pltp) プロモーター + Zm-Bbm + 米T28ターミネーター (Os-T28);Hsppro:cre = トウモロコシ熱ショックタンパク質 17.7 プロモーター (Zm-Hsp17.7) + cre recombinase遺伝子 + ポテトプロテイナーゼ阻害剤 II (pinII) ターミネーター;ウビプロ:ZsGreen = ソルガムユビキチンプロモーター/イントロン (Sb-Ubi) + 緑色蛍光タンパク質ZsGreen遺伝子 + 米ユビキチンターミネーター (オス-Ubi);フラカセット = ソルガムアセトルラクターゼ合成酵素 (Sb-Als) プロモーター + トウモロコシフラ (Zm-Hra) 遺伝子 + pinIIターミネーター;LB = 左 T-DNA 境界;colE1,プラスミドの複製起源 ColE125;スペックR=菌選択のためのTn21からのスペクチノマイシン耐性遺伝子aadA1 26;Rep A,B,C =アグロバクテリウム・リゾゲネス27のpRiA4からの複製起源.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> 図2:出発資料B73耳は12日後の受粉後に収穫しました (A).B73 (B) 、 Mo17 (C) 、 W22 (D) の未熟な胚<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> 図3:感染後1週間の安静培地の組織発達胚(感染後8日)を蛍光顕微鏡下で(GFPフィルター)、Mo17(A)およびW22(B)の体細胞胚を発現するGFPを示す。明視野下で組織(B73)を開発する(C)およびGFPフィルター(D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> 図4:選択を伴う成熟培地の組織の発達W22成熟プレート (A)明視野(B)およびGFPフィルター(C)の下で組織(Mo17、感染後15日間)を発症する。明視野(D)およびGFPフィルター(E)の下で組織(Mo17、感染後28日間)を発症する。矢印は、GFP発現を欠いている組織を再生することを指し、熱誘発CREタンパク質活性の後のloxP部位間のZsGreen遺伝子の切除を示唆している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> 図5:根付きメディアの組織の発達W22 (A) 、 B73 (B) 、および Mo17 (C,D) のシュートB73 (E) と W22 (F,G) の複数のシュート (草の再生) を伴うイベント。B73(H)と W22 (I) のルーツを持つシュート<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1: トウモロコシ変換のためのメディアコンポジション<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">この表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>

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Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

植物形態素遺伝子は、再生成遺伝型の遺伝子変換を改善するために使用することができる。ここに記載されているのは、3つの重要な公共トウモロコシ近交線のためのアグロバクテリウム媒介遺伝形質転換(QuickCorn)プロトコルである。

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

ほとんどのトウモロコシ近親交配ラインは、従来の変換プロトコルを使用して遺伝的に変換することはできません。ここでは、迅速で遺伝子型依存性の低い QuickCorn 変換方法について説明します。クイックコーン法は、メイズ転写因子ベビーブームおよびWUSCHELを利用する。形質転換ベクター系に組み込まれると、これらの遺伝子は、胚発生の成長を刺激するために相乗的に働く。従来のトウモロコシ変換プロトコルとは異なり、QuickCorn法では変換時にカルス誘導ステップを伴いません。我々の研究で用いられるバイナリベクターのT-DNA領域には、モルフォジェネ生成遺伝子、マーカー遺伝子、cre/loxP組換えシステムの3つの重要な構成要素が含まれています。熱誘発cre/loxPの組換えシステムは、植物の発達における正常なカルス再生を可能にするために、トウモロコシゲノムから形態素遺伝子を除去するためにT-DNAに含まれていた。シルクが出現し、翌日花粉が利用可能になった場合は、シルクが出現する殻の葉の端から約2 1/2センチメートル下の70%エタノール滅菌ハサミでシルクと殻をカットし、シルクをシュートバッグで覆います。タンセルからアンサーが現れたら、タッセルをタッセルバッグで覆い、茎の周りのバッグのベースにスキッドペーパークリップを置きます。タッセルバッグを置いた翌朝、植物をそっと曲げ、袋をタップして花粉の放出を促します。その後、タッセルバッグを取り出し、花粉が逃げるのを防ぐためにバッグの上部を折ります。レシピエント植物を受粉するには、絹を露出させ、すぐに絹の上にタッセルバッグから花粉を注ぎます。すぐに受粉した耳をタッセルバッグで覆い、ステープルで茎の周りのバッグのベースを固定します。受粉後9~12日後の未熟な胚の大きさを確認するには、殻をそっと引き下げて、耳の周りの約1/3〜1/4、耳の下の距離の約1/3でカーネルを露出させる。メスを使用して、サイズと色の他のカーネルの大部分に似ているように見える単一のカーネルのキャップをスライスし、胚を抽出するために定規とヘラを使用します。次に、定規またはキャリパーを使用して胚の長さを測定します。収穫から1~4日以内に、収穫した耳から殻と絹を取り出し、各耳の上部またはベースに適切なハンドルを挿入します。ハンドルを上に向けた無菌層流れフードに消毒漂白剤溶液の大きな容器に耳を浸します。20分後、新鮮な滅菌蒸留水を1回5分間たっぷり使って耳を3回洗い流し、耳を数分間乾燥させます。次に、耳当たり2ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブを700A液体培地で満たし、滅菌メスを使用して各カーネルクラウンの上部1〜2ミリメートルを取り除き、耳の胚乳を露出させます。耳の先端に面した側のカーネル内の未熟な胚を、コブの取り付けの近くに見つけます。トップハンドラーと右利きのオペレータの場合は、大きな無菌ペトリ皿の上に耳を置き、胚から最も遠いペリカルプの胚精子にマイクロヘラを挿入します。優しく上向きにひねりを加えて、胚を外し、胚を露出させ、ヘラを使用して胚を700A液体培地の1つのチューブに慎重に入れる。左手で耳を保持するベースハンドラオペレータの場合は、胚から最も遠い腹蓋部の胚精子にマイクロヘラを挿入し、優しく上向きにねじって子宮を取り除きます。アグロバクテリウム懸濁液培養で胚を培養するために、作製した作業板から700A液体培地の10ミリリットルに細菌を採取し、ボルテックスを完全に懸濁して細菌培養を中断する。波長550ナノメートルで光学密度を測定し、新鮮な700A培地の1ミリリットルで胚を洗浄します。胚を1ミリリットルのアグロバクテリウム懸濁液に浸し、渦を低い設定で30秒間浸します。562V共同培養培地の個々のプレートに各チューブの内容物全体を移す前に、チューブを水平に5分間水平にしてベンチに胚を落ち着かせる。プレートをそっと旋回して胚を均等に分配し、過剰なアグロバクテリウム懸濁液を吸引する。ドーム型の側面を上に向けて慎重に胚を向け、胚を損傷しないように注意してください。その後、暗闇の中で摂氏21度で一晩インキュベーションのためにプラスチックボックスにプレートを置きます。翌朝、感染した胚を安静培地605Tに慎重に移し、1皿あたり約30個の胚を置き、スクテルン側を上に置き、暗闇の中で摂氏26度で4〜10日間のインキュベーションを行う。約7日間で、体細胞胚の発生は、ザイゴティックスクテルの表面で観察することができる。休息期間の終わりに、胚の箱を45度の摂氏インキュベーターに入れ、相対湿度70%で2時間、暗闇の中で摂氏26度で1〜2時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、10〜15の熱ショックを受けた未熟な胚を、選択的薬剤として除草剤イマザピルの1リットル当たり05ミリグラムを添加したシュート形成培地の個々のプレートに置く。必要に応じて慎重にコレプタイルを取り除き、胚を26°Cの暗いインキュベーターに2週間戻します。インキュベーションの終わりに、1プレートあたり約8個の組織を発根媒体プレートに移し、16時間の光と摂氏27度で8時間の暗さを持つ1〜2週間のインキュベーションを行います。プランツが発達するにつれて、シュートと活発な根の両方を含む1つのより強いプランレットを、さらに7〜14日間光の下で発根媒体の個々のプレートに置きます。完全に開発されていない芽は、土壌に移動する準備ができるまで、別の1〜2週間、同じ媒体上でインキュベートされるようにします。植物がより活発になるにつれて、寒天を取り除くために水道水で根をすすいでください。その後、個々の植物を排水孔付きトレイ内の事前湿潤した土壌のない基質を含む3インチのポットに移植し、プラスチック製の湿度ドームの有無にかかわらず成長室にトレイを置きます。ポット移入後9~14日後、各植letを土壌を1.5ガロンのポットに移植する。ポットに制御放出肥料を追加し、温室で植物を維持します。工場から耳の芽が出始めると、半透明のシュートバッグを使用して、バッグを取り外さずに新興シルクを観察できるようにします。次に、実証された開発の適切な段階で植物を受粉する。トウモロコシの耳は、一般的に受粉後9〜12日収穫される。1.5~2ミリメートルの長さの未熟な胚は、このプロトコルの変換に最適な外植体です。感染から8日後、ZsGreen発現体細胞胚は蛍光顕微鏡で可視化することができる。感染の8日後に熱処理がクレコンビナーゼ発現を誘導し、その結果、2つのloxP部位の間に横たわる形態原性遺伝子、cre、およびZsGreen発現カセットの切除が生じる。除草剤を含むシュート形成培地上の培養の3〜4週間後、成熟胚を有する組織を増殖させたり、除草剤に耐性のある芽を撃つ場合が観察できる。除草剤耐性組織の一部はZsGreenに対して陰性であり、これらの組織で火葬切除が起こる可能性が高いことを示唆している。組織を発根培地と軽いインキュベーションに移動させた後、よく発達した根を持つ健康で活発な成長する芽を収穫することができます。いくつかの組織は、おそらく同一の遺伝子導入パターンを有するクローン植物のために複数の芽を有するように見えることがあることに注意してください。QuickCorn法は、トウモロコシ変換効率を大幅に向上させ、変換可能な遺伝子型のリストを拡張することができます。このプロトコルは、最小のトウモロコシ変換トレーニングを受けた研究者が正常に再現することができます。QuickCorn法を使用して、根ざした植物は、感染の日のわずか5〜7週間で土壌に移す準備ができているはずです。培地組成、サブ培養のタイミング、温度と照明条件に注意してください。出発材料の品質もまた、成功した変換のために不可欠です。このプロトコルで使用される化学物質、漂白剤溶液、除草剤は、生物危険です。ご使用時には、適切な個人用保護具を着用してください。

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

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最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

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CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

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アグロバクテリウム-媒介遺伝子変換、トランスジェニック産生、および米における男性生殖発達の研究への応用

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

トウモロコシ葉肉プロトプラストのスケーラブルトランスフェクション

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Advancing Gene Editing in Bamboo Leaves for Sustainable Plastic Alternatives (Video) | JoVE

都市: Planta(プランタ) 孝宗竹葉の遺伝子発現と遺伝子編集

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...