Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Мы благодарим тепличную команду Corteva за предоставление кукурузы незрелые уши, Corteva медиа-подготовители лаборатории для оказания помощи в создании средств массовой информации, Нин Ван из Corteva за помощь в строительстве агробактерий, и Keunsub Ли из Университета штата Айова за помощь. Этот проект был частично поддержан Национальным научным фондом фонда исследования генома растений программа Грант 1725122 и 1917138 к KW, по прогнозированию растений феномика исследований программы (Национальный научный фонд Грант DGE-1545453) в J.З., по USDA NIFA Hatch проекта #IOW04341, государство Айова средств, и по биоинженерии центра штата Айова.

<ol>
	<li>Zhao, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+genetic+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens+in+maize.">High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.</a> Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).</li><li>Green, C. E., Phillips, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+regeneration+from+tissue+cultures+of+maize.">Plant regeneration from tissue cultures of maize.</a> Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).</li><li>Ji, Q., Xu, X., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+major+cereal+crops.">Genetic transformation of major cereal crops.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).</li><li>Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+(Zea+mays,+L).">Maize (Zea mays, L).</a> Agrobacterium Protocols. , 101-117 (2015).</li><li>Frame, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Agrobacterium-mediated+transformation+of+three+maize+inbred+lines+using+MS+salts.">Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts.</a> Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenic+regulators+Baby+boom+and+Wuschel+improve+monocot+transformation.">Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation.</a> The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotypes+independent+maize+transformation+via+direct+somatic+embryogenesis.">Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).</li><li>Boutilier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+BABY+BOOM+triggers+a+conversion+from+vegetative+to+embryonic+growth.">Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth.</a> The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).</li><li>Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+promotes+vegetative-to-embryonic+transition+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).</li><li>Jones, T. J., Kumar, S., Barone, P., Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+using+the+morphogenic+genes+Baby+Boom+and+Wuschel2.">Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2.</a> Transgenic Plants. , 81-93 (2019).</li><li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ternary+vector+system+for+Agrobacterium-mediated+rapid+maize+transformation.">An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation.</a> Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+acetolactate+synthase+gene+is+an+efficient+in+vitro+selectable+marker+for+the+genetic+transformation+of+Brassica+juncea+(Oilseed+Mustard).">Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard).</a> Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).</li><li>Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L., Gutteridge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+98140+corn+with+gat4621+and+hra+transgenes+to+glyphosate+and+ALS-inhibiting+herbicides.">Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides.</a> Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).</li><li>An, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+3'+control+region+of+the+potato+wound-inducible+proteinase+inhibitor+II+gene.">Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.</a> The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+nonbioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).</li><li>Passarinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Genes+Provide+Diverse+Entry+Points+into+Cell+Proliferation+and+Cell+Growth+Pathways.">Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).</li><li>Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+plant+terminator+sequences.">Novel plant terminator sequences.</a> Patent Number US2014/0130205. , (2014).</li><li>Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+is+required+for+shoot+and+floral+meristem+integrity+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.</a> Development. 122 (1), 87-96 (1996).</li><li>Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zm-AXIG1-specific+polynucleotides+and+methods+of+use.">Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use.</a> Patent Number WO2002006499. , (2002).</li><li>Hershey, H. P., Stoner, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNA+clones+for+RNA+species+induced+by+substituted+benzenesulfonamides+in+corn.">Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn.</a> Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).</li><li>Abremski, K., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+P1+site-specific+recombination.+Purification+and+properties+of+the+Cre+recombinase+protein.">Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).</li><li>Sun, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Function+Analysis+of+Small+Heat+Shock+Protein+Gene+ZmHSP17.7+from+Maize.">Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize.</a> ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+ColEl+as+a+molecular+vehicle+for+cloning+and+amplification+of+DNA.">Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).</li><li>Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn21,+flagship+of+the+floating+genome.">Transposon Tn21, flagship of the floating genome.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).</li><li>Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+sequence+determination+of+the+replicator+region+in+the+hairy-root-inducing+plasmid+pRiA+4b.">Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b.</a> Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).</li></ol>

Алисия Мастерс, Уильям Гордон-Камм и Тодд Джонс являются сотрудниками Corteva Agriscience, которые предоставили протокол и кукурузные уши B73, Mo17 и W22, используемых в этой статье. Авторам Минчжон Кану, Моргану Маккоу, Джейкобу Зобристу и Кану Вану нечего раскрывать.

Традиционные протоколы для преобразования кукурузы следуют парадигме изоляции незрелых зиготических эмбрионов для производства трансгенной ткани каллуса, которая регенерируется в плодородные растения4,6. Хотя это эффективно, каллус-основанные протоколы могут быть требующими много времени, и это часто занимает до 3 месяцев для процесса культуры тканей для производства растений. Что делает представленный здесь метод значительным, так это то, что он без каллуса, эффективен, быстр и позволяет регенерацию растений T0 примерно за половину таймфрейма. Он также, как представляется, менее генотип-зависимых и, таким образом, может быть эффективным для большинства общедоступных инбредных8,11.
Хотя все шаги должны быть эффективно соблюдены, правильный рост подготовки средств массовой информации является обязательным. Компоненты носителей роста должны быть добавлены на правильных стадиях, как до, так и после автоклава, для обеспечения того, чтобы растительный материал получал надлежащую концентрацию химических веществ. Это гарантирует, что чувствительные соединения, такие как антибиотики, не разрушатся. Важно также, чтобы растительный материал помещался на правильную среду роста на каждом этапе, как указано в протоколе. Не размещение материала на надлежащей среде роста может привести к материальной смерти. Кроме того, следует избегать размещения слишком большого количества эмбрионов или развития тканей на пластинах. При размещении в два раза больше частей ткани может сэкономить стоимость химических веществ и Петри блюда (и даже инкубатор пространства), рост тканей в переполненных пластин может быть серьезно сдерживается. При выполнении инфекции, следует обеспечить, чтобы оптическая плотность подвески Agrobacterium является целесообразным. Если плотность бактериальной подвески слишком низкая, надлежащей инфекции не может произойти.
Качество исходных материалов имеет важное значение для успеха в протоколах трансформации. Уши, используемые для вскрытия эмбрионов, должны быть здоровыми, а это означает, что растение, которое их производит, является здоровым. Они также должны обладать адекватным набором семян и быть вредителями и болезнями. Кроме того, старый агробактерий не следует использовать. Табличка "мать" должна быть не более 2 недель. После этого момента, новая "мать" пластины должны быть полосатые, чтобы начать новые эксперименты.
Хотя этот метод был показан менее зависимым от генотипа, нельзя предположить, что все строки будут одинаково успешными. Там все еще могут быть различия между линиями, а также различия в успехе на основе конструкции используется. Вариабельность ухо-к-уху также неизбежна при работе с незрелыми эмбрионами, поэтому в идеале эксперименты должны использовать несколько ушей для учета этого. В этой работе, инбредный W22 показал лучшее, с частотой преобразования более 14%, а затем B73 и Mo17 (по 4%). Lowe et al.8 сообщили об использовании протокола квиккорна для преобразования B73 и Mo17. В этой работе частоты трансформации варьировались от 9%-50% для B73 и 15%-35% для Mo17.
Одна из возможностей для более низких частот преобразования для B73 и Mo17, наблюдаемых в этой работе, может быть связана с сезонными колебаниями качества уха. Еще одно различие между этой работой и работой Lowe et al.8 заключается в том, что здесь использовались различные векторные конструкции. В работе Лоу морфогенные гены не удалялись из преобразованных растений, а скорее замалчивались на более поздних стадиях. В этой работе морфогенные гены были удалены через 8 дней после заражения. Вполне возможно, что B73 и Mo17 может потребоваться более длительное присутствие Bbm/Wus2 для развития соматических эмбрионов.
Используя этот метод, существует возможность получения нетрансгенных растений побега, мультимерных вставок и неакцизных трансгенов. Эти растения не будут иметь заметно другой фенотип, поэтому обнаружение ПЦР требуется, чтобы определить, является ли растение трансгенным. Для этого могут быть использованы праймеры ПЦР в пределах выселенного региона и праймеры, обрамленные в вырезанном регионе. Несколько независимых преобразований могут также производить растения из одного и того же незрелого эмбриона, что затрудняет определение общего независимого коэффициента восстановления трансформаторов. Наш стандарт в том, чтобы вычислить скорость трансформации на основе выборки одного растения из каждого незрелого эмбриона, который производил растения, и разделять это на количество инфицированных эмбрионов. Этот метод почти наверняка недооценивает фактическое количество независимых событий, восстановленных в качестве растений. Дискриминация между независимыми событиями из одного и того же эмбриона требует секвенирования пограничных регионов вокруг трансгенов, и это будет непомерно дорого и отнимает много времени для большинства приложений; однако могут быть случаи, когда эти данные являются полезными.
Этот метод трансформации культуры тканей оказался очень эффективным, но проблемы все еще могут возникнуть. Если растительный материал не отвечает, возможно, что существует проблема с конкретной инбредной линии, предполагая, что такие переменные, как состав медиароста роста и сроки субкультирования требуют корректировки. Другой переменной является правильное векторное проектирование и точная векторная конструкция, если первоначальный вектор изменен. Там также могут быть проблемы с чувствительностью imazapyr, так как некоторые линии являются более чувствительными, чем другие, и концентрация imazapyr, возможно, потребуется настроить для достижения успешно преобразованных растений.
За последние 30 лет культура и протоколы преобразования тканей кукурузы изменились и продвинулись вперед; и считается, что этот сокращенный протокол будет способствовать этому прогрессу. Этот метод эффективен для академических параметров, поскольку он занимает меньше времени, чем традиционные методы. Кроме того, она не требует высококвалифицированных операторов, что делает его более приемлемым для широкого распространения по сравнению с традиционными методами. В будущем этот метод может быть объединен с новыми технологиями, такими как геномная инженерия.

Трансформация является основным инструментом для оценки экспрессии иностранных генов в кукурузе и производства генетически модифицированных линий кукурузы как для научных исследований, так и для коммерческих целей. Доступ к высокой трансформации пропускной связи может облегчить повышенную потребность в молекулярной и клеточной биологии кукурузы исследований1. Способность к генетическим преобразованиям видов сельскохозяйственных культур имеет жизненно важное значение как для государственных, так и для частных лабораторий. Это позволяет как фундаментальному пониманию механизмов регулирования генов, так и улучшению урожая в глобальном масштабе для поддержки постоянно растущего населения.
Открытие, что незрелые эмбрионы из кукурузы могут быть использованы для производства regenerable каллуса возникла в 19752. После этого откровения, большинство масштабируемых протоколов преобразования кукурузы требуют формирования каллуса и отбора до регенерации3. В процессе генетической трансформации, Agrobacterium-инфицированныхили биолистных бомбардиров незрелых эмбрионов культивируются на носителях для эмбриональной индукции каллуса. Индуцированные калли затем культивируются на селективных носителей (например, содержащие гербицид), так что только преобразованные части каллуса способны выжить. Эти гербицид-устойчивые кондативные трансгенные калли ссыпаются и регенерируются в растения. Хотя этот метод является эффективным, процесс является длительным и трудоемким, и это может занять свыше 3 месяцев, чтобы завершить4. Что еще более важно, обычные протоколы преобразования кукурузы обладают гораздо большим ограничением, то есть только ограниченное количество генотипов кукурузы может быть преобразовано5,6.
Lowe et al.7,8 ранее сообщали о методе преобразования "Быстрый кукуруза", который не только значительно сократил продолжительность процесса трансформации, но и расширил список трансформируемых генотипов. Метод КвикКорн использует ортологовы кукурузы (Мм-Bbm и Мм-Wus2) из Arabidopsis транскрипционные факторы BABY BOOM (BBM)9 и WUSCHEL (WUS)10. При включении в систему переносицы трансформации, эти гены работают синергетически, чтобы стимулировать эмбриональный рост7.
Протокол Квиккорна, описанный в этой работе, был основан на протоколе в Jones et al11, который был дальнейшим улучшением метода, о котором сообщили Lowe et al7,8. В настоящем исследовании, штамм агробактерий LBA4404 (Thy-) укрывательство бинарный вектор построить PHP81430 (Рисунок 1) и аксессуар плазмиды PHP7153912 используются для преобразования. Т-ДНК PHP81430 содержит следующие молекулярные компоненты. (1) Преобразование селективного маркера гена Hra экспрессии кассеты. Кукуруза Hra (м-Гра) ген модифицированный ацетолактаз синтазы (ALS) ген, который терпим к БАС-ингибирующих гербицидов, таких как сульфонилурес и имидазолиноны13,14. Ген «М-Гра» регулируется промоутером сорго ALS8 и ингибитором картофеля протеиназы II(контактII) терминатором15. T-DNA также содержит (2) кассету выражения обладая геном экранизации преобразования screenable sGreen. Этот зеленый флуоресцентный ген белка SGreen от зоантовского рифового коралла16 регулируется промоутером сорго убиквитин/интроном и рисовым терминатором убиквитин.
Дополнительно, T-ДНК содержит (3) морфогенный ген Bbm экспрессия кассеты. Bbm является транскрипционным фактором, связанным с развитием эмбриона9,17. Bbm регулируется кукурузой фосфолипид трансферазы белка (Pltp) промоутер8 и риса T28 терминатор18. Мм-Pltp это ген с сильным выражением в эмбрионе scutellar эпителлий, шелковые волоски, и лист вспомогательных клеток (флангинг сторожевых клеток), низкое выражение в репродуктивных органах, и не выражение в корнях8. Он также содержит (4) морфогенный ген Wus2 экспрессии кассеты. Wus2 является еще одним фактором транскрипции, связанных с поддержанием апиического меритем19. М-Wus2 находится под контролем кукурузы auxin-индуцируемого промоутера (м-Axig1)20 и кукурузы In2-1 терминатор21. Наконец, T-DNA содержит (5) систему рекомбинации cre-loxP. Ген cre recombinase22 находится под контролем белка теплового шока кукурузы 17.7 (Hsp17.7)23 промоутер и картофельный контактii терминатор. Два участка loxP (в той же ориентации)24 фланга четыре гена экспрессии кассеты, включая SGreen, cre, Bbm и Wus2.
Поскольку наличие морфогенных генов не является желательным для зрелости растений и последующего потомства, тепло-индуцированной системы рекомбинации cre-loxP была встроена в Т-ДНК, чтобы удалить морфогенные гены из генома кукурузы, чтобы нормальное регенерации каллуса и развития растений. При тепловой обработке экспрессия белка CRE удаляет все трансгены, за исключением гена отбора hra. Успешные трансформаторы должны быть устойчивыми к гербицидам, но sGreen-отрицательным. Для дальнейшего повышения частоты трансформации, штамм Agrobacterium также гавани дополнительный аксессуар плазмид (PHP71539), который имеет дополнительные копии Agrobacterium вирулентности (вир) генов12.
Метод «КвикКорн» отличается от обычных протоколов преобразования кукурузы, так как он не предполагает шага индукции во время преобразования. В течение первой недели после заражения агробактериями,соматические эмбрионы развиваются на скателларе эпителия инфицированных незрелых эмбрионов. Эмбрионы затем передаются в среду с гормонами, которые способствуют созреванию эмбриона и образованию побегов. Быстро перенос соматических эмбрионов на созревание / стрелять формирования среды пропускает традиционный этап каллуса ранее используется для преобразования кукурузы и позволяет прямое поколение T0 растений8. По сравнению с ранее опубликованными методами преобразования кукурузы6,метод QuickCorn быстрее, эффективнее и менее зависим от генотипа. Используя этот метод, корневые растения, как правило, готовы к переходу в почву всего за 5-7 недель, а не через три или более месяцев, требуемых традиционными протоколами. Цель юных статей состоит в том, чтобы предоставить подробное описание и демонстрацию метода, что позволяет легче тиражировать в лабораторных условиях, как правило, в большинстве академических учреждений.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

Здесь демонстрируется подробный протокол для Агробактерии-опосредованной генетической трансформации кукурузы инбредных линий с использованием морфогенных генов Baby boom (Bbm) и Wuschel2 ( Wuschel2 ). Bbm регулируется геном фосфолипидной передачи кукурузы(Pltp)промоутер, и Wus2 находится под контролем кукурузы auxin-индуцируемой (Axig1) промоутер. Штамм Agrobacterium, несущий эти морфогенные гены на передаче ДНК (T-DNA) и дополнительные копии вирулентности Agrobacterium (vir)генов используются для заражения незрелых эмбрионов кукурузы. Соматические эмбрионы образуются на скателле инфицированных эмбрионов и могут быть отобраны при устойчивости к гербицидам и прорастают в растения. Тепло-активированная система рекомбинации cre/loxP, встроенная в конструкцию ДНК, позволяет удалять морфогенные гены из генома кукурузы на ранней стадии процесса трансформации. Частоты трансформации примерно 14%, 4% и 4% (количество независимых трансгенных событий на 100 инфицированных эмбрионов) могут быть достигнуты для W22, B73 и Mo17, соответственно, с помощью этого протокола.

Демонстрация здесь является пошаговым протоколом для Агробактерии-опосредованной генетической трансформации трех публичных линий кукурузы (B73, Mo17 и W22), которые были значительными в области генетики кукурузы. Трансформация трех инбредных линий не может быть достигнута с помощью обычных протоколов преобразования кукурузы5. На рисунке 1 и рисунке 2 показаны конструкция и исходные материалы, соответственно, используемые здесь. Уши, как правило, собирают через 9-12 дней после опыления. ИКЕ с длиной от 1,5 до 2,0 мм являются лучшими примерами для преобразования для этого протокола(рисунок 2).
Через восемь дней после заражения, SsGreen-выражениесоматических эмбрионов были визуализированы под каналом GFP флуоресцентного микроскопа(рисунок 3). Через 8 дней после инфицирования (шаги 5.1 и 5.2) инфицированные ИКЕ подверглись тепловой обработке. Эта обработка индуцировала выражение recombinasa CRE которая excised Bbm, Wus2, cre, и кассеты выражения sGreen flanked между 2 местами loxP (Рисунок 1). Теплообработанные ткани затем культивировались на среде формирования побега, содержащей гербицид имазапир для выбора преобразованной ткани после удаления морфогенных генов.
Пролиферирующие ткани со созревающими эмбрионами или стрелять почки, которые были устойчивы к imazapyr наблюдались около 3-4 недель после инфекции(Рисунок 4). Некоторые имазапир-устойчивые ткани были отрицательными для SGreen, предполагая, что cre-опосредованного иссечения, вероятно, произошло в этих тканях (Рисунок 4). После того, как ткани были перенесены на укоренение средней и легкой инкубации, побеги начали развиваться(рисунок 5). Здоровые и энергичные растущие побеги с хорошо развитыми корнями были собраны(рисунок 5). Некоторые ткани, как представляется, несколько побегов(Рисунок 5E,F, G). Этот тип "травяной" регенерант может быть связано с клональными растениями, имеющими идентичные модели трансгенной интеграции. Молекулярный биологический анализ необходим для генотипа этих растений.
Все три общедоступные инбредные линии хорошо отреагировали, используя этот протокол, а также конструкцию, используемую в этой работе. W22 производил самую высокую частоту имазапир-резистентных побегов, с частотой примерно 14% (около 14 трансгенных побегов на 100 инфицированных незрелых эмбрионов). Как B73, так и Mo17 произвели около 4% трансгенных побегов. Эти частоты указывают на все трансгенные побеги, включая оба растения, несущие морфогенные гены, и растения с морфогенным геном, удаленным при опосредованном иссечении CRE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление области Т-ДНК двоичной плазмиды PHP81430. RB - правая граница Т-ДНК; локсП и целевой участок рекомбиназы CRE; Axig1pro:Wus2 - кукуруза auxin-индуцируемая промоутер (зм-Axig1) Pltppro:Мм-Ббм - кукуруза фосфолипидный трансферазный белок(Мм-Плтп)промоутер - м-Ббм - рис T28 терминатор (Os-T28); Hsppro:cre й кукурузный белок теплового шока 17.7 промоутер(Зм-Hsp17.7) Ubipro:SGreen и сорго убиквитин промоутер / интрон (Sb-Ubi) - зеленый флуоресцентный белок sGreen гена риса убиквитин терминатор (Ос-Уби); Hra кассета и сорго ацетолактазы синтазы (Sb-Als) промоутер й кукуруза Hra (м-Хра) гена pinII терминатор; LB - левая граница T-ДНК; colE1, репликация происхождения плазмидного ColE125; СпецРР . спектромицин устойчивый ген aadA1 от Tn21 для выбора бактерий26; Rep A,B,C - репликация происхождения из pRiA4 из agrobacterium rhizogenes27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> Рисунок 2: Начальные материалы. B73 уши собраны 12 дней после опыления(A). Незрелые эмбрионы B73 (B), Mo17 (C), и W22 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> Рисунок 3: Ткань развития на отдых еврея хитовой 1 неделя после инфекции. Эмбрионы (8 дней после инфекции) под цветочным микроскопом (GFP фильтр), показывающий GFP, выражающий соматические эмбрионы Mo17(A)и W22(B). Разработка тканей (B73) под ярким полем(C)и GFP фильтром(D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> Рисунок 4: Ткань развития на созревание среды с выбором. Пластина созревания W22(A). Разработка тканей (Mo17, 15 дней после инфицирования) под ярким полем(B)и GFP фильтром(C). Разработка тканей (Mo17, 28 дней после инфицирования) под ярким полем(D)и GFP фильтром(E). Стрелки указывают на регенерацию тканей, которые не имеют экспрессии GFP, предполагая иссечение гена SGreen между участками loxP после тепло-индуцированной активности белка CRE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> Рисунок 5: Разработка тканей на укоренении носителей. Съемки W22 (A), B73 (B), и Mo17 (C,D). Событие с несколькими побегами (травянистые регенеранты) Из B73 (E) и W22(F,G). Побеги с корнями B73(H)и W22(I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Таблица 1: Медиа-композиции для преобразования кукурузы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Морфогенные гены растений могут быть использованы для улучшения генетической трансформации непокорных генотипов. Описано здесь Agrobacterium-опосредованногогенетической трансформации (Быстрый кукурузы) протокол для трех важных общественных кукурузы инбредных линий.

Agrobacterium- Посредника незрелых эмбрионов Преобразование непокорных кукурузы инбредных линий с использованием морфогенных генов

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Большинство инбредных линий кукурузы не могут быть генетически преобразованы с помощью обычных протоколов трансформации. Здесь мы описываем метод преобразования быстрого и менее зависимого от генотипа. Метод «Быстрый кукуруза» использует факторы транскрипции кукурузы BABY BOOM и WUSCHEL.При включении в векторную систему трансформации эти гены работают синергетически, стимулируя эмбриональный рост. В отличие от обычных протоколов преобразования кукурузы, метод быстрого кукурузы не включает в себя этап индукции каллуса во время преобразования. Область Т-ДНК двоичного вектора, используемая в нашей работе, содержит три ключевых компонента: морфогенные гены, маркерные гены и рекомбинацию cre/loxP.Система рекомбинации крем/локсП была включена в Т-ДНК для удаления морфогенных генов из генома кукурузы, чтобы обеспечить нормальную регенерацию каллуса в развитии растений. Примерно через два-три дня после шелка появились, и если пыльца будет доступна на следующий день, сократить шелка и шелухи с 70% этанола стерилизованных ножниц, примерно 2 1 / 2 сантиметра ниже конца листьев шелухи, где шелк возникают, и покрыть шелк с стрелять мешок. После того, как пыльников выйти из кисти, покрыть кисти с кисточка мешок, и место без заноса бумажной зажима в основании мешок вокруг стебля.На следующее утро после размещения кищной мешок, осторожно согнуть растение, и нажмите мешок, чтобы поощрять пыльцу, чтобы быть освобождены. Затем снимите кисточка мешок, и сложить верхнюю часть мешка, чтобы предотвратить пыльцу от побега. Чтобы опылить растение-реципиент, разоблачить шелк, и быстро залить пыльцу из кистой мешок на шелк.Немедленно накройте опыляемое ухо кистей мешок, и обеспечить основание мешок вокруг стебля скобы. Чтобы проверить размер незрелого эмбриона, от девяти до 12 дней после опыления, осторожно стяните шелуху, чтобы разоблачить ядра примерно на 1/3 до 1/4 окружности уха и около 1/3 расстояния вниз по уху. Используйте скальпель, чтобы отрезать крышку одного ядра, которое кажется похожим на большинство других ядер по размеру и цвету, и использовать шпатель с линейкой для извлечения эмбриона.Затем используйте линейку или калипер для измерения длины эмбриона. В течение одного-четырех дней после сбора урожая, удалить шелуху и шелк из собранных ушей, и вставить соответствующую ручку в верхней или основания каждого уха. Погрузите уши в большой контейнер для дезинфекции раствора отбеливателя в стерильный ламинарный капюшон потока с ручкой вверх.Через 20 минут, промыть уши три раза с щедрым объемом свежей стерильной дистиллированной воды в течение пяти минут за стирку, прежде чем позволить уши высохнуть в течение нескольких минут. Затем заполните одну двухмиллилитровую микроцентрифугную трубку на ухо жидкой средой 700A и используйте стерильный скальпель, чтобы удалить верхнюю от одного до двух миллиметров каждой коронки ядра, чтобы разоблачить эндосперм уха. Найдите незрелый эмбрион в ядре сбоку, обращенную к кончику уха, рядом с креплением к початку.Для верхней обработчик и правша операторов, отдых ухо на большой стерильной чашки Петри, и вставить микро шпатель в эндосперм в перикарпе дальше от эмбриона. Аккуратно закрутите вверх, чтобы выбить эндосперм и разоблачить эмбрион, и используйте шпатель, чтобы тщательно поместить эмбрион в одну трубку жидкой среды 700A. Для операторов базового обработчика, держащих ухо левой рукой, вставьте микро шпатель в эндосперм в перикарпе дальше от эмбриона, и аккуратно крутите вверх, чтобы выбить эндосперм.Для культуры эмбрионов в культуре подвески Agrobacterium, собирать бактерии из свежеприготовленной рабочей пластины в 10 миллилитров 700A жидкой среды, и вихрь, чтобы приостановить культуру бактерий полностью. Измерьте оптическую плотность на длине волны 550 нанометров и помойте эмбрионы одним миллилитром свежей среды 700A. Погрузите эмбрионы в один миллилитр подвески Agrobacterium и вихрь на низкой установке в течение 30 секунд.Поселить эмбрионы на скамейке с трубками в горизонтальной ориентации в течение пяти минут, прежде чем передать все содержимое каждой трубки на отдельные пластины 562V совместного культивирования среды. Аккуратно закружить пластины, чтобы равномерно распределить эмбрионы, и аспирировать избыток подвески Agrobacterium. Тщательно сориентировать эмбрионы с куполообразной стороны лицом вверх, заботясь, чтобы избежать повреждения эмбрионов.Затем поместите пластины в пластиковые коробки для ночной инкубации при 21 градусов по Цельсию в темноте. На следующее утро, тщательно перенести инфицированных эмбрионов на отдых средней 605T, место около 30 эмбрионов на тарелку, scutellum стороне вверх, для четырех-10-дневной инкубации при 26 градусов по Цельсию в темноте. Примерно в семь дней на поверхности зигоготического скутеллума наблюдается развитие соматических эмбрионов.В конце периода отдыха поместите коробку эмбрионов в инкубатор 45 градусов по Цельсию с 70%-ной относительной влажностью в течение двух часов, а затем один-два часа инкубации при 26 градусов по Цельсию в темноте. В конце инкубации поместите от 10 до 15 тепловых незрелых эмбрионов на отдельные пластины среды образования стрелять дополнены 05 миллиграммов на литр гербицида imazapyr в качестве селективного агента. Тщательно удалите все колеоптила по мере необходимости, и вернуть эмбрионы в 26-градусный Тюмный инкубатор по Цельсию в течение двух недель.В конце инкубации перенесите около восьми кусков ткани на тарелку на укореняющие средние пластины для инкубации от одной до двух недель с 16 часами света и восемью часами темноты при 27 градусах Цельсия. По мере развития растений, поместите один сильный плантатор, содержащий как побеги и энергичные корни на отдельные пластины укоренения среды под светом в течение еще семи до 14 дней. Разрешить побеги, которые не полностью разработаны, чтобы быть инкубированы на той же среде в течение еще одной-двух недель, пока они не будут готовы быть перемещены в почву.Как растение становится более энергичным, промыть корни с водопроводной водой, чтобы удалить агар. Затем пересадите отдельные растения в трехдюймовые горшки, содержащие предварительно смоченный безземеленный субстрат в лоток с дренажными отверстиями, и поместите лоток в камеру роста с пластиковым куполом влажности или без него. Через 9-14 дней после переноса горшка пересадим каждый плантатор с почвой в 1,5-галлонный горшок.Добавьте контролируемое удобрение в кастрюлю и поддерживайте растения в теплице. Когда ухо побеги начинают выходить из растения, использовать полупрозрачный мешок стрелять, чтобы покрыть побеги так, что возникающие шелка можно наблюдать, не снимая мешок. Затем опыляют растения на соответствующем этапе развития, как попродемонстрировано.Уши кукурузы обычно собирают через 9-12 дней после опыления. Незрелые эмбрионы длиной от 1,5 до двух миллиметров являются лучшими эксплантами для преобразования для этого протокола. Через восемь дней после инфицирования соматические эмбрионы, выражающих сурин, можно визуализировать с помощью микроскопии флуоресценции.Тепловая обработка через восемь дней после того, как инфекция вызывает экспрессию cre recombinase, в результате чего иссечение морфогенного гена, cre, и кассеты экспрессии sGreen в окружении между двумя участками loxP. После трех-четырех недель культуры на стрелять формирования среды, содержащей гербицид, размножающиеся ткани с созревания эмбрионов или стрелять почки устойчивы к гербициду можно наблюдать. Некоторые из устойчивых к гербицидам тканей могут быть отрицательными для ЗГрин, предполагая, что cre-опосредованное иссечение, вероятно, произошло в этих тканях.После перемещения тканей к укоренению среднего и легкого инкубации можно собрать здоровые, энергичные, растущие побеги с хорошо развитыми корнями. Обратите внимание, что некоторые ткани могут показаться, что несколько побегов, возможно, из-за клональных растений, имеющих идентичные трансгенные модели интеграции. Метод «Быстрый желудь» может значительно повысить эффективность преобразования кукурузы и расширить список трансформируемых генотипов.Протокол может быть успешно воспроизведен исследователями с минимальным обучением преобразования кукурузы. Используя метод быстрого кукурузы, корнеи растений должны быть готовы к передаче в почву всего через пять-семь недель после дня инфекции. Обратите внимание на средний состав, сроки субкультур, температуру и условия освещения.Качество стартовых материалов также имеет важное значение для успешной трансформации. Химические вещества, раствор отбеливателя и гербициды, используемые в этом протоколе, являются биологически случайными. Пожалуйста, убедитесь, что носить соответствующее оборудование личной защиты во время их использования.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Определение численного и структурные изменения во всех 24 хромосом человека одновременно, используя Роман OctoChrome Анализ FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Масштабируемая трансфекция протопластов мезофилла кукурузы

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Advancing Gene Editing in Bamboo Leaves for Sustainable Plastic Alternatives (Video) | JoVE

В Планте Экспрессия генов и редактирование генов в листьях бамбука мосо

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

Отдельно взятые оболочки кукурузы для визуализации живых клеток инфекции, вызванной грибковыми листовыми патогенами кукурузы

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...