Name: agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Biz mısır olgunlaşmamış kulakları sağlamak için Corteva sera ekibi teşekkür, medya yapımında yardım sağlamak için Corteva medya hazırlık laboratuvarı, Agrobacterium inşa ile yardım için Corteva Ning Wang, ve Yardım için Iowa Devlet Üniversitesi'nden Keunsub Lee. Bu proje kısmen Ulusal Bilim Vakfı Bitki Genom Araştırma Programı Grant 1725122 ve 1917138 tarafından K.W., Predictive Bitki Phenomics Araştırma Staj Programı (Ulusal Bilim Vakfı Grant DGE-1545453) tarafından J.Z., USDA NIFA Hatch projesi #IOW04341 tarafından, Iowa Devlet fonları tarafından desteklendi ve Iowa Üniversitesi Crop Biyomühendislik Merkezi tarafından.

1. Büyüme ortamı hazırlığı
<ol><li>Bu protokol için tam büyüme orta tarifleri için, Tablo 1bakın.</li>
	<li>Ortam 1 L hazırlamak için, bir karıştırma plakası üzerine 2 L beher yerleştirin ve içine bir karıştırma çubuğu yerleştirin.</li>
	<li>900 mL distile su ile beher doldurun ve karıştırma plakası açın. Karıştırma çubuğu orta hızda dönmeli.</li>
	<li>Tüm toz maddeleri tartın ve bir kabın içinde çözünür.</li>
	<li>Varsa tüm sıvı maddeleri ölçün ve kabına ekleyin.</li>
	<li>Distile su kullanarak son hacmi 1 L'ye getirin.</li>
	<li>pH'ı ölçün ve tarif özelliklerine göre ayarlayın.</li>
	<li>Bir sıvı büyüme ortamı formüle edilirse, hiçbir agar eklenir. Bir vakum pompası bir filtre sterilizatör takın ve filtre ile sıvı büyüme ortamı dökün. Pompayı açın ve tüm sıvı çekilene kadar bekleyin. Kapsayıcıya bir kapak yerleştirin ve bir etiket takın.</li>
	<li>Katı bir büyüme ortamı formüle ediyorsanız, pH ayarlandıktan sonra, doğrudan bir şişe veya şişe içine agar ekleyin.</li>
	<li>1 L likit büyüme ortamını 2 L Erlenmeyer şişesine dökün veya iki adet 1 L otoklavlanabilir şişeye (her biri 500 mL) bölün. İki şişe kullanılırsa, agar bölün ve doğrudan şişe ekleyin.</li>
	<li>Buharın kaçabilmesi için iki kat alüminyum folyo gibi nefes alabilen bir kapakla şişeyi kapatın. Şişe kullanıyorsanız, vida kapağını üstteki kapağı gevşek bir şekilde kapatın.</li>
	<li>Otoklav 121 °C'de 25 dk.</li>
	<li>Otoklavlamadan sonra, büyüme ortamını otoklavdan çıkarın ve 55-60 °C'ye kadar serinleyin (55 °C'ye ayarlanmış bir su banyosu bunu kolaylaştırabilir). Plakaları dökmek için uygun olana kadar birkaç saat için sıvı bir durumda büyüme orta tutun.</li>
	<li>Soğuduktan sonra, tüm sterilizasyon sonrası katkı maddelerini ekleyin (Bkz. Tablo 1)ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Tüm malzemeler eklendikten sonra, bir laminar akış kaputunda tercih edilen kap içine belirlenen hacmi dökün.</li>
	<li>Büyüme ortamı istenilen Petri kaplarına manuel olarak veya sıvı dağıtım cihazı kullanılarak dökülebilir. Elle dökülürken, kullanım kolaylığı için büyük hacimli otoklavlı ortamın daha küçük bir steril kabına (500 mL) aktarılması tavsiye edilir.</li>
	<li>Büyüme ortamının soğumasına ve katılaşmasına izin verin.</li>
	<li>Büyüme ortamı bir kez katı hale kullanıma sunulacak ve en iyi kapaklı plaka yığınları olarak steril bir akış kaputunda biraz gece kuruduktan sonra ertesi gün kullanılır. Bir gecede kuruduktan sonra, plastik kollu içine plakalar aktarın, gevşek ucunda katlayın, ve bant küçük bir bit ile yerinde bu tutmak. Bu aşırı kuruma önler. Orta kadar 1 ay boyunca serin, karanlık ve temiz bir ortamda (4-16 °C) saklanabilir.</li>
</ol>2. Büyüyen donör bitkiler ve olgunlaşmamış kulaklar hasat
<ol><li>1,5 galon (5,9 L) topraksız bir substrat içeren bir serada kamuya açık mısır inbred (yani, B73, Mo17 veya W22) büyütün. Gün içinde ortalama 25,5 °C, gece ise 20 °C sıcaklıkla 16/8 (gündüz/gece) fotoğraf çekimi kullanın.</li>
	<li>Bitkiler gerektiği gibi sulanır ve toprak karışımına dahil edilebilen veya dikimden sonra yüzeye ekilebilen kontrollü bir salınım gübresi (15-9-12'nin N-P-K'si) ile döllenir.</li>
	<li>Genellikle kulakların ortaya çıkması için tohum çimlenme sonra yaklaşık 70-90 gün sürer. Kulak sürgünleri ortaya çıktıkça, kontrolsüz tozlaşmanın oluşmasını önlemek için bir çekim çantası ile kaplayın.</li>
	<li>İpekler ortaya çıktıktan yaklaşık 2-3 gün sonra polen mevcut olacaksa ertesi gün, %70 etanolle sterilize edilmiş makas kullanarak ipekleri kesin. İpekleri ve kabuğu nu, ipeklerin çıktığı kabuk yapraklarının ucuna yaklaşık 2,5 cm aşağıda kesin. Tozlaşma ertesi gün yapılabilir. Her kulak arasında makas yeniden sterilize emin olun.</li>
	<li>Bir kez anthers bir püskül ortaya, bir püskül çanta ve sap etrafında çantanın tabanında olmayan kızak ataş ile püskül kapağı.</li>
	<li>Ertesi sabah, yavaşça bitki üzerinde viraj ve polen serbest bırakılması için teşvik etmek için torba dokunun.</li>
	<li>Püskül lüzmunu çıkarın ve polenlerin kaçmasını önlemek için torbanın üst kısmını katlayın. Genellikle püskül çanta için en iyi 1 gün önce kullanılacak (ölü polen birikmesi önlemek ve anthers döken). Taze polen püsküllerden yaklaşık 3-5 gün toplanabilir. Püskültabanında iç florets ortaya çıktığında, püskül muhtemelen ertesi gün uygun polen üretmek olmaz.</li>
	<li>Polenleri aynı bitkiden (selfing) veya aynı inbred (sibbing) başka bir bitkiden kullanın.</li>
	<li>Kulak torbasını çıkarın veya ipekleri ortaya çıkarmak için torbanın ucunu kesin, sonra püsküllü torbadan polenleri ipeklerin üzerine hızla dökün.</li>
	<li>Hemen püskül lüzmuyla kulağı kapatın ve torbanın tabanını emniyete almak için sapın etrafına zımbalayın. Çapraz tozlaşmayı önlemeye yardımcı olmak için tozlaşma sırasında bitkiyi farklı genotiplerden fiziksel olarak izole etmek yararlı olabilir. Olgunlaşmamış kulak hasat hazır olana kadar püskül torbasını kulağın üzerinde bırakın.</li>
	<li>Tozlaşmadan 9-12 gün sonra embriyo boyutu için ekran kulakları. Kulak ortaya çıkarmak için sap yukarı tozlaşma torbası kaydırın. Yavaşça kulak çevresinin yaklaşık üçte biri ila dörtte biri ve kulak aşağı mesafenin yaklaşık üçte biri üzerinde çekirdekleri ortaya çıkarmak için kabuğu aşağı çekin. Ucuna yakın çekirdekler ortalama embriyo boyutunu temsil olmayacaktır.</li>
	<li>Neşter kullanarak, boyut ve renk olarak diğer çekirdeklerin çoğunluğuna benzer görünen tek bir çekirdeğin kapağını dilimleyin.</li>
	<li>Adım 4.6'da açıklandığı gibi embriyoyu çıkarmak için bir spatula (cetvelli) kullanın. Spatula veya dijital kaliper üzerinde yerleşik bir cetvel kullanarak embriyonun uzunluğunu ölçün. Embriyo 1.5-2.0 mm arasında ise, kulak hasat. ~ 1.3 mm ise, kulak günün ilerleyen saatlerinde hasat için hazır olabilir ve yaklaşık 7-8 saat tekrar kontrol edilebilir.</li>
</ol>3. Enfeksiyon için Agrobacterium süspansiyon kültürünün hazırlanması
NOT: PHP81430 (Şekil 1) ve PHP7153912 içeren Agrobacterium strain LBA4404(Thy-) -80 °C'de gliserol stoku olarak saklanır. Bu malzemeler Corteva Agriscience'dan Malzeme Transfer Anlaşması ile temin edilebilir. LBA4404(Thy-) büyüme medyasında sağlanan timidin ihtiyacı olan bir yardımcıotrofik suşudur. Auxotroph Agro suşubirincil yararı biyo-kapsama amaçlıdır. Bu Agro büyüme azaltmanın ek yararı vardır. Yardımcı timidin olmadan yardımcı agro zorlanma büyümez. Yine de, timidin (muhtemelen) kültürde ölmekte olan bitki dokusu tarafından sağlanabilir. Bu nedenle, hala tamamen yardımcı agro kontrol etmek için orta bir antibiyotik sağlamak için bir ihtiyaç vardır. Ancak, timidin yokluğunda yardımcı trofik zorlanma tehlikeye büyüme nedeniyle kontrol etmek daha kolay olacaktır.
<ol><li>Enfeksiyon tarihinden dört gün önce gliserol stoğundan 50 mg/L timinin, 50 mg/L gentamisin ve 50 mg/L spektinomisin içeren bir YP plakası üzerinde bakteri serilenerek bir "anne" plakası başlatın(Tablo 1). "Anne" plakasını 20 °C'lik bir kuluçka makinesinde 3 gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Enfeksiyon deneyinden bir gün önce, "anne" plakasından bir ila beş koloni seçerek ve bakterileri "anne" plakasından yeni bir YP plakasına (timinin, gentamisin ve spektinomisin ile) doğrulayarak bir "çalışma" plakası hazırlayın; Tablo 1).</li>
	<li>Sıralı quadrants günlük "çalışma" plaka çizgi ve seri seyreltilmiş olan quadrants oluşturmak için tekrarlayarak, ardışık çeyreğine sadece çizgili alan üzerinden döngü 1x çalıştırın. "Çalışan" plakayı bir gecede 27 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Embriyo diseksiyonu tamamladıktan sonra (adım 4.8), bakteri büyüme kolonilerin ince çizgiler olarak görülebilir "çalışma" plaka bir bölgeden Agrobacterium toplamak için bir döngü veya benzer bir araç kullanın. NOT: Bakteri üreme yoğun bir çim ile plaka alanları kaçının. Agrobacterium büyüme büyük olasılıkla zaten yoğun alanlarda azalmaya başladı, görünür koloniler ile alanlarda bakteri enfeksiyon için uygun büyüme aşamasında iken.</li>
	<li>Toplanan bakterileri 10 mL 700A sıvı ortam içeren 50 mL'lik bir tüpte askıya alın(Tablo 1). Girdap bakteri kültürünü tamamen askıya almak için.</li>
	<li>Optik yoğunluğu 550 nm dalga boyunda ölçün. OD 0,35-0,45 arasında olana kadar, 0,4 en uygun değer olana kadar hacmi ayarlayın. NOT: OD 0,45'ten yüksekse, daha fazla 700A sıvı ortam ekleyin. OD 0.35'ten düşükse, süspansiyon kültüründe daha fazla Agro kolonisini aşılamak.</li>
</ol>4. Embriyo diseksiyonu, enfeksiyon ve birlikte yetiştirme
<ol><li>Dönüşüm deneyleri için uygun kulakları seçin; bu iyi bir tohum seti ve 1.5-2.0 mm boyutu arasında değişen embriyolar olmalıdır. Genellikle tozlaşmadan sonra 9-12 gün arasında hasat edilir. Hasat edilen kulaklar 4 °C'de 1-4 gün taze olarak kullanılabilir veya saklanabilir, ancak yanıt kalitesi büyük olasılıkla ilk günden sonra uzun süreli depolama ile kademeli olarak bozulacaktır.</li>
	<li>Kabukları ve ipekleri çıkarın. Taban veya kulağın üst içine bir tutamaç takın. Kolu forceps, tornavida, vb bir çift olabilir.</li>
	<li>Kulakları büyük bir kapta yerleştirin (örn. 2 L kabı, sapı yukarı doğru, kabı dezenfeksiyon çözeltisi ile doldurun. Dezenfeksiyon çözeltisi 1.8 L 20% ticari çamaşır suyu (%1.65 sodyum hipoklorit) ve sürfaktan Tween 20 damla bir çift.</li>
	<li>Bir laminar akış tezgah içinde kulakları sterilize. 20 dakika sonra, çamaşır suyu çözeltisini boşaltın ve steril distile su cömert bir miktar kullanarak kulakları 3x (5 dk her) durulayın. Suyu çıkarın ve kulakların birkaç dakika kurumasını bekleyin. NOT: Kulakların 20 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisine tamamen batırılması önemlidir. Hava kabarcıklarını çıkarmak için zaman zaman çamaşır suyu çözeltisinde kulakları dikkatlice hareket ettirin.</li>
	<li>700A sıvı ortam ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüp hazırlayın. Bu tüp olgunlaşmamış embriyoları toplamak için kullanılacak.</li>
	<li>Kulak alın ve steril bir neşter kullanarak, endosperm ortaya çıkarmak için çekirdek kron üst 1-2 mm çıkarın. Olgunlaşmamış zigotik embriyoyu (IZE) çıkarmak için mikro spatula kullanın. IZE çekirdek içinde, kulağın ucuna bakan tarafta ve cob eki yakınında yer alacak. Spatula kullanarak, embriyo uzak pericarp endosperm içine yerleştirin, sonra yavaşça endosperm çıkarmak için yukarı büküm ve embriyo çıkarılması için izin(Şekil 2).</li>
	<li>Spatula kullanarak, 700A sıvı orta içeren tüp içine embriyo aktarın. 100 embriyo toplanana kadar bunu yapmaya devam edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce birden fazla tüp (~100 embriyo/tüp) doldurulabilir. Bu noktada, Agrobacterium süspansiyon (adım 3.5 bakınız) hazırlanmalıdır.</li>
	<li>700A sıvı ortamı 1 mL pipetle embriyo tüpünden çıkarın. Embriyoları yıkamak için taze 700A orta ekleyin, sonra da bu medya kaldırın.</li>
	<li>Karıştırmak için 30 s veya invert tüp 12x-15x için düşük bir ayar (3/10) üzerinde Agrobacterium süspansiyon ve girdap 1 mL ekleyin. Bu tüpün 5 dakika boyunca yedek kulübesinde yatay olarak dinlenmesine izin verin.</li>
	<li>5 dakika sonra, 562V co-ekim ortamı(Tablo 1)bir plaka üzerine embriyo ve Agrobacterium süspansiyon tüm tüp transfer . Bu, plakayı tezgaha koyarak ve tüp içeriğini hızlı bir şekilde tabağa dökerek elde edilebilir. Yavaşça embriyoları dağıtmak ve 1 mL pipet kullanarak Agrobacterium süspansiyon kaldırmak için plaka girdap.</li>
	<li>Embriyoların scutellum (yuvarlak) tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Gerekirse büyüteç veya diseksiyon kapsamı kullanın. Plakaları plastik kutulara (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) yerleştirin ve plakaları karanlıkta 21 °C'de bir gecede 16-18 saat kuluçkaya yatırın. Parafin film veya havalandırma bandı kullanılarak tek tek plaka sarma gerekli değildir.</li>
	<li>Gece birlikte ekimi sonra, enfekte embriyolar taşımak, scutellum yan yukarı, dinlenme orta 605T üzerine (Tablo 1). Plaka başına yaklaşık 30 embriyo yerleştirin. Plakaları karanlıkta 26-28 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4-10 gün (7 gün tercih edilir) kuluçka. Şu anda, somatik embriyoların gelişimi zigotik scutellum yüzeyinde görülebilir (Şekil 3).</li>
</ol>5. Seçim, ısıl işlem ve rejenerasyon
<ol><li>Dinlenme döneminden sonra, ısı şok embriyolar. Embriyo plakalarını içeren kutuyu 45 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve %70 bağıl nem oranı2 saat. Daha sonra kutuyu 45 °C'lik kuluçka makinesinden çıkarın ve 26-28 °C koyu kuvöze 1-2 saat yerleştirin. NOT: Bir kuvözde %70 neme ulaşamıyorsa, plaka kutusunun altına çift kat otoklavlı kağıt havlu ekleyin ve kutunun içindeki nemi korumak için otoklavlı suyla ıslatın. Plakaları kağıt havluların üzerindeki kutuya geri döndürün ve 45 °C'ye yerleştirmeden önce kapağı kapatın. Sıcaklığı ve nemi izlemek için küçük bir dijital higrometre/termometre kullanın.</li>
	<li>Isıl işlem görmüş İzLer'i istirahat lı ortamdan 0.05 mg/L imazapyr içeren sürgün oluşum ortamına (13329A) selektif ajan olarak aktarın(Tablo 1). Transfer ederken, varsa, ince uçlu forceps veya cerrahi makas kullanarak, coleoptiles çıkarın.</li>
	<li>Aşırı kalabalıktan kaçınmak için plaka başına 10-15 embriyo yerleştirin. Embriyoları 26 °C koyu kuvözde 2 hafta boyunca bu ortamda tutun.</li>
	<li>Embriyoların köklenme ortamına aktarılması (13158; Tablo 1) 1-2 hafta boyunca. 27 °C'de bir ışık odası veya ışık odasında (16 gün/8 gece, 20-150 μmol/m2/s) plaka başına sekiz adet ve kuluçka yeri.</li>
	<li>Plantetler geliştikçe, hem sürgünler hem de güçlü kökler içeren daha güçlü plantletleri yeni kökleme ortamı plakalarına yerleştirin, her tabak başına bir bitki yerleştirin. Bu daha güçlü plantlet büyüme sağlayacaktır. Başka bir 7-14 gün için ışık odası veya ışık odasında plakaları yerleştirin. NOT: Özenle orta ile iyi temas sağlamak için plantlet ile ilgili herhangi bir nasır parçaları çıkarın.</li>
	<li>Bitki daha güçlü hale geldikçe, orta kökleme bitki kaldırmak ve agar kaldırmak için musluk suyu ile kökleri durulayın.</li>
	<li>Ayrı bitkileri önceden ıslak topraksız bir substrat içeren2'de 3 (~19 cm2)kaplara nakledin. Tencereleri drenaj delikleri olan bir tepsiye (27 cm x 54 cm) yerleştirin ve düzlüğü plastik bir nem kubbesi ile kaplayın. Bu alışma adımı, yukarıdaki bölüm 2 'de (adım 2.1) açıklanan büyüme koşulları ile büyüme odasında veya serada elde edilebilir.</li>
</ol>6. Seraya nakli ve T1 tohumu üretimi
<ol><li>Günde 2x bitkileri kontrol edin. Gerektiği gibi su. Bitkilerin ne kuruduğunu ne de aşırı sulandırıldığından emin olun. Biraz kuru bir substrat bakımı kök büyümesini teşvik eder. NOT: Nem kubbesi nakilden 4-7 gün sonra çıkarılabilir. Bitkiler bu küçük kaplarda toprağa nakil stresinden gözle görülür bir şekilde iyileşene kadar yetiştirilmelidir. Bu yaklaşık 9-14 gün sürer.</li>
	<li>Tüm topraksız fişi ve ekini 1,5 gal (5,9 L) bir tencereye nakledin. Toprak dokunmak için kuru hissettiğinde sera ve su koruyun.</li>
	<li>Tencereye 15-9-12 n-p-k kontrollü bir serbest gübre ekleyin, bu gübre ya substrat karışımına dahil edilebilir ya da yüzeye uygulanabilir.</li>
	<li>Kulak sürgünleri bitkiden çıkmaya başladığında, kulak sürgünlerini örtmek için bir çekim torbası kullanın. Ortaya çıkan ipek torba çıkarmadan görülebilir, böylece yarı saydam bir çanta kullandığınızdan emin olun. Sürgün çantası kontrollü tozlaşmanın oluşmasını sağlar. Her zaman transgenik püskülleri poşetlemek önemlidir.</li>
	<li>İpekler ortaya çıktıktan sonra (1-2 gün), ortaya çıkan ipekleri tek düze bir uzunluğa kadar kırpın. Bu kabuk yapraklarının üst yaklaşık 2,5 cm altında olacaktır. % 70 etanol sterilize edilmiş temiz makas bir çift kullanın. İpekleri keserek, tozlaşmanın meydana gelmesi için ertesi gün tek tip bir tuft gelişir.</li>
	<li>Mısır genotiplerinin çoğunluğu için, tozlaşma için en uygun zaman püskül veya ipek ortaya çıktıktan 2-3 gün sonradır.</li>
	<li>Polenleri aynı bitkiden (kendi kendine tozlaşmışsa) veya aynı aşılı vahşi tipten (dışa veya ingeçte) toplayın.</li>
	<li>Bir püskül torbaiçinde polen toplamak ve T0 bitkinin ipek tuft uygulayın. Polen bir yabani tip (non-transgenik) bitki ise, düz kahverengi püskül lüle içinde polen yerleştirin. Polen bir transgenik bitki ise, polen transgenik olduğunu belirtmek için yeşil çizgili bir torbaya polen yerleştirin.</li>
	<li>Tozlaşma ayrıntıları için 2.5-2.10 adımlarını izleyin.</li>
	<li>Tozlaşmadan yaklaşık 2 hafta sonra, kulaklardan püskül torbalarını çıkarın ve kurumaya başlayabın. Kurumaya yardımcı olmak için, tozlaşmadan 21-25 gün sonra bitkisulama durdurmak. Ayrıca tohum ortaya çıkarmak için kabuk yaprakları geri çekebilirsiniz. Bu uygulama aynı zamanda küf önlemeye yardımcı olur.</li>
	<li>Tozlaşmadan yaklaşık 45 gün sonra tohumları hasat edin ve 4-12 °C'de soğuk hava deposunda saklayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+genetic+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens+in+maize.">High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize.</a> Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).</li><li>Green, C. E., Phillips, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+regeneration+from+tissue+cultures+of+maize.">Plant regeneration from tissue cultures of maize.</a> Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).</li><li>Ji, Q., Xu, X., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+major+cereal+crops.">Genetic transformation of major cereal crops.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).</li><li>Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+(Zea+mays,+L).">Maize (Zea mays, L).</a> Agrobacterium Protocols. , 101-117 (2015).</li><li>Frame, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Agrobacterium-mediated+transformation+of+three+maize+inbred+lines+using+MS+salts.">Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts.</a> Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenic+regulators+Baby+boom+and+Wuschel+improve+monocot+transformation.">Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation.</a> The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).</li><li>Lowe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotypes+independent+maize+transformation+via+direct+somatic+embryogenesis.">Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).</li><li>Boutilier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+BABY+BOOM+triggers+a+conversion+from+vegetative+to+embryonic+growth.">Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth.</a> The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).</li><li>Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+promotes+vegetative-to-embryonic+transition+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).</li><li>Jones, T. J., Kumar, S., Barone, P., Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+using+the+morphogenic+genes+Baby+Boom+and+Wuschel2.">Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2.</a> Transgenic Plants. , 81-93 (2019).</li><li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ternary+vector+system+for+Agrobacterium-mediated+rapid+maize+transformation.">An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation.</a> Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+acetolactate+synthase+gene+is+an+efficient+in+vitro+selectable+marker+for+the+genetic+transformation+of+Brassica+juncea+(Oilseed+Mustard).">Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard).</a> Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).</li><li>Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L., Gutteridge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+98140+corn+with+gat4621+and+hra+transgenes+to+glyphosate+and+ALS-inhibiting+herbicides.">Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides.</a> Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).</li><li>An, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+3'+control+region+of+the+potato+wound-inducible+proteinase+inhibitor+II+gene.">Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene.</a> The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+nonbioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).</li><li>Passarinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Genes+Provide+Diverse+Entry+Points+into+Cell+Proliferation+and+Cell+Growth+Pathways.">Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).</li><li>Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+plant+terminator+sequences.">Novel plant terminator sequences.</a> Patent Number US2014/0130205. , (2014).</li><li>Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WUSCHEL+gene+is+required+for+shoot+and+floral+meristem+integrity+in+Arabidopsis.">The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.</a> Development. 122 (1), 87-96 (1996).</li><li>Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zm-AXIG1-specific+polynucleotides+and+methods+of+use.">Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use.</a> Patent Number WO2002006499. , (2002).</li><li>Hershey, H. P., Stoner, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNA+clones+for+RNA+species+induced+by+substituted+benzenesulfonamides+in+corn.">Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn.</a> Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).</li><li>Abremski, K., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+P1+site-specific+recombination.+Purification+and+properties+of+the+Cre+recombinase+protein.">Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).</li><li>Sun, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Function+Analysis+of+Small+Heat+Shock+Protein+Gene+ZmHSP17.7+from+Maize.">Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize.</a> ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+ColEl+as+a+molecular+vehicle+for+cloning+and+amplification+of+DNA.">Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).</li><li>Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn21,+flagship+of+the+floating+genome.">Transposon Tn21, flagship of the floating genome.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).</li><li>Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+sequence+determination+of+the+replicator+region+in+the+hairy-root-inducing+plasmid+pRiA+4b.">Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b.</a> Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).</li></ol>

Alicia Masters, William Gordon-Kamm ve Todd Jones, bu makalede kullanılan B73, Mo17 ve W22'nin protokolünü ve mısır kulaklarını sağlayan Corteva Agriscience çalışanlarıdır. Yazarlar Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist ve Kan Wang açıklayacak bir şey yok.

Mısır dönüşümü için geleneksel protokoller, doğurganbitkiler4,6içine rejenere transgenik nasır dokusu üretmek için olgunlaşmamış zigotik embriyolar izole paradigmaizleyin. Bu etkili olmakla birlikte, nasır tabanlı protokoller zaman alıcı olabilir ve genellikle doku kültürü sürecinin bitkilerürüretmek için 3 ay kadar sürer. Burada sunulan yöntemi önemli kılan, nasırsız, verimli, hızlı olması ve t0 bitkilerinin kabaca yarı zaman diliminde yenilenmesine olanak sağlamasıdır. Aynı zamanda daha az genotip bağımlı gibi görünüyor ve böylece en kamuya açık inbreds için etkili olabilir8,11.
Tüm adımlar etkin bir şekilde takip edilmesi gerekirken, doğru büyüme ortamı nın hazırlanması zorunludur. Büyüme ortam bileşenleri doğru aşamalarında eklenmeli, hem öncesi ve sonrası- otoklav, bitki malzeme kimyasalların uygun konsantrasyon alır sağlamak için. Bu antibiyotikler gibi hassas bileşikler yıkmak değil sağlayacaktır. Ayrıca, tesis materyalinin protokolde belirtildiği gibi, her aşamada doğru büyüme ortamına yerleştirilmesi de önemlidir. Uygun büyüme ortamına malzeme yerleştirmemek maddi ölümle sonuçlanabilir. Buna ek olarak, plakalar üzerinde çok fazla embriyo yerleştirmek veya dokuların geliştirilmesi kaçınılmalıdır. İki kat fazla doku parçası yerleştirmek kimyasalların ve Petri yemeklerinin (ve hatta kuluçka alanının) maliyetini azaltabilirken, aşırı kalabalık tabaklarda dokunun büyümesi ciddi şekilde engellenebilir. Enfeksiyonu gerçekleştirirken, Agrobacterium süspansiyonunun optik yoğunluğunun uygun olduğundan emin olunmalıdır. Bakteriyel süspansiyon yoğunluğu çok düşükse, uygun enfeksiyon oluşmayabilir.
Dönüşüm protokollerinde başarı için başlangıç malzemelerinin kalitesi esastır. Embriyo diseksiyonu için kullanılan kulaklar sağlıklı olmalıdır, yani onları üreten bitki sağlıklıdır. Ayrıca yeterli bir tohum setine sahip olmalı ve haşere ve hastalıksız olmalıdır. Ayrıca, eski Agrobacterium kullanılmamalıdır. "Anne" plakası en fazla 2 haftalık olmalıdır. Bu noktadan sonra, yeni bir "anne" plaka yeni deneyler başlamak için çizgili olmalıdır.
Bu yöntem daha az genotip bağımlı olduğu gösterilmiştir, ancak tüm satırların eşit derecede başarılı olacağı varsayılamaz. Kullanılan yapıya bağlı olarak çizgiler arasında farklılıklar ın yanı sıra başarı farklılıkları da olabilir. Olgunlaşmamış embriyolarla çalışırken kulaktan kulağa değişkenlik de kaçınılmazdır, bu nedenle ideal deneyler bunu hesaba katmak için birden fazla kulak kullanmalıdır. Bu çalışmada, inbred W22 en iyi performans, üzerinde ~ 14% dönüşüm frekansı, B73 ve Mo17 (~ 4% her) izledi. Lowe ve ark.8 B73 ve Mo17 dönüşümü için QuickCorn protokolü kullanılarak rapor. Bu çalışmada dönüşüm frekansları B73 için %9-%50, Mo17 için %15-35 arasında değişmektedir.
Bu çalışmada gözlenen B73 ve Mo17 için daha düşük dönüşüm frekansları için bir olasılık mevsimsel kulak kalitesi dalgalanma atfedilebilir. Bu çalışma ile Lowe ve ark.8 arasındaki bir diğer fark da burada farklı vektör yapılarının kullanılmış olmasıdır. Lowe'un çalışmalarında, morfojenik genler dönüştürülmüş bitkilerden çıkarılmadı, daha sonraki aşamalarda gelişimsel olarak susturuldu. Bu çalışmada, morfojenik genler enfeksiyondan 8 gün sonra çıkarıldı. Bu B73 ve Mo17 somatik embriyoların gelişimi için Bbm / Wus2 daha uzun bir varlığı gerekebilir mümkündür.
Bu yöntemi kullanarak transgenik olmayan kaçış tesisleri, multimerik eklemeler ve eksintised transgenler elde etme imkanı vardır. Bu bitkiler fark farklı bir fenotip olmayacak, bu nedenle PCR tarafından algılama bir bitki transgenik olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bunu başarmak için, excised bölge içinde PCR astar ve excised bölge yan astar istihdam edilebilir. Birden fazla bağımsız dönüşümler de aynı olgunlaşmamış embriyo bitkiler üretebilir, toplam bağımsız transformant kurtarma oranı nın belirlenmesi zor hale. Standartımız, bitkileri üreten her olgunlaşmamış embriyodan bir bitkiörnekleme ve enfekte embriyo sayısına bölünmesine dayalı bir dönüşüm oranı hesaplamak olmuştur. Bu yöntem, dikim olarak kurtarılan bağımsız olayların gerçek sayısını neredeyse kesinlikle hafife alma. Aynı embriyodan bağımsız olaylar arasında ayrımcılık transgenler etrafında sınır bölgeleri sıralama gerektirir ve bu engelleyici pahalı ve çoğu uygulama için zaman alıcı olacaktır; ancak, bu verilerin yararlı olduğu durumlar olabilir.
Doku kültürü dönüşüm bu yöntem çok etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak sorunlar hala oluşabilir. Tesis materyali yanıt vermiyorsa, büyüme ortamı bileşimi ve subculturing zamanlaması gibi değişkenlerin ayarlamalar gerektirdiğini düşündüren, belirli inbred hattı ile ilgili bir sorun olması mümkündür. Orijinal vektör değiştirilirse, başka bir değişken uygun vektör tasarımı ve doğru vektör yapısıdır. Bazı çizgiler diğerlerinden daha hassas olduğu için imazapyr duyarlılığı ile ilgili sorunlar da olabilir ve imazapyr konsantrasyonunun başarılı bir şekilde dönüştürülmüş bitkilere ulaşmak için ayarlanması gerekebilir.
Son 30 yılda mısır doku kültürü ve dönüşüm protokolleri değişmiş ve ilerlemiştir; ve bu kısaltılmış protokolün bu ilerlemeyi daha da ileriye doğru artıracağına inanılmaktadır. Geleneksel yöntemlere göre daha az zaman alan bu yöntem, akademik ayarlar için etkilidir. Buna ek olarak, yüksek eğitimli operatörler talep etmez, geleneksel yöntemlere göre yaygın dağıtım için daha uygun hale. Gelecekte bu yöntem genom mühendisliği gibi yeni teknolojilerle kombine edilebilir.

Dönüşüm, mısırda yabancı gen ekspresyonunu değerlendirmek ve hem araştırma hem de ticari amaçlar için genetiği değiştirilmiş mısır hatları üretmek için temel bir araçtır. Yüksek iş dönüşümlerine erişim, mısır moleküler ve hücresel biyoloji çalışmaları için artan ihtiyacı kolaylaştırabilir1. Mahsul türlerini genetik olarak dönüştürme yeteneği hem kamu hem de özel laboratuvarlar için hayati önem taşımaktadır. Bu, gen düzenleme mekanizmalarının temel olarak anlaşılmasına ve sürekli büyüyen bir nüfusu desteklemek için küresel ölçekte mahsul gelişimine olanak sağlar.
Mısırdan olgunlaşmamış embriyoların regenerable nasır üretimi için kullanılabileceğinin keşfi 19752yılında ortaya çıkmıştır. Bu vahiy bu yana, en ölçeklenebilir mısır dönüşüm protokolleri rejenerasyon önce nasır oluşumu ve seçimi gerekli3. Genetik dönüşüm sürecinde, Agrobacterium-enfekte veya biyolistik-bombardımanlı olgunlaşmamış embriyolar embriyojenik nasır indüksiyon için medya kültürlü. İndüklenen calli daha sonra seçici medyada kültürlenir (örneğin, herbisit içeren) böylece sadece dönüştürülmüş nasır parçaları hayatta kalabilir. Bu herbisit dirençli putatif transgenik calli kadar toplu ve bitkiler halinde rejenere edilir. Bu yöntem etkili olmakla birlikte, süreç uzun ve emek yoğun, ve 4tamamlamakiçin 3 ay yukarı sürebilir. Daha da önemlisi, konvansiyonel mısır dönüşüm protokolleri çok daha büyük bir sınırlama sahip, yani, mısır genotipleri sadece sınırlı sayıdadönüştürülebilir 5,6.
Lowe ve ark.7,8 daha önce sadece büyük ölçüde dönüşüm sürecinin süresini azalttı ama aynı zamanda dönüştürülebilir genotipler listesini genişletti bir "QuickCorn" dönüşüm yöntemi bildirdi. QuickCorn yöntemi mısır orthologs kullanır(Zm-Bbm ve Zm-Wus2) Arabidopsis transkripsiyon faktörleri BABY BOOM (BBM)9 ve WUSCHEL (WUS)10. Dönüşüm vektör sistemine dahil edildiğinde, bu genler sinerjik olarak embriyojenik büyümeyi uyarmak için çalışır7.
Bu çalışmada açıklanan QuickCorn protokolü Jones ve ark11protokolüne dayanıyordu , hangi lowe ve ark tarafından bildirilen yöntemin bir daha iyileştirilmesi oldu7,8. Bu çalışmada, php81430 (Şekil 1) ve aksesuar plazmid PHP7153912 ikili vektör yapısına yataklık eden bir Agrobacterium strain LBA4404(Thy-) dönüşüm için kullanılmaktadır. PHP81430'un T-DNA'sı aşağıdaki moleküler bileşenleri içerir. (1) Transformasyon selektif marker gen Hra ekspresyon kaseti. Mısır Hra (Zm-Hra) geni, sülfonilüreler ve imidazolinones13,14gibi ALS inhibe herbisitlere toleranslı modifiye asetonaktaz (ALS) genidir. Zm-Hra geni sorgum ALS promotörü8 ve patates proteinaz inhibitörü II(pinII) terminatör15tarafından düzenlenir. T-DNA da içerir (2) dönüşüm ekranlı marker gen ZsGreensahip bir ifade kaseti . Zoanthus sp. resif mercan16 bu yeşil floresan protein geni ZsGreen bir sorgum ubiquitin organizatörü / intron ve pirinç ubiquitin sonlandırıcı tarafından düzenlenir.
Ayrıca, T-DNA içerir (3) morfojenik gen Bbm ekspresyon kaset. Bbm embriyogelişimi9,17ile ilişkili bir transkripsiyon faktörüdür. Bbm mısır fosfolipid transferaz proteini tarafından düzenlenir (Pltp) organizatörü8 ve pirinç T28 terminatör18. Zm-Pltp embriyo scutellar epitel güçlü ekspresyon ile bir gendir, ipek kıllar, ve yaprak yan hücreleri (koruyucu hücreleri yan), üreme organlarında düşük ekspresyon, ve kökleri hiçbir ifade8. Ayrıca (4) morfojenik gen Wus2 ekspresyon kaset içerir. Wus2 apikal meristem19bakımı ile ilişkili başka bir transkripsiyon faktörüdür. Zm-Wus2 bir mısır auxin-indüklemez organizatörü kontrolü altındadır (Zm-Axig1)20 ve mısır In2-1 terminatör21. Son olarak, T-DNA içerir (5) cre-loxP rekombinasyon sistemi. Cre rekombinaz gen22 mısır ısı şok protein 17.7(Hsp17.7)23 promotör ve patates pinII terminatör kontrolü altındadır. İki loxP siteleri (aynı yönde) ZsGreendahil olmak üzere24 kanat dört gen ekspresyonu kasetleri , cre, Bbm ve Wus2.
Morfojenik genlerin varlığı bitki olgunluğu ve sonraki soyundan için istenmediği için, Normal nasır yenilenmesi ve bitki gelişimine olanak sağlamak için mısır genomundaki morfojenik genleri çıkarmak için T-DNA'ya ısıya bağlı kre-loks rekombinasyon sistemi inşa edilmiştir. Isıl işlem den sonra, CRE proteininin ekspresyonu Hra seçim geni hariç tüm transgenleri ortadan kaldırır. Başarılı dönüştürücüler herbisit dirençli ama ZsGreen-negatif olmalıdır. Dönüşüm sıklığını daha da artırmak için, Agrobacterium zorlanma da ek bir aksesuar plazmid barındırır (PHP71539) Agrobacterium virrulence ekstra kopyaları vardır (vir) genler12.
QuickCorn yöntemi geleneksel mısır dönüşüm protokollerinden farklıdır, çünkü dönüşüm sırasında nasırlı indüksiyon adımı içermez. Agrobacteriumile enfeksiyon dan sonra ilk hafta boyunca , somatik embriyolar enfekte olgunlaşmamış embriyoların scutellar epitel üzerinde geliştirmek. Embriyolar daha sonra embriyo olgunlaşma ve çekim oluşumunu teşvik hormonlar ile bir ortama aktarılır. Somatik embriyoların olgunlaşma/sürgün oluşumuna hızla aktarılması, daha önce mısır dönüşümünde kullanılan geleneksel nasır evresini atlar ve T0 bitkilerinin doğrudan üretimine izin verir8. Daha önce yayınlanan mısır dönüşüm yöntemleri6ile karşılaştırıldığında, QuickCorn yöntemi daha hızlı, daha verimli ve daha az genotip bağımlı. Bu yöntemi kullanarak, köklü bitkiler genellikle sadece 5-7 hafta içinde toprağa aktarmak için hazır, yerine üç veya daha fazla ay geleneksel protokoller tarafından gerekli. Bu makalenin amacı, genellikle çoğu akademik kurumda bulunan bir laboratuvar ortamında daha kolay çoğaltılmasını sağlayan, yöntemin derinlemesine bir açıklamasını ve gösterisini sağlamaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4-D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D7299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To cover the flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh small quantities of chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocalve</td>
			<td>Primus (Omaha, NE)</td>
			<td>PSS5-K</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial culture loop (10 &#181;l)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td>Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactoagar</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1 L, 2 L, 4 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix the chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#45339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>For seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Hydrolysate</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>C380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube (50 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td>Contain liquid medium and Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette (Semi-micro)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>To hold liquid for measuring OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicamba</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>D159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hygrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Checking temperature and humidity for heat treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (2.0 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriksson&#39;s Vitamins</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>E330</td>
			<td>1000x in liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilizing tools and surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)</td>
			<td>A903206</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>10-090E</td>
			<td>To autoclave media and tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats (Standard 1020, open w/holes, 11&#34;W x 21.37&#34;L x 2.44&#34;D)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11300000</td>
			<td>Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine-tipped and large)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>G-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (1 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>To autoclave medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To adjust volume of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imazapyr</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>37877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 20 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 27 &#176;C</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>Model I-36NL</td>
			<td>To grow co-cultivation plate and maize embryo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 45 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat shock treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert TO Standard, pots</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>11030000</td>
			<td>For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Maintains sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>P698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed B73</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=47638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed Mo17</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=15785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize inbred seed W22</td>
			<td>U.S National Plant Germplasm</td>
			<td>id=61755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water purification systems</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td>For tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6 Basal Salt Mixture</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paperclips, non-skid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding on tassel bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x15 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For bacteria culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100x25 mm)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB0875711</td>
			<td>For the plant tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB150</td>
			<td>To adjust pH of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1 mL)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>4641100N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Boxes</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>10048430</td>
			<td>For tissue culture storage and incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic humidy dome (Humi-Dome)</td>
			<td>Hummert International (Earth City, Mo)</td>
			<td>14385100</td>
			<td>Plastic cover for soil flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>793582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To weigh chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade (No. 11, 4 cm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td>remove the top of the kernel crowns for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Holding scalpel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schenk &#38; Hildebrandt Vitamin (S&#38;H vitamin)</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>S826</td>
			<td>100x powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cutting ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoot bag (Canvasback- semi-transparent)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>S26</td>
			<td>Semi-transparent bag to cover ear shoots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soiless substrate LC1</td>
			<td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td>
			<td>#521</td>
			<td>For growing maize plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Double Ended Micro-Tapered)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2140110</td>
			<td>Dissecting embryos from kernels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (with spoon)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-300000</td>
			<td>Measure OD of Agro suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring bar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-513-67</td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hotplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To mix media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (without needle, 60 mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-43</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td>For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback- brown)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514</td>
			<td>Bag to cover tassels of non-transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel bag (Canvasback-green stripe)</td>
			<td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td>
			<td>T514G</td>
			<td>Bag to cover tassels of transgenic plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thidiazuron</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>T869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cas #9005-64-5</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0236</td>
			<td>Homogenizes liquids (Agro suspension)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (large - Precision model 186)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 &#176;C</td>
			<td>Keeps autoclaved media at optimal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>To measure chemicals for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP14222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z0164</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes

Burada gösterilmiştir Agrobacteriumiçin ayrıntılı bir protokol-morfojenik genler Baby boom (Bbm)ve Wuschel2 (Wus2)kullanarak mısır inbred hatlarının genetik dönüşümü aracılı. Bbm mısır fosfolipid transferaz geni tarafından düzenlenir (Pltp) organizatörü, ve Wus2 bir mısır auxin-inducible kontrolü altındadır (Axig1) organizatörü. Transfer DNA 'sı (T-DNA) ve Agrobacterium virrulence(vir)genlerinin ekstra kopyalarını taşıyan bir Agrobacterium suş olgunlaşmamış embriyo ekbitkileri enfekte etmek için kullanılır. Somatik embriyolar enfekte embriyoların scutella formu ve herbisit direnci tarafından seçilebilir ve bitkilere çimlenmiş. DNA yapısına yerleşik ısı ile aktive edilmiş bir kre/loxP rekombinasyon sistemi, dönüşüm sürecinin erken bir aşamasında morfojenik genlerin mısır genomundan çıkarılmasına olanak sağlar. Bu protokol kullanılarak W22, B73 ve Mo17 için yaklaşık %14, %4 ve %4'lük dönüşüm frekansları (100 enfekte embriyo başına bağımsız transgenik olay sayısı) elde edilebilir.

Burada gösterilmiştir Agrobacteriumiçin bir adım-adım protokol-üç kamu mısır inbred hatları (B73, Mo17 ve W22) bu mısır genetiği alanında önemli olmuştur genetik dönüşüm aracılı. Konvansiyonel mısır dönüşüm protokolleri5kullanılarak üç bred hattının dönüşümü sağlanamadı. Şekil 1 ve Şekil 2, sırasıyla burada kullanılan yapı ve başlangıç malzemelerini göstermektedir. Kulaklar genellikle tozlaşmadan 9-12 gün sonra hasat edilir. Uzunlukları 1,5-2,0 mm arasında değişen İzLer, bu protokol için dönüşüm için en iyi ekstesilerdir (Şekil 2).
Enfeksiyondan sekiz gün sonra, ZsGreen-ifade somatik embriyolar bir floresan mikroskop GFP kanalı altında görselleştirilmiş(Şekil 3). Enfekte İzBS enfeksiyondan 8 gün sonra ısıl tedaviye tabi tutuldu (5.1 ve 5.2. adım). Bu tedavi BBmexcised CRE rekombinaz ekspresyonu indüklenen , Wus2, cre, ve ZsGreen ifade kasetleri iki loxP siteleri arasında kuşatılmış(Şekil 1). Isıl işlem görmüş dokular daha sonra morfojenik gen çıkarılmasından sonra dönüştürülmüş doku seçimi için herbisit imazapyr içeren ateş oluşum ortamı kültürlü edildi.
Olgunlaşma embriyoları veya imazapyr dirençli ateş tomurcukları ile çoğalan dokular enfeksiyondan yaklaşık 3-4 hafta sonra gözlenmiştir(Şekil 4). Bazı imazapyr dirençli dokular ZsGreen için negatif, cre-aracılıeksizyon büyük olasılıkla bu dokularda meydana geldiğini düşündürmektedir(Şekil 4). Dokular köklendirme orta ve hafif kuluçkaya taşındıktan sonra sürgünler gelişmeye başladı (Şekil 5). Sağlıklı ve güçlü büyüyen sürgünler gelişmiş kökleri ile hasat edildi(Şekil 5). Bazı dokularda birden fazla sürgün olduğu ortaya çıkmıştır(Şekil 5E,F,G). "Çimenli" regenerant Bu tür aynı transgen entegrasyon desenleri olan klonal bitkiler nedeniyle olabilir. Bu bitkileri genotiplemek için moleküler biyolojik analiz gereklidir.
Her üç kamu inbred hatları iyi bu protokol yanı sıra bu çalışmada kullanılan yapı kullanarak yanıt verdi. W22 yaklaşık % 14 (100 enfekte olgunlaşmamış embriyo başına yaklaşık 14 transgenik sürgünler) bir frekans ile, imazapyr dirençli sürgünler en yüksek frekans üretti. Hem B73 hem de Mo17 yaklaşık %4 transgenik sürgün ler üretti. Bu frekanslar, hem morfojenik genleri taşıyan bitkiler hem de CRE aracılı eksizyon tarafından çıkarılan morfojenik geni olan bitkiler de dahil olmak üzere tüm transgenik sürgünleri göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> Şekil 1: İkili plazmid PHP81430 T-DNA bölgesinin şematik gösterimi. RB = sağ T-DNA sınırı; loxP = CRE rekombinaz hedef bölgesi; Axig1pro:Wus2 = mısır auxin-indükleyici (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + mısır In2-1 terminatör; Pltppro:Zm-Bbm = mısır fosfolipid transferaz proteini (Zm-Pltp) promotör + Zm-Bbm + rice T28 terminatör (Os-T28); Hsppro:cre = mısır ısı şok proteini 17.7 promotör (Zm-Hsp17.7) + cre rekombinaz geni + patates proteinaz inhibitörü II (pinII) terminatör; Ubipro:ZsGreen = sorgum ubiquitin promotör / intron (Sb-Ubi) + yeşil floresan protein ZsGreen gen + pirinç ubiquitin terminatör (Os-Ubi); Hra kaset = sorgum asetokaktaz synthase (Sb-Als) promotör + mısır Hra (Zm-Hra) gen + pinII terminatör; LB = Sol T-DNA sınırı; colE1, plazmid ColE125çoğaltma kökeni ; SpecR = bakteri seçimi için Tn21'den spectinomisin dirençli gen aadA1 26; Rep A,B,C = Agrobacterium rhizogenes27pRiA4 gelen çoğaltma kökeni . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> Şekil 2: Başlangıç malzemeleri. B73 kulakları 12 gün post-pollinasyon hasat (A). B73(B), Mo17 (C) ve W22(D)embriyolarının olgunlaşmamış embriyoları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> Şekil 3: Dinlendirme de doku gelişimi 1 hafta sonrası enfeksiyon. Mo17(A) ve W22(B)somatik embriyoları ifade GFP gösteren bir floresan mikroskobu (GFP filtresi) altında embriyolar (8 gün sonrası enfeksiyon) Parlak alan(C)ve GFP filtresi(D)altında doku (B73) geliştirme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> Şekil 4: Olgunlaşma ortamı nda doku gelişimi seçimi ile. Bir W22 olgunlaşma plakası (A). Parlak alan(B)ve GFP filtresi(C)altında gelişen doku (Mo17, enfeksiyon sonrası 15 gün). Parlak alan(D)ve GFP filtresi(E)altında gelişen doku (Mo17, enfeksiyon sonrası 28 gün). Oklar GFP ekspresyonu eksik dokuların rejenerasyon işaret, ısı kaynaklı CRE protein aktivitesi sonra loxP siteleri arasında ZsGreen genin eksizyonu düşündüren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> Şekil 5: Kökleme ortamında doku gelişimi. W22(A), B73 (B) ve Mo17(C,D)sürgünleri. B73(E)ve W22(F,G)birden fazla sürgün (çimenli regenerants) ile olay. B73 (H) ve W22(I)kökleri ile sürgünler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Mısır dönüşümü için ortam kompozisyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Bitki morfojenik genler inatçı genotiplerin genetik dönüşümlerini iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan bir Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm (QuickCorn) üç önemli kamu mısır inbred hatları için protokoldür.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Çoğu mısır inbred hatları genetik geleneksel dönüşüm protokolleri kullanılarak dönüştürülemez. Burada, hızlı ve daha az genotip bağımlı bir QuickCorn dönüşüm yöntemi açıklar. QuickCorn yöntemi mısır transkripsiyon faktörleri BABY BOOM ve WUSCHEL kullanır.Dönüşüm vektör sistemine dahil edildiğinde, bu genler sinerjik olarak embriyojenik büyümeyi teşvik etmek için çalışırlar. Geleneksel mısır dönüşüm protokollerinin aksine, QuickCorn yöntemi dönüşüm sırasında bir nasır indüksiyon adımı içermez. Çalışmamızda kullanılan ikili vektörün T-DNA bölgesi üç temel bileşen, morfojenik genler, marker genleri ve cre/loxP rekombinasyon sistemini içerir.Isıya bağlı kre/loxP rekombinasyon sistemi, bitki gelişiminde normal nasır rejenerasyonuna izin vermek için mısır genomundaki morfojenik genleri çıkarmak için T-DNA'ya dahil edildi. İpeklerin ortaya çıkmasından yaklaşık 2-3 gün sonra polen ler ertesi gün mevcut olacaksa, ipekleri ve kabuğu %70 etanol sterilize edilmiş makasla, ipeklerin ortaya çıktığı kabuğun ucunun yaklaşık 2,5 santimetre altında, kesilen ve bir ateş torbasıyla kaplayın. Bir kez anthers bir püskül ortaya, püskül bir püskül torba ile kapağı ve sap etrafında çantanın tabanına kaymaz bir ataş yerleştirin.Püskül lülesini yerleştirdikten sonra sabah, bitkiyi hafifçe bükün ve polenlerin serbest bırakılmasını teşvik etmek için torbaya dokunun. Sonra püskül lüzmunu çıkarın ve polenlerin kaçmasını önlemek için torbanın üst kısmını katlayın. Alıcı bir bitkiyi tozlaşmak için, ipek ortaya çıkarmak ve hızlı bir şekilde ipek üzerine püskül torbasından polen dökün.Hemen püskül lüzmuyla tozlanmış kulağı kapatın ve sapın etrafındaki çantanın tabanını zımbalarla sabitlayın. Olgunlaşmamış embriyo boyutunu kontrol etmek için, tozlaşmadan 9 ila 12 gün sonra, yavaşça kulak çevresi nin yaklaşık 1/3 ila 1/4 çekirdekleri ortaya çıkarmak için kabuğu aşağı çekin ve kulak aşağı mesafe yaklaşık 1/3. Boyut ve renk diğer çekirdeklerin çoğunluğu benzer görünen tek bir çekirdeğin kapağını kesmek için bir neşter kullanın ve embriyo ayıklamak için bir cetvel ile bir spatula kullanın.Sonra embriyo uzunluğunu ölçmek için cetvel veya kaliper kullanın. Hasattan sonraki bir ila dört gün içinde, hasat edilen kulaklardan kabukları ve ipekleri çıkarın ve her kulağın üst veya tabanına uygun bir sap takın. Kulakları, kolu yukarı bakacak şekilde steril laminar akış kaputunda büyük bir dezenfeksiyon çamaşır suyu çözeltisi kabına batırın.20 dakika sonra, kulakların birkaç dakika kurumasını vermeden önce yıkama başına beş dakika boyunca cömert bir tatlı steril distile su hacmi ile kulakları üç kez durulayın. Daha sonra, 700A sıvı orta ile kulak başına bir iki mililitrelik mikrosantrifüj tüp doldurun ve kulak endosperm ortaya çıkarmak için her çekirdek taç üst bir ila iki milimetre kaldırmak için steril bir neşter kullanın. Kabın eki yakınında, kulağın ucuna bakan tarafta çekirdek içinde olgunlaşmamış embriyo bulun.Üst düzey işleyici ve sağ elli operatörler için, kulağı büyük steril petri kabına koyun ve embriyodan en uzak pericarp'taki endosperme mikro spatula yerleştirin. Yavaşça endosperm yerinden ve embriyo ortaya çıkarmak için yukarı doğru büküm ve dikkatle 700A sıvı orta bir tüp içine embriyo yerleştirmek için spatula kullanın. Sol el ile kulağı tutan baz işleyici operatörleri için, embriyodan en uzak pericarp'taki endosperme mikro bir spatula yerleştirin ve endospermi çıkarmak için yavaşça yukarı doğru bükün.Bir Agrobacterium süspansiyon kültüründe embriyolar kültür için, 700A sıvı orta 10 mililitre içine yeni hazırlanmış çalışma plakası bakteri toplamak ve girdap tamamen bakteri kültürünü askıya almak için. Optik yoğunluğu 550 nanometre dalga boyunda ölçün ve embriyoları bir mililitre taze 700A orta ile yıkayın. Embriyoları bir mililitre Agrobacterium süspansiyonuna batırın ve 30 saniye boyunca düşük bir ayarda girdap.562V ortak yetiştirme aracının ayrı ayrı plakaları üzerine her tüpün tüm içeriğini aktarmadan önce beş dakika boyunca yatay bir yönde tüpler ile bankta embriyolar yerleştirin. Yavaşça eşit embriyolar dağıtmak için plakaları girdap, ve aşırı Agrobacterium süspansiyon aspire. Dikkatle kubbe şeklinde tarafı yukarı bakacak şekilde embriyolar yönlendirmek, embriyolar zarar önlemek için özen.Sonra karanlıkta 21 santigrat derece bir gecede kuluçka için plastik kutular içine plakalar yerleştirin. Ertesi sabah, dikkatlice dinlenme orta 605T üzerine enfekte embriyolar transfer, plaka başına yaklaşık 30 embriyo yerleştirin, scutellum yan kadar, karanlıkta 26 santigrat derece de dört ila 10 günlük kuluçka için. Yaklaşık yedi gün içinde, somatik embriyo gelişimi zigotik scutellum yüzeyinde görülebilir.Dinlenme süresinin sonunda, embriyo kutusunu 45 derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve ardından karanlıkta 26 santigrat derecede bir ila iki saatlik kuluçka yada bir ila iki saatlik bir kuluçka oranı na sahip olun. Kuluçka sonunda, seçici bir ajan olarak herbisit imazapyr litre başına 05 miligram ile takviye ateş oluşumu orta bireysel plakalar üzerine 10 ila 15 ısı şoklu olgunlaşmamış embriyolar yerleştirin. Gerektiği gibi coleoptileleri dikkatlice çıkarın ve embriyoları iki hafta boyunca 26 derecelik koyu kuvöze geri götürün.Kuluçka sonunda, 16 saat ışık ve 27 santigrat derecede sekiz saat karanlık ile bir-iki haftalık kuluçka için orta plakalar köklendirme üzerine plaka başına doku yaklaşık sekiz adet aktarın. Plantetler geliştikçe, yedi ila 14 gün boyunca ışık altında orta kökleme bireysel plakalar üzerine hem sürgünler ve güçlü kökleri içeren güçlü bir plantlet yerleştirin. Toprağa taşınmaya hazır olana kadar bir ila iki hafta boyunca aynı ortamda kuluçkaya yatabilecek şekilde tam olarak gelişmemiş sürgünlere izin verin.Bitki daha güçlü hale geldikçe, agar kaldırmak için musluk suyu ile kökleri durulayın. Daha sonra drenaj delikleri olan bir tepsi içinde önceden ıslak topraksız bir substrat içeren üç inç tencere içine bireysel bitkiler nakli ve plastik bir nem kubbe ile veya olmadan bir büyüme odasına tepsi yerleştirin. Pot transferinden 9 ila 14 gün sonra, her bitkiyi toprakla birlikte 1,5 galonluk bir tencereye nakledin.Pota kontrollü bir gübre ekleyin ve seradaki bitkileri koruyun. Kulak sürgünleri bitkiden çıkmaya başladığında, ortaya çıkan ipeklerin torbayı çıkarmadan gözlemlenebilmeleri için sürgünleri kapsayacak şekilde yarı saydam bir sürgün torbası kullanın. Daha sonra bitkilerin gelişimin uygun aşamasında tozlaşmak gösterildiği gibi.Mısır kulakları genellikle tozlaşmadan 9 ila 12 gün sonra hasat edilir. Uzunlukları 1,5 ile iki milimetre arasında değişen olgunlaşmamış embriyolar bu protokol için dönüşüm için en iyi eksperlerdir. Enfeksiyondan sekiz gün sonra, ZsGreen ifade somatik embriyolar floresan mikroskopi ile görselleştirilmiş olabilir.Isıl işlem sekiz gün sonra enfeksiyon cre rekombinaz ekspresyonu indükler, morfojenik gen eksizyonu ile sonuçlanan, cre, ve ZsGreen ifade kasetleri iki loxP siteleri arasında çevrili. Herbisit içeren çekim formasyon uzerine 3-4 hafta süren kültürden sonra, olgunlaşan embriyolar ile çoğalan dokular veya herbisite dirençli ateş tomurcukları görülebilir. Herbisit dirençli dokuların bazıları ZsGreen için negatif olabilir, cre aracılı eksizyon muhtemelen bu dokularda meydana geldiğini düşündürmektedir.Dokuların köklenme ortamına ve hafif kuluçkaya taşınmasından sonra, sağlıklı, dinç, iyi gelişmiş köklere sahip büyüyen sürgünler hasat edilebilir. Bazı dokuların muhtemelen aynı transgen entegrasyon desenlerine sahip klonal bitkiler nedeniyle birden fazla sürgünleri var gibi görünebilir unutmayın. QuickCorn yöntemi büyük ölçüde mısır dönüşüm verimliliğini artırmak ve dönüştürülebilir genotipler listesini genişletmek.Protokol, minimum mısır dönüşüm eğitimi ne olursa olsun araştırmacılar tarafından başarıyla çoğaltılabilir. QuickCorn yöntemini kullanarak, köklü bitkiler enfeksiyon gününden sonra sadece beş ila yedi hafta içinde toprağa aktarmak için hazır olmalıdır. Orta kompozisyona, alt kültürlerin zamanlamasına, sıcaklık ve aydınlatma koşullarına dikkat edin.Başarılı dönüşüm için başlangıç malzemelerinin kalitesi de gereklidir. Bu protokolde kullanılan kimyasallar, çamaşır suyu çözeltisi ve herbisit biyolojik olarak tehlikelidir. Lütfen kullanımları sırasında uygun kişisel koruma ekipmanLarını kullandığınızdan emin olun.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Advancing Gene Editing in Bamboo Leaves for Sustainable Plastic Alternatives (Video) | JoVE

Burada: Planta Moso Bambu Yapraklarında Gen İfadesi ve Gen Düzenleme

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...