Name: larvaspa, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging at JoVE.com

Vi takker Lingfeng Tang for at etablere en tidligere version af LarvaSPA-metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine butik for at gøre tidligere prototyper af billedbehandling kammer; Philipp Isermann til fremstilling af metalrammer og forslag til fremstilling af PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging facilitet for adgang til mikroskoper (finansieret af NIH tilskud S10OD018516); Maria Sapar for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en Cornell Fellowship tildelt HJ; en Cornell-startfond og NIH-tilskud (R01NS099125 og R21OD023824), der blev tildelt C.H.H.J. og C.H., udtænkte projektet og designede forsøgene. H.J. udførte eksperimenterne. H.J og C.H. skrev manuskriptet.

1. Gør billedkammeret
<ol><li>Metalrammen kan konstrueres fra en aluminiumsblok i et typisk maskinværksted. Rammens specifikationer er illustreret i figur 1A.</li>
	<li>For at konstruere billedkammeret forsegles bunden af metalrammen med en lang dæksel (22 mm x 50 mm) og UV-lim (figur 1A). Kurer UV-limen ved hjælp af en håndholdt UV-lampe.</li>
</ol>2. Fremstilling af PDMS cuboids
<ol><li>Forbere...

<ol>
	<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li><li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo.">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+axonal+trafficking+via+a+novel+live-imaging+technique+reveals+distinct+hedgehog+transport+kinetics.">Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics.</a> Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunostaining+of+hemocyte+compartments+in+Drosophila+for+live+imaging.">In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging.</a> PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).</li><li>Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-driven+membrane+markers+for+analysis+of+nonautonomous+mechanisms+reveal+neuron-glia+interactions+in+Drosophila.">Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+Selectivity+in+Drosophila+Proprioceptors+Requires+the+Mechanosensory+Channel+Tmc.">Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc.</a> Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).</li><li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Vaadia, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Proprioceptive+System+Dynamics+in+Behaving+Drosophila+Larvae+Using+High-Speed+Volumetric+Microscopy.">Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy.</a> Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).</li><li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+imaging+chamber+for+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae.">Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology.">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junctions+to+study+synapse+assembly.">In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+intact+Drosophila+larvae+at+sub-cellular+resolution.">In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance.">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).</li><li>Chaudhury, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+chip+cryo-anesthesia+of+Drosophila+larvae+for+high+resolution+in+vivo+imaging+applications.">On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li><li>Poe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+space-filling+requires+a+neuronal+type-specific+extracellular+permissive+signal+in+Drosophila.">Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam.">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).</li><li>Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+injury+triggers+DLK-independent+regeneration.">Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration.</a> Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+Externalization+Results+from+and+Causes+Neurite+Degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li><li>Desjardins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awake+Mouse+Imaging:+From+Two-Photon+Microscopy+to+Blood+Oxygen+Level-Dependent+Functional+Magnetic+Resonance+Imaging.">Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging.</a> Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+optical+brain+imaging+in+live+adult+fruit+flies.">Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies.</a> Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li></ol>

Her beskriver vi LarvaSPA, en alsidig metode til montering af levende Drosophila larver til langsigtet tidsforfaldsbilleddannelse. Denne metode kræver ikke genvinding eller genmontering af larver, hvilket muliggør uafbrudt billeddannelse. Det er derfor ideelt til sporing af biologiske processer, der tager timer at fuldføre, såsom dendrite degeneration og regenerering. Denne metode kan også bruges til billeddannelse intracellulære calcium dynamik og subcellulære begivenheder såsom microtubule vækst. Da l...

Time-lapse live imaging er en kraftfuld metode til at studere dynamiske cellulære processer. Den rumlige og tidsmæssige oplysninger fra time-lapse film kan afsløre vigtige detaljer for besvarelse af cellebiologi spørgsmål. Den Drosophila larver har været en populær in vivo model for undersøgelser ved hjælp af levende billeddannelse, fordi dens gennemsigtige krop væg giver mulighed for noninvasive billeddannelse af interne strukturer1,2. Desuden findes der talrige genetiske værktøjer i Drosophila til fluorescerende mærke anatomiske strukturer og makromolekyler3. Men, langsigtet tid-lapse billeddannelse af Drosophila larver er udfordrende. I modsætning til stationære tidlige embryoner eller pupper, Drosophila larver bevæge sig konstant, nødvendiggør immobilisering for live imaging. Effektive måder at immobilisere levende Drosophila larver omfatter montering i halocarbon olie med chloroform4, bedøvelse ved hjælp af isofluran eller Dichlorvos opløsning5, og komprimere mellem dæksrids og mikroskop dias6. Selv om nogle af disse metoder er blevet brugt til mikroskopi, ingen af dem er effektiv til langsigtet live imaging. Andre metoder blev udviklet til billeddannelse kropsvæg neuroner i kravle nde larver ved hjælp af konventionelle konfokale mikroskopi eller light-sheet mikroskopi7,8,9. Men disse metoder er ikke ideelle til overvågning cellulære dynamik på grund af flytning af larver.
Der er udviklet nye metoder for at opnå langsigtet tidsforfaldsscanning af Drosophila larver. Ved hjælp af en polydimethylsiloxan (PDMS) "larver chip", Drosophila larver kan effektivt immobiliseres gennem vakuum-genereret suge i et specialiseret mikrokammer uden bedøvelse. Men denne metode tilbyder ikke høj tidsmæssig opløsning for cellebiologi undersøgelser, og det har strenge begrænsninger på dyrs størrelse10. En anden metode ved hjælp af en anæstesianordning opnået levende billeddannelse af Drosophila larver på flere tidspunkter og er blevet anvendt til at studere neuromuskulære vejkryds11,12,13,14,15,16. Men, denne metode heller ikke giver mulighed for kontinuerlig billeddannelse i længere end 30 min og kræver brug af desflurane gentagne gange, som kan hæmme neurale aktivitet og påvirke den biologiske proces undersøgt17,18. For nylig, en ny metode, der kombinerer mikrofluidic enhed og kryoanesthesi er blevet brugt til at immobilisere larver i forskellige størrelser i korte perioder (minutter)19. Denne metode kræver dog specialiserede anordninger såsom et kølesystem, og længere perioder med immobilisering kræver gentagen afkøling af larverne.
Her præsenterer vi en alsidig metode til immobilisering Drosophila larver, der er kompatibel med uafbrudt time-lapse billeddannelse i længere end 10 timer. Denne metode, som vi kalder "Larva Stabilisering af delvis vedhæftet fil" (LarvaSPA), indebærer at overholde larve neglebånd til en coverslip til billedbehandling i en specialbygget billedbehandling kammer. Denne protokol beskriver, hvordan man laver billedkammeret, og hvordan man monterer larver på en række udviklingsstadier. I LarvaSPA-metoden anbringes de ønskede kropssegmenter på dækstrækket ved hjælp af en UV-reaktiv lim. En PDMS cuboid desuden anvender pres på larverne, forhindrer flugt. Luft og fugt i billedkammeret sikrer overlevelsen af de delvist immobiliserede larver under billeddannelse. Fordele ved LarvaSPA i forhold til andre teknikker omfatter følgende: (1) Det er den første metode, der giver mulighed for kontinuerlig live imaging af intakte Drosophila larver i timevis med høj tidsmæssig og rumlig opløsning; (2) Metoden har færre begrænsninger for larvestørrelse; (3) Billedkammeret og PDMS-kuboider kan fremstilles til en minimal pris og kan genbruges.
Ud over at beskrive larve montering metode, giver vi flere eksempler på dens anvendelse til at studere dendrite udvikling og dendrite degeneration af Drosophila dendritic arborization (da) neuroner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6061 Aluminum bars</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M double-sided tape</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Scotch Packaging tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>1.88&#34;W x 22.2 Yards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT #3 Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-241-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Azer Scientific</td>
			<td>1152250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Midwest Veterinary Supply</td>
			<td>193.33161.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 equipped with a resonant scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Berkshire</td>
			<td>LN90.0406.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (small)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 kit (PBMS kit)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferring pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1371126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV glue</td>
			<td>Norland products</td>
			<td>#6106, NOA 61</td>
			<td>Refractive Index 1.56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp (Workstar 2003)</td>
			<td>Maxxeon</td>
			<td>MXN02003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larvaspa, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging

Live imaging er en værdifuld tilgang til at undersøge cellebiologi spørgsmål. Den Drosophila larver er særligt velegnet til in vivo live imaging fordi larve kroppen væggen og de fleste indre organer er gennemsigtige. Men kontinuerlig live imaging af intaktE Drosophila larver i længere end 30 min har været udfordrende, fordi det er vanskeligt at noninvasively immobiliserende larver i lang tid. Her præsenterer vi en larve montering metode kaldet LarvaSPA, der giver mulighed for kontinuerlig billeddannelse af levende Drosophila larver med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i mere end 10 timer. Denne metode indebærer delvis fastgørelse larver til dæksslip ved hjælp af en UV-reaktiv lim og desuden fastholde larve bevægelse ved hjælp af en polydimethylsiloxan (PDMS) blok. Denne metode er kompatibel med larver på udviklingsstadier fra anden instar til vandrer tredje instar. Vi demonstrerer anvendelser af denne metode i at studere dynamiske processer af Drosophila somatosensoriske neuroner, herunder dendrite vækst og skade-induceret dendrite degeneration. Denne metode kan også anvendes til at studere mange andre cellulære processer, der sker i nærheden af larve kroppen væggen.

Larverneimaging kammer er konstrueret ved limning af en specialfremstillet metalramme og to coverslips sammen. Metalrammens design er angivet i figur 1A. Drosophila larver inde i kammeret holdes til den øverste coverslip ved hjælp af UV-lim og PDMS cuboids. Rillen på PDMS-kuboidog det dobbeltsidede bånd, som kuboider er fastgjort til at skabe plads til at holde larverne (figur 1B,C). PDMS anvender også et let tryk for at flade larvevæggen ...

Watch this Scientific Journal Video about LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging at JoVE.com

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Denne protokol beskriver en metode til montering af Drosophila larver for at opnå længere end 10 timer uafbrudt tid-lapse billeddannelse i intaktlevende dyr. Denne metode kan bruges til at forestille mange biologiske processer tæt på larve kroppen væggen.

LarverSPA, en metode til montering Drosophila Larver for langsigtet Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

LarverPA er den første metode, der giver mulighed for kontinuerlig levende billeddannelse af intakt drosophila larver i mere end 10 timer med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Denne metode bruges til at afsløre dynamiske cellulære processer af larver perifere sensoriske neuroner og til at studere mange andre cellulære processer, der sker i nærheden af larver kropsvæggen. Denne metode er nem at bruge og har mindre begrænsning på larvstørrelse.Seks til ni larver kan monteres i billedbehandlingskammeret på samme tid, hvilket gør forsøget muligt. Billeddiagnostiske kammer på PDMS cuboids kan fremstilles med en minimal pris og kan genbruges. Denne metode er især nyttig til at studere mekanismer af dendrite udvikling og dendrite degeneration ved hjælp af drosophila larver dendritiske tilladelse neuroner.At være i stand til at billedet den samme neuron i timevis kan afsløre, hvordan langsigtede globale ændringer af dendritiske mønstre skyldes kortsigtede adfærd på det enkelte grenniveau. Ved hjælp af PDMS cuboids, der matcher størrelsen af larver vil øge succesraten for immobiliserende larver. Find flere nyttige bånd i vores fejlfindingssektion.Efter konstruktion af en aluminium blok fra en maskine butik, forsegle bunden af metalrammen ved hjælp af en lang dække slip med UV lim. Hærd UV-ledetråden ved hjælp af en håndholdt UV-lampe i 30 sekunder. Fastgør lag af emballagetape til den indvendige overflade af en rektangulær petriskål eller rund cellekulturplade.Brug et lag til anden in-star larver, to lag for begyndelsen af tredje in-star larver, eller tre lag for sent tredje in-star larver. Skær båndet i ture af specifik bredde med et barberblad, 1,5 millimeter for et lag tape og to millimeter for de to lag eller tre lag tape. Efterlad mindst en fem millimeter mellemrum mellem de to strimler.Fjern de båndlag, der dækker rummet. Fjern støv fra pladens indvendige overflade med tape. Derefter er formen klar til brug.For at forberede PDMS mix, bland syv gram PDMS base i 0,7 gram hærdningsmiddel grundigt i en lille beholder. Beholderen sættes i en vakuumeksiccator i mindst 15 minutter for at fjerne luft fra blandingen. Langsomt hæld omkring 5,5 gram PDMS blanding på formen for at nå en en til to millimeter tykkelse.Pdms-blandingen sættes i vakuumeksiccatoren igen i mindst 15 minutter for at fjerne de resterende luftbobler fra blandingen. Bryd de sidste par bobler med en pipettespids. Hærd PDMS på en flad overflade i en varmeinkubator ved 65 grader Celsius i to timer.Brug derefter et barberblad til at løsne de hærdede PDMS langs kanten af formen og løsrive det fra formen. Opbevar PDMS mellem to stykker stor tape ved stuetemperatur. For tidlig og sen tredje in-star larver, skære PDMS i otte med to med en millimeter cuboids ved at placere rillen skabt af båndbåndet i midten af den lange side af kasseformen.For anden in-star larver, skæres kasseformet til otte med en efter en millimeter. For at forberede den øverste dæksel slip til montering, skal du vælge seks PDMS cuboids med riller, der matcher størrelsen af larverne. Fjern støv fra overfladen af PDMS med tape.Fastgør fire stykker dobbeltsidet tape på størrelse med 12 med fem millimeter på en lang dæksel slip på 22 med 50 millimeter for fastsættelse PDMS cuboids senere. Juster mellemrummene mellem de to stykker dobbeltsidet tape til det samme som bredden af PDMS-rillen. Påfør en lille dråbe UV-lim i rillen på hver PDMS-kasse, og tilsæt seks små dråber UV-lim i rummet mellem de dobbeltklæbende bånd på dækslet.For at forberede larverne til montering, ved hjælp af et par saftæt, rense larverne i vand for at fjerne mad fra kroppens overflade. Læg de rene larver på et lille stykke fugtet silkepapir i en lille petriskål uden låg og læg den lille petriskål i en stor petriskål, der indeholder et stykke tørt silkepapir. I en kemisk hætte, bruge en plast overføre pipette til at anvende 160 til 240 mikroliter af isofluran på det tørre silkepapir og lukke låget af den store petriskål.Vent to til tre minutter, mens du overvåger larverne. Når deres mund kroge stoppe med at bevæge sig, tage ud larverne fra den store petriskål. Placer de immobiliserede larver på UV-limen mellem de dobbeltsidede bånd på dækslet slip med dorsale neglebånd vender dækslet slip.Dæk hver larve med en PDMS blok og passer stammen af larverne ind i rillen af PDMS. Lad larvernes hoved og hale stå uden for PDMS-rillen. Undgå at blokere larvernes spiracles ved limen.Tryk ned på enderne af PDMS-blokken på det dobbeltsidede bånd uden at anvende kraft på rillen. Træk forsigtigt i larvens hale for at flade neglebåndet under PDMS. Brug sikkerhedsbriller og brug en håndholdt UV-lampe til at helbrede UV-limen i fire minutter på den høje indstilling.Vend dækslet på hovedet, og brug UV-lampen til at helbrede UV-limen i yderligere fire minutter. Placer et lille stykke linsepapir med en størrelse på 15 gange 30 millimeter i bunden af billedbehandlingskammeret. Fugt papiret med 20 til 30 mikroliter vand.Anstrækket på kammeret, så larverne vender mod indersiden af kammeret. Brug UV-limen til at klæbe begge ender af dækslet til metaloverfladen. Den dorsale side af larverne er klar til billeddannelse under et konfokal mikroskop.Efter billeddannelse skal du fjerne olien på den øverste dækselseddel med linsepapir. Fjern topdækslet fra metalrammen ved at skære ind i rummet mellem dækslet og metalrammen med et barberblad. Billedkammeret er klar til genbrug.Fjern PDMS-kassene fra topdækslet med spån. Rul PDMS-kassene på tape for at fjerne limrester og støv. PDMS-cuboiderne er klar til genbrug.I denne protokol blev drosophila larver immobiliseret i mere end 10 timer til kontinuerlig billeddannelse. Dette tal viser seks sene tredje in-star larver monteret i kammeret. Larvernes stammer blev fastgjort, mens deres hoved og haler var frie til at bevæge sig.Her demonstrerer vi anvendelsen af LarvaSPA i at studere neuronal dendrite dynamik og dendrite degeneration ved hjælp af klasse fire DA neuroner som model. For at kunne immobilisere larver ved hjælp af denne metode, er det vigtigt at stoppe udsætte larver til isofluran, når munden kroge stoppe med at bevæge sig og helbrede UV lim før larver helt vågne op. At studere dendrite degeneration og regenerering, laser skade kan udføres, når larver er immobiliseret i billeddannelse kammer.LarverPA har hjulpet os til at forstå, hvordan dynamisk voksende dendritter undlader at innervate epidermale celler som i hepatisk celle proteoglycans og hvordan phosphatidyserin er udsat for degenererende dendritter efter laser skade. Beskyt øjnene med sikkerhedsbriller, mens UV-lampen skal bruges. Knocking ud larver ved hjælp af isofluran bør udføres i en røghætte.

Research

JoVE Journal

Biology

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langsigtet, høj opløsning Konfokal Time Lapse Imaging af<em&gt; Arabidopsis Kimblad</em&gt; Epidermis under spiring

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Beslag for Langsigtet Light ark mikroskopi af zebrafisk

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-Lapse Video mikroskopi for Vurdering af EYFP-Parkin Aggregering som markør for Cellulær Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

En alsidig metode til montering Arabidopsis blade til Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider til tidsforfald struktureret belysning mikroskopi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Time-lapse Imaging af bakterielle sværme og den kollektive stress respons

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...