Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

نشكر بريانا ألكسندر وتساولان أودونيل ومايكل واركالا على القراءة الدقيقة لهذه المخطوطة وتحريرها. وقد دعم هذا العمل بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم في المعهد الوطني للصحة العامة R01 HL103920، R01 HL134935، R21 OD025323-01 إلى SA؛ ويدعم AJR من قبل HL103920-08S1 NHLBI والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية منحة التدريب T32052283-11.

ووافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة روتجرز على استخدام الحيوانات وإجراءاتها.
1- إعداد الحلول
<ol><li>إعداد 1 لتر من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا مع 0.1٪ تريتون-X-100 (PBST) وتعقيم تصفية. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة عام على الأقل.</li>
	<li>إع...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

وقد وفرت القدرة على تصور البطانة في أجنة الماوس في 3D رؤى جديدة في تطورها3. نقدم هنا بروتوكولًا يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأجنة ، وتصور الاتصال بالأوعية الدموية ، والتحليلات الكمية لتشكيل PAA. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمعرفة كيف تؤثر التعديلات الوراثية أو الإه?...

أثناء تكوين الجنين بالماوس ، تنشأ شرايين القوس البلعومية (PAAs) كأزواج متناظرة ثنائية الأطراف من الشرايين التي تربط القلب بالأورتاي الظهري1. مع تطور الجنين ، يتراجع أول وثاني أزواج PAAs ، في حين أن 3rdو4th و6 TH PAAs تخضع لسلسلة من أحداث إعادة عرض غير متناظرة لتشكيل الشرايين القوس الأبهري2.
وPAAs 3 و 4 و 6 تطوير عن طريق تكوين الأوعية الدموية، وهو تشكيل دي نوفو من الأوعية الدموية3. عيوب في تشكيل أو إعادة عرض هذه الشرايين القوس تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية المختلفة, مثل تلك التي ينظر إليها في المرضى الذين يعانون من متلازمة ديجورج4,5. ولذلك، يمكن أن تؤدي آليات الفهم التي تنظم تطور PAAs إلى فهم أفضل لأمراض القلب الخلقية (CHD).
النهج الحالية لتصور وتحليل تطوير PAA تشمل الفلور المناعي ة من أقسام الأنسجة، يلقي الأوعية الدموية، حقن الحبر الهند، عالية الدقة المجهر episcopic، و / أو كامل جبل المناعيالهيستوكيمياء1،,4،,5،,6،,7. هنا، نحن نصف بروتوكول يجمع بين الفلورالية كامل جبل، المجهر confocal وتقديم صورة 3D من أجل جمع وتحليل وقياس البيانات الحجمية، والاتصال الأوعية الدموية وهوية الخلية. علاوة على ذلك ، نقوم بتفصيل طريقة لتقسيم وقياس أعداد ECs في كل قوس بلعوم كوسيلة لدراسة تشكيل الضفيرة الوعائية القوس البلعومية وإعادة عرضها في PAAs. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل تطوير PAA ، يمكن استخدامه لتحليل شبكات الأوعية الدموية النامية الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

تشكيل غير لائق أو إعادة عرض الشرايين القوس البلعوم (PAAs) 3, 4, و 6 تسهم في بعض من أشد أشكال أمراض القلب الخلقية. لدراسة تشكيل PAAs ، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام الفلور المناعة كامل التركيب إلى جانب الكحول البنزيل / البنزوات (BABB) تطهير الأنسجة ، والمجهر confocal. وهذا يسمح لتصور الاندوثيوليوم القوس البلعوم في دقة الخلوية غرامة، فضلا عن اتصال 3D من الأوعية الدموية. باستخدام البرمجيات، وضعنا بروتوكولالتحديد عدد الخلايا الانتوليالية (ECs) في PAAs، فضلا عن عدد ECs داخل الضفيرة الوعائية المحيطة PAAs داخل أقواس البلعوم 3 و 4 و 6. عند تطبيقها على الجنين بأكمله ، توفر هذه المنهجية تصورًا شاملًا وتحليلًا كميًا للخلايا النفاسية الجنينية.

ينتج بروتوكول الفلوروريسسين الكامل المعروض هنا نتائج واضحة ونظيفة ، مما يسمح بإعادة بناء البطانة القوسية البلعومية ثلاثية الأبعاد ، كما رأينا في الشكل 1A. من المهم احتضان الأجنة لفترة كافية من الوقت في كل محلول من الأجسام المضادة لضمان الاختراق ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

هنا، نصف بروتوكول لتصور وتحليل الشرايين القوس البلعوم3، 4، و 6 من أجنة الفئران باستخدام كامل جبل الفلورالس، تطهير الأنسجة، المجهر الكونكور، وإعادة الإعمار 3D.

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

تسمح هذه الطريقة لكل قوس بالبُل أن تكون مجزأة. ويمكن بعد ذلك أن أرقام الخلايا البطانية يمكن قياسها كميا في كل قوس كوسيلة لدراسة تطور الشريان القوسي البلعوم. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذا النهج في القدرة على تصور العلاقة بين مختلف الهياكل الوعائية والقدرة على تحديد كيفية تأثير الهياكل على المسوخ كمياً.عادة ما تحور الشرايين القوس الأبهري في أمراض القلب الخلقية. يسمح أسلوبنا بدراسة كيفية تغيير الطفرات في العملية الفسيولوجية لتكوين السفينة وإعادة عرضها. على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة للحصول على رؤى في آليات أمراض القلب الخلقية، يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى خاصة مع ظهور المجهر ورقة الضوء.ابدأ باستخدام ماصة زجاجية لنقل كل يوم جنيني ماوس 9.5 أو 10.5 جنين إلى أنابيب ميليلتر فردية تحتوي على ملليلتر واحد من PBS. بعد التثبيت، استخدم ملقطًا ناعمًا لقرصة الجنين بعناية فوق الظهر وقم بقطع عرضية لإزالة النصف الخلفي من الجنين. ل Permeabilize الأجنة، واستبدال برنامج تلفزيوني مع PBST ووضع الأجنة في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، استبدل برنامج PBST بـ 600 ميكرولترات من عازلة الحجب دون لمس الأجنة لاحتضان لمدة 16 إلى 18 ساعة بأربع درجات مئوية مع هياج لطيف. في صباح اليوم التالي، استبدل عازلة الحجب بـ 600 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام لكل أنبوب لاحتضان لمدة أربعة إلى خمسة أيام عند أربع درجات مئوية مع هياج لطيف. في نهاية الحضانة ، وغسل الأجنة في ملليلتر واحد من PBST لمدة أربع إلى خمس ساعات مع التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة تغيير برنامج تلفزيوني كل ساعة ، تليها حضانة بين عشية وضحاها في PBST الطازجة في أربع درجات مئوية وأربعة إلى خمس يغسل ساعة واحدة إضافية في اليوم التالي.بعد الغسيل الأخير، استبدل برنامج PBST في كل أنبوب بـ 600 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوي المناسب لاحتضان لمدة أربعة إلى خمسة أيام عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الأجنة في ملليلتر واحد من PBST الطازجة في غسل كما أظهرت للتو واستخدام ماصة زجاجية لنقل بلطف كل جنين في قوالب البارافين البلاستيكية الفردية. قم بإزالة أي PBST من حول كل جنين بعناية وتوجيه كل جنين في وضع القوس.ثم إضافة بسرعة حوالي 500 ميكرولترات من agarose الساخنة إلى كل قالب حتى يتم تغطية كل جنين فقط ووضع القوالب على الجليد مغطاة رقائق الألومنيوم حتى وقد توطد agarose. لجفاف العينات الجنينية، استخدم مشرط نظيف لقطع كتلة من الأغاروز حول كل جنين واستخدام ملقط لفهم agarose لنقلها إلى أنبوب مليلتر المسمى يحتوي على ملليلتر واحد من 25٪ الميثانول. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف في الظلام، استبدال 25٪ الميثانول مع ملليلتر واحد من 50٪ الميثانول لكل أنبوب لاحتضان ساعة إضافية في الظلام.بعد نهاية الجفاف، استبدال الميثانول 100٪ مع ملليلتر واحد من 50٪ BABB لاحتضان لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف في الظلام. في نهاية الحضانة، استبدال 50٪ BABB مع ملليلتر واحد من 100٪ BABB لكل أنبوب لاحتضان لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف في الظلام، تليها حضانة ثانية مع 100٪ BABB كما هو موضح للتو. لتركيب الأجنة للتصوير، وإزالة لاصقة من الوفير جيدا سريع ووضع المصد على 24 في ستة ملليلتر رقم 1.5 غطاء الزجاج.تطبيق ضغط لطيف على لاصق لإزالة أي فقاعات الهواء بين غطاء والمصد وتجاهل بعناية 100٪ BABB من كل أنبوب. ثم استخدم ملقط غرامة لنقل بعناية الجنين إلى البئر سريع دون لمس الجنين ووضع غطاء الثاني على المصد. لسطح بطانة في قوس البلعوم الثالث بأكمله ، افتح صورة الاهتمام في البرنامج وانقر فوق إضافة سطح جديد.انقر نقرا مزدوجا فوق سطح واحد وإعادة تسمية السطح الجديد إلى قوس البلعوم الثالث. حدد تخطي الإنشاء التلقائي، وتحريره يدويًا، وتعيين اتجاه السطح إلى مستوى YZ. استخدم موضع الشريحة لوضع سطح قوس البلعوم الثالث إلى حيث يتصل PAA الثالث والأبهرتي الظهري.تدوير الصورة بحيث الثالث في عرض سطح قوس البلعوم الطائرة في عرض وإيقاف تقطيع العظام. ضمن وضع رسم كفاف، حدد وظيفة وضع رسم المسافة وقم بضبط إعدادات المعلمة حسب الضرورة. عندما تم تعيين كافة المعلمات، اضغط على مفتاح Escape وانقر فوق رسم لتتبع محيط القوس الثالث البلعوم مع مؤشر الماوس.ثم استخدم موضع الشريحة لتحريك 10 إلى 25 شريحة وتتبع محيط قوس البلعوم. عندما تم تتبع القوس بأكمله، انقر فوق إنشاء سطح لتوليد سطح المنطقة تتبع. لإخفاء البنيات الظاهرة، في قائمة التحرير، حدد تحديد قناع لـ PAA و DAPI الثالث ثم انقر فوق موافق. ثم أعد تسمية القناة الجديدة باسم PAA DAPI.كرر هذه الخطوة للقنوات المتبقية. لتصور الضفيرة endothelial بشكل منفصل عن PAA، حدد اختيار قناع PAA الثالث وحدد DAPI. قم بإلغاء تحديد voxels خارج السطح إلى والتحقق من تحديد voxels داخل السطح إلى.تعيين تحديد voxels داخل السطح إلى الصفر وانقر فوق موافق. إعادة تسمية القناة الجديدة باسم DAPI غير PAA. كرر هذه الخطوة للقنوات المتبقية. حدد قناع التحديد لـ PA الثالث وحدد غير PAA DAPI ثم انقر فوق موافق. إعادة تسمية القناة الجديدة كـ DAPI الضفيرة.كرر هذه الخطوة للقنوات المتبقية. لتحديد عدد الخلايا البطانية الفردية داخل كل بنية ذات فائدة، في لوحة تعديلات العرض، قم بإيقاف تشغيل جميع القنوات باستثناء قناة PAA ERG. ضمن قائمة الخصائص، انقر فوق إضافة بقع جديدة وانقر لإعادة تسمية البقع PAA عدد إجمالي من الخلايا البطانية.انقر فوق السهم الأزرق وحدد قناة PAA ERG للقناة المصدر. ضبط قطر XY المقدرة إلى أربعة ميكرومتر وانقر فوق السهم الأزرق للمتابعة إلى اللوحة التالية. استخدم المقياس الانزلاقي لضبط عدد البقع لضمان تمثيل كل نواة خلية بطانةية إيجابية من قبل نقطة واحدة.بعد ذلك، انقر فوق السهم المزدوج الأخضر ثم قم بإيقاف تشغيل قناة PAA ERG في لوحة ضبط الشاشة. تشغيل قناة PAA VEGFR2 لتصور endothelium PAA وانقر فوق تحرير وإضافة / حذف لتحديد سطح الكائن. ثم اضغط على الهروب مع الاستمرار في الضغط على Shift لحذف أي بقع ليست VEGFR2 موجبة وانقر فوق علامة التبويب الإحصائيات لتحديد العدد الإجمالي للخلايا البطانية.ينتج عن الفلور المناعية الكاملة نتائج واضحة ونظيفة تسمح بإعادة بناء 3D للـ endothelium القوس البلعوم. في هذه الصورة، وجود النقاط الساطعة الكبيرة هو نتيجة للجسيمات في الأجسام المضادة أو حلول العازلة حظر. بعد قوس البلعوم و PAA تلطيخ السطح، واستخدام وظيفة قناع يسمح للمناطق على السطح أن تكون منفصلة بصريا وتحليلها بشكل مستقل.كما يسمح الإخفاء بتحليل فردي و تحديد أرقام الخلايا البطانية داخل كل بنية. على سبيل المثال، هنا تم استخدام ميزة البقعة لتحديد العدد الإجمالي للخلايا البطانية في كل من PAA والplexus عن طريق تعيين نقطة واحدة لكل نواة تعبر عن ERG. في هذه الصورة، يمكن ملاحظة نقطة سالبة VEGFR2 إيجابية من ERG تم إنشاؤها بواسطة وظيفة موضعية.لذلك، من الضروري التحقق من أن كل نقطة معترف بها من قبل البرنامج تمثل في الواقع خلية واحدة endothelial. للحصول على صور نظيفة وواضحة، تذكر أن تدور أسفل جميع الحلول وغسل كل جنين بشكل صحيح وبدق بعد حضانات الأجسام المضادة. من المهم أن نتذكر أن BABB هو تآكل وسامة.التعامل مع والتخلص من المذيبات بشكل صحيح وتأكد من ختم الأجنة الذائبة تماما لمنع تسرب BABB.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...