Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Vi takker Brianna Alexander, Caolan O'Donnell og Michael Warkala for omhyggelig læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Heart, Lung and Blood Institute af NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR er støttet af NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis og muskel- og skelet-og hudsygdomme Uddannelse tilskud T32052283-11.

Anvendelse og anvendelse af dyr blev godkendt af Udvalget for Dyrepleje og Brug af Dyr på Rutgers University.
1. Udarbejdelse af løsninger
<ol><li>1 L fosfatbufferet saltvand med 0,1% Triton-X-100 (PBST) fremstilles, og filtersteriliseres. Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i mindst et år.</li>
	<li>600 μL blokeringsbuffer bestående af 10 % af det normale æselserum i PBST. Gør denne løsning frisk hver gang.</li>
	<li>Der fremstilles 50 ml af følgende methanol (Me...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

Evnen til at visualisere endotel i museembryoner i 3D har givet ny indsigt i deres udvikling3. Her præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for høj opløsning 3D-billeddannelse af embryoner, visualisering af vaskulære tilslutningsmuligheder, og kvantitative analyser af PAA dannelse. Denne protokol kan anvendes til at se, hvordan genetiske ændringer eller miljømæssige fornærmelser indvirkning PAA udvikling. Den procedure, der rapporteres her, anvender antistoffer mod VEGFR2 og ERG til ...

Under mus embryogenese, svælg bue arterier (PAAs) opstår som symmetriske, bi-laterale par arterier, der forbinder hjertet med dorsale aortae1. Som embryoet udvikler sig, den første og andet par PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gennemgå en række asymmetriske remodeling begivenheder til at danne aorta bue arterier2.
PaA'erne 3, 4 og 6 udvikler sig via vaskulogenese, som er de novo-dannelsen af blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygning af disse bue arterier giver anledning til forskellige medfødte hjertefejl, såsom dem, der ses hos patienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse af mekanismer, der regulerer udviklingen af PAA'er, føre til en bedre forståelse af medfødt hjertesygdom (CHD) ætiologi.
Nuværende tilgange til visualisering og analyse paa udvikling omfatter immunfluorescens af væv sektioner, vaskulære kaster, Indien blæk injektion, høj opløsning episkopi, og / eller hele mount immunhistokemi1,4,,5,,6,7. Heri beskriver vi en protokol, der kombinerer helmonteret immunfluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-billedgengivelse for at indsamle, analysere og kvantificere volumetriske data, vaskulære konnektivitet og celleidentitet. Yderligere, vi detaljer en metode til at opdele og kvantificere antallet af ECs i hver svælg bue som et middel til at studere dannelsen af svælg arch vaskulære plexus og dens remodeling i PAAs. Mens denne protokol er designet til at analysere PAA udvikling, kan det bruges til at analysere andre udvikle vaskulære netværk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

Forkert dannelse eller remodeling af svælg bue arterier (PAAs) 3, 4 og 6 bidrage til nogle af de mest alvorlige former for medfødt hjertesygdom. For at studere dannelsen af PAA'er udviklede vi en protokol ved hjælp af fuldmonteret immunfluorescens kombineret med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vævsclearing og konfokal mikroskopi. Dette giver mulighed for visualisering af svælg bue endotel på en fin cellulær opløsning samt 3D-forbindelse af vaskulaturen. Ved hjælp af software har vi etableret en protokol til kvantificering af antallet af endotelceller (ECs) i PAA'er samt antallet af eCs inden for den vaskulære plexus omkring PAA'erne inden for svælgbuer 3, 4 og 6. Når denne metode anvendes på hele embryonet, giver den en omfattende visualisering og kvantitativ analyse af embryonal vaskulatur.

Den helmonterede immunofluorescensprotokol, der præsenteres her, giver klare og rene resultater, hvilket giver mulighed for 3D-rekonstruktion af svælgsvangendotel, som det ses i figur 1A. Det er vigtigt at inkubere embryoner i tilstrækkelig lang tid i hver antistofopløsning for at sikre fuldstændig gennemtrængning gennem prøven samt grundigt vask af embryoner efter antistofinkubation. I figur 1B</s...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Her beskriver vi en protokol til at visualisere og analysere svælg bue arterierne 3, 4 og 6 af mus embryoner ved hjælp af hele mount immunfluorescens, væv clearing, konfokal mikroskopi, og 3D rekonstruktion.

Visualisering og analyse af Pharyngeal Arch Arterier ved hjælp af fuld-mount Immunohistochemistry og 3D Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Denne metode gør det muligt at opdele hver svælalsbue. Endotelcelletal kan derefter kvantificeres i hver bue som et middel til at studere svælalsk arch arterie udvikling. De vigtigste fordele ved denne tilgang er evnen til at visualisere forholdet mellem forskellige vaskulære strukturer og evnen til kvantitativt at bestemme, hvordan strukturerne påvirkede mutanter.Aorta arch arterier er almindeligt muteret i medfødt hjertesygdom. Vores metode gør det muligt at undersøge, hvordan mutationer ændrer den fysiologiske proces med kardannelse og remodeling. Selv om vi bruger denne metode til at få indsigt i mekanismerne i medfødt hjertesygdom, kan det anvendes på andre systemer, især med fremkomsten af lys-ark mikroskopi.Begynd med at bruge en glaspipette til at overføre hver museembryonsdag 9,5 eller 10,5 embryo til individuelle to milliliterrør, der indeholder en milliliter PBS. Efter fiksering, bruge fine kraftforladelser til omhyggeligt klemme fosteret lige over bagben og foretage en tværgående snit til at fjerne den bageste halvdel af fosteret. For at gennemtrænge embryonerne skal PBS erstattes med PBSt og embryonerne sættes på fire grader Celsius med let omrøring natten over.Den næste dag, erstatte PBST med 600 mikroliter af blokering buffer uden at røre embryoner for en 16 til 18-timers inkubation ved fire grader Celsius med blid omrøring. Den næste morgen, erstatte blokering buffer med 600 mikroliter af den primære antistof af interesse pr rør for en fire til fem-dages inkubation ved fire grader Celsius med blid omrøring. Ved inkubationens afslutning vaskes embryonerne i en milliliter PBST i fire til fem timer med forsigtig omrøring ved stuetemperatur, der ændrer PBS hver time, efterfulgt af en natskuvning i frisk PBST ved fire grader Celsius, og fire til fem yderligere en times vasker den næste dag.Efter den sidste vask udskiftes PBST i hvert rør med 600 mikroliter af den passende sekundære antistofopløsning til en fire til fem dages inkubation ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes embryonerne i en milliliter frisk PBST pr. vask som netop påvist, og der skal anvendes en glaspipette til forsigtigt at overføre hvert embryon til individuelle paraffinforme af plast. Fjern forsigtigt pbst fra omkring hvert foster og orientere hvert foster i en sagittal position.Derefter hurtigt tilføje omkring 500 mikroliter af varm agarose til hver form, indtil hvert foster er lige dækket og placere forme på is dækket med aluminiumsfolie, indtil agarose har størknet. Ved dehydrering af embryonale prøver anvendes en ren skalpel til at skære en agaroseblok omkring hvert embryon og bruge kraftbefæstelse til at gribe agarosen til overførsel til et mærket to milliliterrør indeholdende en milliliter 25 % methanol. Efter en times inkubation med blid omrøring i mørke erstattes 25%methanol med en milliliter 50% methanol pr. rør for yderligere en times inkubation i mørke.Efter afslutningen af dehydrering, erstatte 100% methanol med en milliliter på 50%BABB for en times inkubation med blid omrøring i mørke. Ved inkubationens afslutning erstattes 50%BABB med en milliliter 100%BABB pr. rør for en times inkubation med let omrøring i mørke efterfulgt af endnu en inkubation med 100%BABB som netop påvist. For at montere embryoner til billeddannelse, fjerne limen fra en hurtig brønd kofanger og placere kofangeren på en 24 med seks milliliter nummer 1,5 glas coverslip.Påfør let tryk på limen for at fjerne eventuelle luftbobler mellem dækslækagen og kofangeren og kassér forsigtigt 100%BABB fra hvert rør. Brug derefter fine kraftbefædre til forsigtigt at overføre fosteret til hurtigtebne uden at røre ved embryonet og placere en anden dækslæd på kofangeren. At overfladen endotel i hele tredje svælds bue, åbne billedet af interesse i softwaren og klik tilføje ny overflade.Dobbeltklik på overfladen et, og omdøb den nye overflade til tredje svældsbue. Vælg spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt, og indstil overfladeretningen til YZ-planet. Brug skivepositionen til at placere det tredje svælgbuefladeplan, hvor den tredje PAA og dorsal aorta forbindes.Roter billedet, så det tredje svælgbuefladeplan er i betragtning, og sluk for ortoskisereværktøjet. Vælg funktionen afstandstegningstilstand under tegnekonturtilstand, og juster parameterindstillingerne efter behov. Når alle parametrene er indstillet, skal du trykke på Escape-tasten og klikke på draw for at spore omkredsen af den tredje svællede bue med musemarkøren.Brug derefter skiven position til at flytte 10 til 25 skiver og spore omkredsen af svælds bue. Når hele buen er blevet sporet, skal du klikke på opret overflade for at generere overfladen af det sporede område. Vælg maskemarkering for den tredje PAA og DAPI i redigeringsmenuen for at skjule de overfladestrukturer, og klik på OK. Omdøb derefter den nye kanal som PAA DAPI.Gentag dette trin for de resterende kanaler. Hvis du vil visualisere endotelplexus separat fra PAA, skal du vælge maskemarkering for den tredje PAA og vælge DAPI. Fjern markeringen vælge voxels udvendige overflade til og kontrollere vælge voxels inde overflade til.Indstil vælge voxels inde i overfladen til nul og klik på OK. Omdøb den nye kanal som ikke-PAA DAPI. Gentag dette trin for de resterende kanaler. Vælg maskevalg for den tredje pa, og vælg ikke-PAA DAPI, og klik på OK. Omdøb den nye kanal som plexus DAPI.Gentag dette trin for de resterende kanaler. Hvis du vil kvantificere de enkelte endotelceller inden for hver interessestruktur, skal du i panelet med justering af skærmen slukke for alle kanaler undtagen PAA ERG-kanalen. Klik på Tilføj nye pletter under genvejsmenuen, og klik for at omdøbe pletter ét samlet antal endotelceller.Klik på den blå pil, og vælg PAA ERG-kanalen for kildekanalen. Juster den anslåede XY-diameter til fire mikrometer, og klik på den blå pil for at fortsætte til næste panel. Brug glideskalaen til at justere antallet af pletter for at sikre, at hver ERG-positiv endotelcellekerne repræsenteres af ét sted.Klik derefter på den grønne dobbeltpil, og sluk for PAA ERG-kanalen i panelet til justering af skærmen. Slå PAA VEGFR2-kanalen til for at visualisere PAA-endothelet og klikke på rediger og tilføj/slet for at markere objektoverfladen. Tryk derefter på Escape og hold Skift nede for at slette eventuelle pletter, der ikke er VEGFR2-positive, og klik på fanen Statistik for at bestemme det samlede antal endotelceller.Hele mount immunfluorescens producerer klare og rene resultater giver mulighed for 3D rekonstruktion af svælg bue endotel. I dette billede er tilstedeværelsen af de store lyse prikker resultatet af partikler i enten antistof- eller blokeringsbufferopløsningerne. Efter svælget bue og PAA overflade farvning, brug af masken funktion gør det muligt for overfladeområder, der skal visuelt adskilt og uafhængigt analyseret.Maskering giver også mulighed for individuel analyse og kvantificering af endotelcellenumre i hver struktur. Her blev spotfunktionen for eksempel brugt til at kvantificere det samlede antal endotelceller i både PAA og plexus ved at tildele et enkelt sted for hver kerne, der udtrykker ERG. I dette billede kan der observeres et ERG-positivt VEGFR2 negativt punkt, der er genereret af spotfunktionen.Derfor er det vigtigt at kontrollere, at hver prik, der genkendes af softwaren, rent faktisk repræsenterer en enkelt endotelcelle. For at opnå rene og klare billeder skal du huske at dreje alle opløsninger ned og vaske hvert foster grundigt efter antistofinkubationer. Det er vigtigt at huske, at BABB er ætsende og giftigt.Håndter og kassér opløsningsmidlet korrekt, og sørg for at forsegle de smeltede embryoner helt for at forhindre BABB-lækage.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i zebrafisk gennem en kombineret protokol af hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og immunfluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescens og follikel kvantificering af kulturperler mus æggestokke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...