Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Wij danken Brianna Alexander, Caolan O'Donnell en Michael Warkala voor het zorgvuldig lezen en bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de financiering van het National Heart, Lung and Blood Institute van het NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 aan SA; AJR wordt ondersteund door NHLBI HL103920-08S1 en het National Institute of Artritis en Spier- en Huidziekten Training subsidie T32052283-11.

Het gebruik en de procedures van dieren zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik van de Rutgers-universiteit.
1. Voorbereiding van oplossingen
<ol><li>Bereid 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing voor met 0,1% Triton-X-100 (PBST) en filtersteriliseren. Deze oplossing kan minstens een jaar bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.</li>
	<li>Bereid 600 μL blokkerende buffer voor die bestaat uit 10% van het normale ezelserum in PBST. Maak deze oplossing el...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

De mogelijkheid om het endotheel in muisembryo's in 3D te visualiseren heeft nieuwe inzichten opgeleverd in hun ontwikkeling3. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van embryo's, visualisatie van vasculaire connectiviteit, en kwantitatieve analyses van PAA-vorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te zien hoe genetische veranderingen of milieubeledigingen van invloed paa ontwikkeling. De hier gerapporteerde procedure maakt gebruik van antili...

Tijdens de embryogenese van de muis ontstaan faryngeale boogslagaders (PAA's) als symmetrische, tweelaterale paren slagaders die het hart verbinden met de dorsaleaorta1. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, de eerste en tweede paar PAA's achteruit, terwijl de3e,4e, en 6e PAA's ondergaan een reeks van asymmetrische remodelleren gebeurtenissen om de aortaboog slagaders te vormen2.
Paa's 3, 4 en 6 ontwikkelen zich via vasculogene, dat is de de novo vorming van bloedvaten3. Afwijkingen in de vorming of remodelleren van deze boogslagaders leiden tot verschillende aangeboren hartafwijkingen, zoals die gezien bij patiënten met digeorge syndroom4,5. Daarom kan het begrijpen van mechanismen die de ontwikkeling van PAA's reguleren leiden tot een beter begrip van aangeboren hart-en vaatziekten (CHD) etiologie.
De huidige benaderingen voor het visualiseren en analyseren van PAA-ontwikkeling omvatten immunofluorescentie van weefselsecties, vaatwerpt, India-inktinjectie, hoge resolutie episcopic microscopie en/of immunohistochemie aan de hele berg1,4,5,6,7. Hierin beschrijven we een protocol dat hele immunofluorescentie, confocale microscopie en 3D-beeldweergave combineert om volumetrische gegevens, vasculaire connectiviteit en celidentiteit te verzamelen, analyseren en kwantificeren. Verder detailleren we een methode om de aantallen EC's in elke faryngeale boog te compartimenteren en te kwantificeren als een middel om de vorming van de faryngeale boog vasculaire plexus en de remodelleren ervan in de PAA's te bestuderen. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het analyseren van PAA-ontwikkeling, kan het worden gebruikt om andere zich ontwikkelende vasculaire netwerken te analyseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

Onjuiste vorming of remodelleren van de faryngeale boogslagaders (PAA's) 3, 4 en 6 dragen bij aan enkele van de meest ernstige vormen van aangeboren hart-en vaatziekten. Om de vorming van PAA's te bestuderen, ontwikkelden we een protocol met behulp van immunofluorescentie van de hele berg in combinatie met benzylalcohol/benzylbenzoaat (BABB) weefselclearing en confocale microscopie. Dit maakt de visualisatie van de faryngeale boog endotheel op een fijne cellulaire resolutie evenals de 3D-connectiviteit van de vasculatuur. Met behulp van software hebben we een protocol opgesteld om het aantal endotheelcellen (EV's) in PAA's te kwantificeren, evenals het aantal E's in de vasculaire plexus rond de PAA's binnen faryngeale bogen 3, 4 en 6. Wanneer toegepast op het hele embryo, biedt deze methodologie een uitgebreide visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale vasculatuur.

Het hier gepresenteerde immunofluorescentieprotocol met hele mount levert duidelijke en schone resultaten op, waardoor de 3D-reconstructie van faryngeale boogendotheel mogelijk is, zoals te zien is in figuur 1A. Het is belangrijk om embryo's voldoende lang in elke antilichaamoplossing uit te broeden om volledige penetratie door het monster te garanderen, evenals, het grondig wassen van embryo's na de incubatie. In figuur ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Hier beschrijven we een protocol om de faryngeale boogslagaders 3, 4 en 6 muisembryo's te visualiseren en te analyseren met behulp van immunofluorescentie, weefselclearing, confocale microscopie en 3D-reconstructie.

Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Met deze methode kan elke faryngeale boog worden gecompartimenteerd. Endotheelcelnummers kunnen dan in elke boog worden gekwantificeerd als een middel om de ontwikkeling van de faryngeale boogslagader te bestuderen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn het vermogen om de relatie tussen verschillende vasculaire structuren te visualiseren en het vermogen om kwantitatief te bepalen hoe de structuren de mutanten beïnvloedden.Aorta boog slagaders worden vaak gemuteerd in aangeboren hart-en vaatziekten. Onze methode maakt het mogelijk om te bestuderen hoe mutaties het fysiologische proces van vaatvorming en remodellering veranderen. Hoewel we deze methode gebruiken om inzicht te krijgen in de mechanismen van aangeboren hartziekten, kan het worden toegepast op andere systemen, met name met de komst van lichtbladige microscopie.Begin met het gebruik van een glazen pipet om elke embryonale dag 9.5 of 10.5 embryo over te brengen in individuele twee milliliter buizen met één milliliter PBS. Gebruik na fixatie fijne tangen om het embryo voorzichtig net boven de achterpoot te knijpen en een dwarse snede te maken om de achterste helft van het embryo te verwijderen. Om de embryo's te doordrenken, vervang de PBS door PBST en plaats de embryo's op vier graden Celsius met zachte agitatie 's nachts.De volgende dag, vervang de PBST met 600 microliters van het blokkeren buffer zonder het aanraken van de embryo's voor een 16 tot 18-uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie. De volgende ochtend, vervang de blokkerende buffer met 600 microliters van het primaire antilichaam van belang per buis voor een vier tot vijf-daagse incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Aan het einde van de incubatie, was de embryo's in een milliliter PBST gedurende vier tot vijf uur met zachte agitatie bij kamertemperatuur het veranderen van de PBS elk uur, gevolgd door een nachtelijke incubatie in verse PBST op vier graden Celsius en vier tot vijf extra een uur wast de volgende dag.Vervang na de laatste wasbeurt de PBST in elke buis door 600 microliters van de juiste secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van vier tot vijf dagen bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de embryo's in een milliliter verse PBST per was, zoals net aangetoond en gebruik een glazen pipet om elk embryo voorzichtig over te brengen in individuele plastic paraffinemallen. Verwijder zorgvuldig elke PBST uit elk embryo en oriënteer elk embryo in een sagittale positie.Voeg dan snel ongeveer 500 microliters van hete agarose aan elke mal toe tot elk embryo enkel wordt behandeld en plaats de vormen op ijs dat met aluminiumfolie wordt behandeld tot agarose is gestold. Voor uitdroging van de embryonale monsters, gebruik een schone scalpel om een blok agarose rond elk embryo te snijden en gebruik tangen om de agarose te grijpen voor overdracht in een gelabelde twee milliliter buis met een milliliter van 25%methanol. Na een incubatie van een uur met zachte agitatie in het donker, vervang 25% methanol door een milliliter van 50% methanol per buis voor een extra incubatie van een uur in het donker.Na het einde van de uitdroging, vervang de 100% methanol met een milliliter van 50%BABB voor een incubatie van een uur met zachte agitatie in het donker. Vervang aan het einde van de incubatie de 50%BABB door één milliliter van 100%BABB per buis voor een incubatie van een uur met zachte agitatie in het donker, gevolgd door een tweede incubatie met 100%BABB zoals net aangetoond. Om de embryo's te monteren voor beeldvorming, verwijder de lijm uit een snelle goed bumper en plaats de bumper op een 24 bij zes milliliter nummer 1.5 glazen coverslip.Breng zachte druk op de lijm om eventuele luchtbellen tussen de coverslip en de bumper te verwijderen en gooi de 100%BABB voorzichtig uit elke buis. Gebruik vervolgens fijne tangen om het embryo zorgvuldig over te brengen in de snelle put zonder het embryo aan te raken en plaats een tweede coverlip op de bumper. Om het endotheel in de gehele derde faryngeale boog aan de oppervlakte te brengen, opent u het beeld van interesse in de software en klikt u op het toevoegen van een nieuw oppervlak.Dubbelklik op oppervlak één en hernoemen het nieuwe oppervlak naar de derde faryngeale boog. Selecteer automatisch maken overslaan, bewerk handmatig en stel de oppervlakteoriëntatie in op het YZ-vlak. Gebruik de slicepositie om het derde faryngeale boogvlak te plaatsen waar de derde PAA en rugaorta met elkaar verbonden zijn.Draai de afbeelding zo dat het derde faryngeale boogvlak in beeld is en schakel de orthosnijmachine uit. Selecteer onder de tekencontourmodus de functie afstandstekenmodus en pas de parameterinstellingen zo nodig aan. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, drukt u op de Escape-toets en klikt u op tekenen om de omtrek van de derde faryngeale boog te traceren met de muiscursor.Gebruik vervolgens de slicepositie om 10 tot 25 plakjes te verplaatsen en de omtrek van de keelholteboog te traceren. Wanneer de hele boog is getraceerd, klikt u op oppervlak maken om het oppervlak van het getraceerde gebied te genereren. Selecteer in het bewerkingsmenu de selectie van maskeren voor de derde PAA en DAPI en klik op OK voor het maskeren van de opgedoken structuren. Wijzig vervolgens de naam van het nieuwe kanaal als PAA DAPI.Herhaal deze stap voor de overige kanalen. Als u de endotheelplexus afzonderlijk van de PAA wilt visualiseren, selecteert u maskerselectie voor de derde PAA en selecteert u DAPI. Schakel de optie selecteer voxels buitenoppervlak uit en controleer selecteer voxels binnenoppervlak aan.Stel geselecteerde voxels binnenoppervlak op nul en klik op OK. Wijzig de naam van het nieuwe kanaal als niet-PAA DAPI. Herhaal deze stap voor de overige kanalen. Selecteer maskerselectie voor de derde PA en selecteer niet-PAA DAPI en klik op OK. Wijzig de naam van het nieuwe kanaal als plexus DAPI.Herhaal deze stap voor de overige kanalen. Als u de afzonderlijke endotheelcellen binnen elke interessestructuur wilt kwantificeren, schakelt u in het deelvenster weergaveaanpassingen alle kanalen uit, behalve het PAA ERG-kanaal. Klik onder het eigenschappenmenu op Nieuwe plekken toevoegen en klik om de naam van een AANTAL ENdotheelcellen van paa's te wijzigen.Klik op de blauwe pijl en selecteer het PAA ERG-kanaal voor het bronkanaal. Pas de geschatte XY-diameter aan op vier micrometer en klik op de blauwe pijl om door te gaan naar het volgende deelvenster. Gebruik de glijdende schaal om het aantal vlekken aan te passen om ervoor te zorgen dat elke ERG positieve endotheelcelkern wordt vertegenwoordigd door één plek.Klik vervolgens op de groene dubbele pijl en schakel het PAA ERG-kanaal uit in het deelvenster Weergaveaanpassing. Schakel het PAA VEGFR2-kanaal in om het PAA-endotheel te visualiseren en klik op bewerken en toevoegen/verwijderen om het oppervlak van het object te selecteren. Druk vervolgens op Escape en houd Shift ingedrukt om plekken te verwijderen die niet VEGFR2-positief zijn en klik op het tabblad statistieken om het totale aantal endotheelcellen te bepalen.Hele mount immunofluorescentie produceert duidelijke en schone resultaten waardoor de 3D reconstructie van de keelholte boog endotheel. In dit beeld is de aanwezigheid van de grote heldere stippen het resultaat van deeltjes in het antilichaam of het blokkeren van bufferoplossingen. Na faryngeale boog en PAA oppervlakte vlekken, gebruik van het masker functie maakt het mogelijk de oppervlakte gebieden visueel worden gescheiden en onafhankelijk geanalyseerd.Maskeren maakt het ook mogelijk de individuele analyse en kwantificering van endotheelcelnummers binnen elke structuur. Hier werd bijvoorbeeld de spotfunctie gebruikt om het totale aantal endotheelcellen in zowel de PAA als de plexus te kwantificeren door één plek toe te wijzen voor elke kern die ERG uitdrukt. In deze afbeelding kan een ERG positieve VEGFR2 negatieve plek worden waargenomen die is gegenereerd door de spotfunctie.Daarom is het essentieel om te controleren of elke stip die door de software wordt herkend, eigenlijk een enkele endotheelcel vertegenwoordigt. Om schone en duidelijke beelden te verkrijgen, vergeet niet om alle oplossingen te draaien en elk embryo goed en grondig te wassen na antilichaam incubaties. Het is belangrijk om te onthouden dat BABB corrosief en giftig is.Behandel en gooi het oplosmiddel goed weg en zorg ervoor dat u de gesmolten embryo's volledig afsluit om BABB-lekkage te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissectie van de Drosophila pop netvlies voor Immunohistochemistry, westelijke analyse en RNA isolatie

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...