Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

אנו מודים לבריאנה אלכסנדר, קאולן אודונל ומייקל וורקאלה לקריאה זהירה ועריכה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכת על ידי המימון של הלב הלאומי, ריאות ודם המכון של NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 ל-SA; AJR נתמך על ידי NHLBI HL103920-08S1 ואת המכון הלאומי של דלקת מפרקים והשלד ומחלות עור הדרכה מענק T32052283-11.

השימוש בבעלי חיים ונהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת רטגרס.
1. הכנת פתרונות
<ol><li>להכין 1 L של פוספט מלוחים באגירה עם 0.1% טריטון-X-100 (PBST) ומסנן לעקר. ניתן לאחסן פתרון זה בטמפרטורת החדר (RT) למשך שנה לפחות.</li>
	<li>להכין 600 μL של חסימת מאגר המורכב 10%...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

היכולת להמחיש את האנדותל של עוברי העכבר ב-3D סיפקה תובנות חדשות לפיתוח שלהם3. כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה תלת-ממד של עוברים, ויזואליזציה של קישוריות כלי דם, וניתוחים כמותיים של היווצרות צפות. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק כדי לראות כיצד שינויים גנטיים א?...

במהלך הembryogenesis העכבר, העורקים קשת של הלוע (PAAs) להתעורר כמו סימטרי, דו צדדי העורקים של עורק המחברים את הלב עם aortae1. כאשר העובר מתפתח, הזוג הראשון והשני של הסגת הדרך של PAAs, בעודהשלישי, 4th, ו-6ה paas לעבור סדרה של אירועים שיפוץ סימטרי כדי ליצור את העורקים קשת של אבי העורקים2.
PAAs 3, 4 ו 6 להתפתח באמצעות vasculogenesis, שהוא היווצרות דה נובו של כלי הדם3. פגמים בהיווצרות או שיפוץ של עורקי קשת אלה להצמיח מומים לב מולדים שונים, כמו אלה שנראו בחולים עם תסמונת digeorge4,5. לכן, הבנת מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של PAAs יכול להוביל להבנה טובה יותר של מחלת לב מולדים (CHD) האטיולוגיה.
גישות נוכחיות להמחיש ולנתח צפות פיתוח כוללים immunofluorescence מפרקים רקמות, כלי דם, הזרקת דיו הודו, מיקרוסקופ האפיסקופלית ברזולוציה גבוהה, ו/או שלמים-הר אימונוהיסטוכימיה1,4,5,6,7. להלן, אנו מתארים פרוטוקול המשלב המכלול שילוב של החיסונית, המיקרוסקופיה ועיבוד תמונה תלת-ממדית כדי לאסוף, לנתח, ולכמת נתונים נפחי, קישוריות כלי דם וזהות התא. עוד, אנו לפרט שיטה למדר ולכמת את המספרים של ECs בכל קשת הלוע כאמצעי ללמוד היווצרות של קשת הלוע מקלעת כלי הדם ואת שיפוץ לתוך PAAs. בעוד פרוטוקול זה מיועד לניתוח פיתוח צפות, ניתן להשתמש בו כדי לנתח אחרים לפיתוח רשתות כלי דם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

היווצרות לא תקין או שיפוץ של העורקים קשת הלוע (PAAs) 3, 4, ו 6 לתרום כמה צורות חמורות ביותר של מחלת לב מולדים. כדי ללמוד את היווצרות של paas, פיתחנו פרוטוקול באמצעות שימוש מלא החיסונית של האנטי-משתמשים בשילוב עם בנזיל אלכוהול/בנזוקסיל (babb) ניקוי רקמות, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי. הדבר מאפשר הדמיה של קשת הלוע ברזולוציה תאית משובחת, כמו גם את הקישוריות 3D של ואצלב. באמצעות תוכנה, הקמנו פרוטוקול לכמת את מספר תאי האנדותל (ECs) ב PAAs, כמו גם את מספר ECs בתוך מקלעת כלי הדם המקיפים את PAAs בתוך קשתות הלוע 3, 4, ו 6. כאשר הוא מיושם על כל העובר, מתודולוגיה זו מספקת הדמיה מקיפה וניתוח כמותי של ואצלב עובריים.

הנוהל המלא של הפרוטוקול המוצג כאן מפיק תוצאות ברורות ונקיות, ומאפשר שחזור תלת-מימדשל קשת הלוע, כנראה באיור 1. חשוב לעבור העוברים במשך כמות מספקת של זמן בכל פתרון נוגדן כדי להבטיח חדירה מלאה דרך המדגם, כמו גם, ביסודיות כביסה העוברים לאחר הדגירה נוג?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי להמחיש ולנתח את העורקים קשת הלוע 3, 4, ו 6 עוברי העכבר באמצעות החיסונית של הר שלמים, ניקוי רקמות, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, ו-3d שחזור.

הדמיה וניתוח עורקי קשת והלוע באמצעות שחזור-הר אימונוהיסטוכימיה ותלת מימד

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

שיטה זו מאפשרת לכל קשת לוע להיות ממודרת. לאחר מכן ניתן לכמת מספרי תאים אנדותל בכל קשת כאמצעי לחקר התפתחות עורק הקשת הלוע. היתרונות העיקריים של גישה זו הם היכולת לדמיין את היחסים בין מבני כלי דם שונים ואת היכולת לקבוע כמותית כיצד המבנים השפיעו על המוטנטים.עורקי קשת האאורטיק עוברים מוטציה נפוצה במחלות לב מולדות. השיטה שלנו מאפשרת לחקור כיצד מוטציות משנות את התהליך הפיזיולוגי של היווצרות כלי שיט ושיפוץ. למרות שאנו משתמשים בשיטה זו כדי לקבל תובנות לתוך המנגנונים של מחלת לב מולדת, זה יכול להיות מיושם על מערכות אחרות במיוחד עם הופעתו של מיקרוסקופיה גיליון אור.התחל על ידי שימוש פיפטה זכוכית להעביר כל יום עוברי עכבר 9.5 או 10.5 עובר לתוך צינורות בודדים שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של PBS. לאחר קיבעון, להשתמש במקלות בסדר כדי לצבוט בזהירות את העובר ממש מעל hindlimb ולעשות חתך רוחבי כדי להסיר את החצי האחורי של העובר. כדי לחלחל לעוברים, החלף את ה- PBS ב- PBST והצב את העוברים בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה בן לילה.למחרת, החלף את PBST עם 600 microliters של חיץ חסימה מבלי לגעת בעוברים עבור דגירה של 16 עד 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. למחרת בבוקר, החלף את חיץ החסימה עם 600 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין לצינור עבור דגירה של ארבעה עד חמישה ימים בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה. בסוף הדגירה, לשטוף את העוברים במיליליטר אחד של PBST במשך ארבע עד חמש שעות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר שינוי PBS כל שעה, ואחריו דגירה לילה PBST טרי בארבע מעלות צלזיוס וארבע עד חמש שטיפות נוספות של שעה למחרת.לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה- PBST בכל צינור ב- 600 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים המשני המתאים עבור דגירה של ארבעה עד חמישה ימים בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את העוברים במיליליטר אחד של PBST טרי לכל לשטוף כפי שהודגם רק ולהשתמש פיפטה זכוכית בעדינות להעביר כל עובר לתוך תבניות פרפין פלסטיק בודדים. הסר בזהירות כל PBST מסביב לכל עובר וכוון כל עובר בתאונה קשתית.לאחר מכן מוסיפים במהירות כ-500 מיקרוליטרים של אגרוז חם לכל עובש עד שכל עובר מכוסה ומ מניחים את התבניות על קרח מכוסה בנייר אלומיניום עד שהאגרוז מתגבש. להתייבשות הדגימות העובריות, השתמשו באזמל נקי כדי לחתוך גוש אגרוז סביב כל עובר ולהשתמש במטלות כדי לתפוס את אגרוז להעברה לצינור שני מיליליטר שכותרתו המכיל מיליליטר אחד של 25% מתנול. לאחר דגירה של שעה עם תסיסה עדינה בחושך, החלף 25% מתנול עם מיליליטר אחד של 50% מתנול לצינור עבור דגירה נוספת של שעה בחושך.לאחר סיום ההתייבשות, החליפו את המתנול ב-100% מתנול במיליליטר אחד של 50% BABB עבור דגירה של שעה עם תסיסה עדינה בחושך. בסוף הדגירה, החלף את BABB 50% עם מיליליטר אחד של 100% BABB לצינור עבור דגירה של שעה אחת עם תסיסה עדינה בחושך, ואחריו דגירה שנייה עם 100% BABB כפי שהודגם רק. כדי לעלות על העוברים להדמיה, להסיר את דבק מפגוש היטב מהיר ולהמקם את הפגוש על 24 על ידי שישה מיליליטר מספר 1.5 כיסויי זכוכית.החל לחץ עדין על דבק כדי להסיר את כל בועות האוויר בין כיסוי הפגוש בזהירות להשליך את 100% BABB מכל צינור. לאחר מכן השתמש במקלות עדינים כדי להעביר בזהירות את העובר לתוך הבאר המהירה מבלי לגעת בעובר ולהחיל כיסוי שני על הפגוש. כדי לצוף אנדותל בכל קשת הלוע השלישית, לפתוח את התמונה של עניין בתוכנה ולחץ להוסיף משטח חדש.לחץ פעמיים על משטח אחד ושנה את שם המשטח החדש לקשת הלוע השלישית. בחרו 'דלג על יצירה אוטומטית', ערכו ידנית והגדירו את כיוון הפנים למישור YZ. השתמש במיקום הפרוסה כדי למקם את מישור פני השטח השלישי של קשת הלוע למקום שבו PAA השלישי ו- dorsal aorta מתחברים.סובב את התמונה כך שמישור פני השטח השלישי של קשת הלוע יהיה בתצוגה ויכבה את כלי הפריסה של אורתו. תחת מצב מתאר ציור, בחר את פונקציית מצב ציור המרחק והתאם את הגדרות הפרמטר לפי הצורך. לאחר שכל הפרמטרים נקבעו, הקש על מקש Escape ולחץ על צייר כדי לעקוב אחר ההיקף של קשת הלוע השלישית באמצעות סמן העכבר.לאחר מכן השתמשו בתמרור הפרוסה כדי להזיז 10 עד 25 פרוסות ולעקוב אחר היקף קשת הלוע. לאחר מעקב אחר הקשת כולה, לחץ על צור משטח כדי ליצור את פני השטח של האזור שעקבו אחריה. למסיכה של המבנים שעל פני השטח, בתפריט העריכה, בחרו בחירת מסיכה עבור PAA ו- DAPI השלישי ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן שנה את שם הערוץ החדש כ- DAPI של PAA.חזור על שלב זה עבור הערוצים הנותרים. כדי להמחיש את מקלעת ה- endothelial בנפרד מה- PAA, בחר בחירת מסיכה עבור ה- PAA השלישי ובחר DAPI. בטלו את הסימון של voxels נבחרים מחוץ למשטח ובדקו עד כדי כך את הווקסלים הנבחרים בפנים.הגדר את הווקסלים הנבחרים בתוך פני השטח לאפס ולחץ על אישור. שנה את שם הערוץ החדש כ- DAPI שאינו PAA. חזור על שלב זה עבור הערוצים הנותרים. בחרו בחירת מסיכה עבור ה- PA השלישי ובחרו DAPI שאינו PAA ולחצו על הלחצן 'אשר'. שנה את שם הערוץ החדש כ- DAPI של מקלעת.חזור על שלב זה עבור הערוצים הנותרים. לכימות תאי ה אנדותל בודדים בתוך כל מבנה מעניין, בחלונית 'התאמות תצוגה', כבו את כל הערוצים למעט ערוץ PAA ERG. תחת תפריט מאפיינים, לחץ על הוסף כתמים חדשים ולחץ כדי לשנות שם של נקודות מספר אחד הכולל של תאי אנדותל של PAA.לחץ על החץ הכחול ובחר בערוץ PAA ERG עבור ערוץ המקור. התאימו את קוטר ה-XY המשוער לארבעה מיקרומטרים ולחצו על החץ הכחול כדי להמשיך לחלונית הבאה. השתמש בסולם ההזזה כדי להתאים את מספר הנקודות כדי להבטיח שכל גרעין תא אנדותל חיובי של ERG מיוצג על ידי נקודה אחת.לאחר מכן, לחצו על החץ הכפול הירוק וכבו את ערוץ PAA ERG בחלונית 'התאמת תצוגה'. הפעל את ערוץ PAA VEGFR2 כדי להמחיש את אנדותל PAA ולחץ על עריכה והוספה/מחיקה כדי לבחור משטח של אובייקט. לאחר מכן הקישו Escape והחזיקו את מקש Shift לחוץ כדי למחוק נקודות אינן חיוביות VEGFR2 ולחצו על הכרטיסייה סטטיסטיקה כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי אנדותל.שפעת חיסונית של הר שלם מייצרת תוצאות ברורות ונקיות המאפשרות שחזור תלת-מימדי של אנדותל הקשת הלוע. בתמונה זו, הנוכחות של נקודות בהירות גדולות היא תוצאה של חלקיקים או הנוגדן או חסימת פתרונות חיץ. לאחר קשת הלוע וכתמי משטח PAA, השימוש בפונקציית המסכה מאפשר להפריד את האזורים שעל פני השטח ולנתח אותם באופן עצמאי.מיסוך מאפשר גם ניתוח וכמות אינדיבידואליים של מספרי תאים אנדותל בתוך כל מבנה. לדוגמה, כאן נעשה שימוש בתכונת הספוט לכימות המספר הכולל של תאי אנדותל הן ב- PAA והן במקלה על-ידי הקצאת נקודה בודדת עבור כל גרעין המבטא ERG. בתמונה זו, נקודה שלילית VEGFR2 חיובי ERG שנוצר על ידי פונקציית ספוט ניתן לראות.לכן, חיוני לוודא שכל נקודה המזוהה על-ידי התוכנה מייצגת למעשה תא אנדותל יחיד. כדי להשיג תמונות נקיות וברורות, זכרו לסובב את כל הפתרונות ולשטוף כראוי וביסודיות כל עובר לאחר דגירה של נוגדנים. חשוב לזכור כי BABB הוא מאכל ורעיל.לטפל ולהשליך את הממס כראוי הקפד לאטום את העוברים מומס לחלוטין כדי למנוע דליפת BABB.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...