Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
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हम इस पांडुलिपि को सावधानीपूर्वक पढ़ने और संपादन के लिए ब्रिएना अलेक्जेंडर, काओलान ओ डोनेल और माइकल वारकला का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान के एनआईएच R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 से एसए के वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था; एजेआर को NHLBI HL103920-08S1 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज ट्रेनिंग ग्रांट T32052283-11 द्वारा समर्थित है ।

रटगर्स विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पशु उपयोग और प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी ।
1. समाधान की तैयारी
<ol><li>0.1% ट्राइटन-एक्स-100 (पीएसटी) और फिल्टर स्टर्लिटी के साथ फ?...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

3 डी में माउस भ्रूण में एंडोथेलियम की कल्पना करने की क्षमता ने उनके विकास3में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की है । यहां हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो भ्रूण के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी इमेजिंग, संवहनी कने...

माउस भ्रूण उत्पत्ति के दौरान, फरियांगल आर्क धमनियां (PAAs) धमनियों के सममित, द्वि-पार्श्व जोड़े के रूप में उत्पन्न होती हैं जो दिल को पृष्ठीय महाधमनी1से जोड़ती हैं। जैसे-जैसे भ्रूण विकसित होता है, पीएए के पहले और दूसरे जोड़े पीछे हटजाते हैं, जबकि3,4और6 पीए महाधमनी आर्क धमनियों2बनाने के लिए विषम रीमॉडलिंग घटनाओं की एक श्रृंखला से गुजरते हैं।
PAAs 3, 4 और 6 वास्कुलोजेनेसिस के माध्यम से विकसित होता है, जो रक्त वाहिकाओं का डी नोवो गठनहै 3। इन कट्टर धमनियों के गठन या रीमॉडलिंग में दोष विभिन्न जन्मजात हृदय दोषों को जन्म देते हैं, जैसे कि डिजॉर्ज सिंड्रोम4,5के रोगियों में देखे जाते हैं। इसलिए, PAAs के विकास को विनियमित करने वाले तंत्रों को समझना जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) एटिजियोलॉजी की बेहतर समझ पैदा कर सकता है।
पीएए विकास की कल्पना और विश्लेषण के लिए वर्तमान दृष्टिकोणों में ऊतक वर्गों की प्रतिरक्षण, संवहनी डाले, भारत स्याही इंजेक्शन, उच्च संकल्प एपिस्कोपिक माइक्रोस्कोपी, और/या पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री1,,4,,5,,6,,7शामिल हैं । इसके साथ, हम वॉल्यूमेट्रिक डेटा, वैस्कुलर कनेक्टिविटी और सेल पहचान को इकट्ठा करने, विश्लेषण करने और निर्धारित करने के लिए पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3डी इमेज रेंडरिंग के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम प्रत्येक फैरिंगियल आर्क में ईसीएस की संख्या को विभाजित करने और निर्धारित करने की एक विधि का विस्तार करते हैं, जो प्रत्येक फैरिंगियल आर्क वैस्कुलर प्लेक्सस के गठन और पीए में इसके पुनर्मॉडलिंग का अध्ययन करने के साधन के रूप में है। हालांकि यह प्रोटोकॉल पीएए विकास का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है, इसका उपयोग अन्य विकासशील संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

मूत्रार्ज आर्क धमनियों (PAAs) 3, 4, और 6 के अनुचित गठन या रीमॉडलिंग जन्मजात हृदय रोग के सबसे गंभीर रूपों में से कुछ में योगदान करते हैं। PAAs के गठन का अध्ययन करने के लिए, हम पूरे माउंट प्रतिकार का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल विकसित बेंजाइल शराब के साथ मिलकर/ यह एक ठीक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ-साथ वास्कुलचर की 3डी कनेक्टिविटी पर फैरिंगल आर्क एंडोथेलियम के दृश्य के लिए अनुमति देता है। सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, हमने पीएए में एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के साथ-साथ फैरिंगियल मेहराब 3, 4 और 6 के भीतर पीए के आसपास के संवहनी जाल के भीतर ईसीएस की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है। जब पूरे भ्रूण पर लागू किया जाता है, तो यह पद्धति भ्रूणीय वास्कुलचर का एक व्यापक दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करती है।

यहां प्रस्तुत पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल स्पष्ट और स्वच्छ परिणाम पैदा करता है, जो फारिंगियल आर्क एंडोथेलियम के 3डी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है, जैसा कि चित्रा ...

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Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

यहां, हम पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ऊतक समाशोधन, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके फैरिंगियल आर्क धमनियों 3, 4 और माउस भ्रूण के 6 की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके Pharyngeal आर्क धमनियों का दृश्य और विश्लेषण

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

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ग्रसनी मेहराब के पूर्व vivo संस्कृति हार्ट और स्नायु progenitors और अपने आला अध्ययन करने के लिए

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

अंग संस्कृति और माउस Wolffian नलिकाओं का पूरा पर्वत इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

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भ्रूणीय एंजियोजेनेसिस के विज़ुअलाइज़ेशन और क्वांटिटेटिव विश्लेषण<em&gt; ज़ीनोपस ट्रॉपिकलिस</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

क्षैतिज पूरे माउंट: मोटा, तीन आयामी ऊतक के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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Zebrafish में Multiciliated कोशिकाओं visualizing सीटू संकरण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट के एक संयुक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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पूरे माउंट समाशोधन और Arabidopsis फूल अंगों और Siliques के दाग

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्रसंस्कृत माउस अंडाशय के कूप ठहराव

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Immunohistochemistry, पश्चिमी विश्लेषण, और आरएनए अलगाव के लिए Drosophila प्यूपल रेटिना का विच्छेदन

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...