Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Vi takker Brianna Alexander, Caolan O'Donnell og Michael Warkala for nøye lesing og redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av finansieringen fra National Heart, Lung and Blood Institute of nih R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR støttes av NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Training grant T32052283-11.

Dyrebruk og prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Rutgers University.
1. Utarbeidelse av løsninger
<ol><li>Forbered 1 L fosfatbufret saltvann med 0,1% Triton-X-100 (PBST) og filtersteriliser. Denne løsningen kan lagres ved romtemperatur (RT) i minst et år.</li>
	<li>Forbered 600 μL blokkeringsbuffer bestående av 10 % av det normale eselserumet i PBST. Gjør denne løsningen frisk hver gang.</li>
	<li>Forbered 50 ml av følgende metanol (MeOH) fortynn...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

Evnen til å visualisere endotelet i museembryoer i 3D har gitt ny innsikt i deres utvikling3. Her presenterer vi en protokoll som muliggjør høyoppløselig 3D-avbildning av embryoer, visualisering av vaskulær tilkobling og kvantitative analyser av PAA-dannelse. Denne protokollen kan brukes for å se hvordan genetiske endringer eller miljøfornærmelser påvirker PAA-utviklingen. Prosedyren som rapporteres her bruker antistoffer mot VEGFR2 og ERG for å visualisere PAA-dannelse og kvantifisere E...

Under museembryogenese oppstår faryngeal erkearterier (PAAer) som symmetriske, tosidige par arterier som forbinder hjertet med den dorsal aortae1. Som embryoet utvikler seg, gjennomgår de første og andre parpaene av PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gjennomgår en rekke asymmetriske remodeling hendelser for å danne aortaerinarteriene2.
PaAs 3, 4 og 6 utvikler seg via vaskuogenese, som er de novo-dannelsen av blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygging av disse erkearteriene gir opphav til ulike medfødte hjertefeil, slik som de som er sett hos pasienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse av mekanismer som regulerer utviklingen av PAAer føre til en bedre forståelse av medfødt hjertesykdom (CHD) etiologi.
Nåværende tilnærminger for visualisering og analyse av PAA-utvikling inkluderer immunfluorescens av vevsseksjoner, vaskulære støperier, India blekkinjeksjon, høy oppløsning episkopisk mikroskopi, og / eller helmontert immunohistochemistry1,4,5,6,7. Her beskriver vi en protokoll som kombinerer hele mount immunofluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-bildegjengivelse for å samle inn, analysere og kvantifisere volumetriske data, vaskulær tilkobling og celleidentitet. Videre beskriver vi en metode for å compartmentalize og kvantifisere antall ECer i hver faryngeal bue som et middel til å studere dannelsen av faryngeal bue vaskulær plexus og dens ombygging i PAAs. Mens denne protokollen er designet for å analysere PAA-utvikling, kan den brukes til å analysere andre utviklende vaskulære nettverk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

Feil dannelse eller ombygging av farynleskearteriene (PAAer) 3, 4 og 6 bidrar til noen av de mest alvorlige formene for medfødt hjertesykdom. For å studere dannelsen av PAAer utviklet vi en protokoll ved hjelp av hele mount immunofluorescens kombinert med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vevsrydding og konfokal mikroskopi. Dette gjør det mulig for visualisering av faryngitteret i enfin cellulær oppløsning samt 3D-tilkoblingen til vaskulaturen. Ved hjelp av programvare har vi etablert en protokoll for å kvantifisere antall endotelceller (ECer) i PAAer, samt antall ECer i vaskulær plexus rundt PAAer innenfor farynlesbuer 3, 4 og 6. Når den brukes på hele embryoet, gir denne metodikken en omfattende visualisering og kvantitativ analyse av embryonalvaskulatur.

Den helmonterte immunofluorescensprotokollen som presenteres her, gir klare og rene resultater, noe som åpner for 3D-rekonstruksjon av farynleerendotel, som sett i figur 1A. Det er viktig å inkubere embryoer i tilstrekkelig tid i hver antistoffløsning for å sikre fullstendig penetrasjon gjennom prøven, samt grundig vasking av embryoer etter antistoffinkubasjon. I figur 1Bvises store, lyse pr...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Her beskriver vi en protokoll for å visualisere og analysere de faryngeale buearteriene 3, 4 og 6 av museembryoer ved hjelp av hele mount immunofluorescens, vevsydding, konfokal mikroskopi og 3D-rekonstruksjon.

Visualisering og analyse av farynle arterier ved hjelp av hele mount immunohistokjemi og 3D rekonstruksjon

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Denne metoden gjør at hver svelgebue kan komplementeres. Endotelcelletall kan deretter kvantifiseres i hver bue som et middel til å studere svelgeal buearterieutvikling. De viktigste fordelene med denne tilnærmingen er evnen til å visualisere forholdet mellom forskjellige vaskulære strukturer og evnen til kvantitativt å bestemme hvordan strukturene påvirket mutantene.Aorta bue arterier er ofte mutert i medfødt hjertesykdom. Vår metode gjør det mulig å studere hvordan mutasjoner endrer den fysiologiske prosessen med kardannelse og ombygging. Selv om vi bruker denne metoden for å få innsikt i mekanismene for medfødt hjertesykdom, kan den brukes på andre systemer, spesielt ved bruk av lysarkmikroskopi.Begynn med å bruke en glasspipette til å overføre hver muse embryonale dag 9,5 eller 10,5 embryo til individuelle to milliliter rør som inneholder en milliliter PBS. Etter fiksering, bruk fine tang for å forsiktig klemme embryoet like over bakkulb og lage et tverrgående kutt for å fjerne den bakre halvdelen av embryoet. For å gjennomsyre embryoene, erstatt PBS med PBST og plasser embryoene på fire grader Celsius med mild agitasjon over natten.Neste dag erstatter du PBST med 600 mikroliter blokkerer buffer uten å berøre embryoene for en 16 til 18-timers inkubasjon ved fire grader Celsius med mild agitasjon. Neste morgen, erstatte blokkering buffer med 600 mikroliter av det primære antistoffet av interesse per rør for en fire til fem-dagers inkubasjon ved fire grader Celsius med mild agitasjon. På slutten av inkubasjonen, vask embryoene i en milliliter PBST i fire til fem timer med mild agitasjon ved romtemperatur som endrer PBS hver time, etterfulgt av en overnattingsinkubasjon i fersk PBST ved fire grader Celsius og fire til fem ekstra en-timers vasker neste dag.Etter siste vask, bytt PBST i hvert rør med 600 mikroliter av riktig sekundær antistoffløsning for en fire til fem-dagers inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask embryoene i en milliliter frisk PBST per vask som nettopp demonstrert og bruk en glasspipette til å forsiktig overføre hvert embryo til individuelle plastparafinformer. Fjern forsiktig eventuell PBST fra rundt hvert embryo og orienter hvert embryo i sagittal stilling.Deretter legger du raskt til ca 500 mikroliter varm agarose til hver form til hvert embryo bare er dekket og legg formene på is dekket med aluminiumsfolie til agarose har størknet. For dehydrering av embryonale prøver, bruk en ren skalpell for å kutte en blokk med agarose rundt hvert embryo og bruk tang for å forstå agarose for overføring til et merket to milliliter rør som inneholder en milliliter 25% metanol. Etter en times inkubasjon med mild agitasjon i mørket, erstatt 25% metanol med en milliliter 50% metanol per rør for en ekstra en times inkubasjon i mørket.Etter slutten av dehydrering, erstatte 100% metanol med en milliliter på 50% BABB for en times inkubasjon med mild agitasjon i mørket. På slutten av inkubasjonen, erstatte 50% BABB med en milliliter på 100% BABB per rør for en times inkubasjon med mild agitasjon i mørket, etterfulgt av en andre inkubasjon med 100% BABB som nettopp demonstrert. For å montere embryoene for avbildning, fjern limet fra en rask støtfanger og plasser støtfangeren på en 24 med seks milliliter nummer 1,5 glassdeksler.Påfør forsiktig trykk på limet for å fjerne eventuelle luftbobler mellom dekkslipsen og støtfangeren og kast forsiktig 100% BABB fra hvert rør. Bruk deretter fine tang for å forsiktig overføre embryoet til den raske brønnen uten å berøre embryoet og plassere en ekstra dekkslip på støtfangeren. For å overflate endotelet i hele den tredje svelgealbuen, åpne bildet av interesse for programvaren og klikk legg til ny overflate.Dobbeltklikk overflaten en og endre navn på den nye overflaten til tredje svelgebue. Velg hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt, og sett overflateretningen til YZ-planet. Bruk skiveposisjonen til å plassere det tredje svelgebueoverflaten til der den tredje PAA og dorsal aorta kobles til.Roter bildet slik at den tredje pharyngeal bue overflaten flyet er i sikte og slå av ortho slicer. Under tegnekonturmodus velger du funksjonen for avstandstegningsmodus og justerer parameterinnstillingene etter behov. Når alle parameterne er angitt, trykker du escape-tasten og klikker tegne for å spore omkretsen av den tredje svelgealbuen med musepekeren.Bruk deretter skiveposisjonen til å flytte 10 til 25 skiver og spore omkretsen av svelgealbuen. Når hele buen er sporet, klikker du opprett overflate for å generere overflaten av det sporede området. Velg maskevalg for den tredje PAA- og DAPI-en i redigeringsmenyen for maskering av de viste strukturene, og klikk OK. Deretter gi nytt navn til den nye kanalen som PAA DAPI.Gjenta dette trinnet for de gjenværende kanalene. Hvis du vil visualisere endotelplexus separat fra PAA, velger du maskevalg for den tredje PAA-en og velger DAPI. Fjern merket for velg voxels utenfor overflaten til og sjekk velg voxels inne overflaten til.Sett velg voxels i overflaten til null, og klikk OK. Gi nytt navn til den nye kanalen som ikke-PAA DAPI. Gjenta dette trinnet for de gjenværende kanalene. Velg maskevalg for den tredje PA, velg ikke-PAA DAPI, og klikk OK. Gi nytt navn til den nye kanalen som plexus DAPI.Gjenta dette trinnet for de gjenværende kanalene. Hvis du vil kvantifisere de enkelte endotelcellene i hver interessestruktur, slår du av alle kanalene unntatt PAA ERG-kanalen i skjermjusteringspanelet. Klikk Legg til nye flekker på Egenskaper-menyen, og klikk for å gi nytt navn til flekker én PAA totalt antall endotelceller.Klikk på den blå pilen, og velg PAA ERG-kanalen for kildekanalen. Juster den estimerte XY-diameteren til fire mikrometer, og klikk på den blå pilen for å gå videre til neste panel. Bruk glideskalaen til å justere antall flekker for å sikre at hver ERG-positiv endotelcellekjerne er representert med ett sted.Deretter klikker du på den grønne doble pilen og slår av PAA ERG-kanalen i skjermjusteringspanelet. Slå på PAA VEGFR2-kanalen for å visualisere PAA endotelet, og klikk rediger og legg til / slett for å velge overflaten av objektet. Trykk deretter Escape og hold nede Skift for å slette eventuelle flekker som ikke er VEGFR2-positive, og klikk kategorien statistikk for å bestemme totalt antall endotelceller.Hele mount immunofluorescence gir klare og rene resultater slik at 3D rekonstruksjon av svelget bue endotel. I dette bildet er tilstedeværelsen av de store lyse prikkene et resultat av partikler i enten antistoffet eller blokkerer bufferløsninger. Etter svelgbue og PAA overflatefarging, gjør bruk av maskefunksjonen at de overflateområdene kan separeres og uavhengig analyseres.Maskering tillater også individuell analyse og kvantifisering av endotelcellenumre i hver struktur. For eksempel, her spotfunksjonen ble brukt til å kvantifisere det totale antall endotelceller i både PAA og plexus ved å tildele et enkelt sted for hver kjerne som uttrykker ERG. I dette bildet kan et ERG-positivt VEGFR2 negativt sted som er generert av spotfunksjonen observeres.Derfor er det viktig å kontrollere at hver prikk gjenkjent av programvaren faktisk representerer en enkelt endotelcelle. For å få rene og klare bilder, husk å spinne ned alle løsningene og til riktig og grundig vaske hvert embryo etter antistoff inkubasjoner. Det er viktig å huske at BABB er etsende og giftig.Håndter og kast oppløsningsvæsken riktig og sørg for å forsegle de smeltede embryoene helt for å forhindre BABB-lekkasje.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescensanalyse Farging av Muse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...