Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
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Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O'Donnell e Michael Warkala pela leitura e edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do National Heart, Lung and Blood Institute do NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 para SA; A AJR é apoiada pelo NHLBI HL103920-08S1 e pelo Instituto Nacional de Artrite e Treinamento de Doenças Musculoesqueléticas e de Pele grant T32052283-11.

O uso e os procedimentos de uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade Rutgers.
1. Elaboração de soluções
<ol><li>Prepare 1 L de solução salina tamponada com 0,1% Triton-X-100 (PBST) e esterilização do filtro. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) por pelo menos um ano.</li>
	<li>Prepare 600 μL de tampão de bloqueio composto por 10% do soro de burro normal em PBST. Faça esta solução fresca cad...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

A capacidade de visualizar o endotélio em embriões de camundongos em 3D forneceu novas percepções sobre seu desenvolvimento3. Aqui apresentamos um protocolo que permite imagens 3D de alta resolução de embriões, visualização da conectividade vascular e análises quantitativas da formação de PAA. Este protocolo pode ser empregado para ver como alterações genéticas ou insultos ambientais afetam o desenvolvimento do PAA. O procedimento aqui relatado utiliza anticorpos contra VEGFR2 e ERG...

Durante a embriogênese do camundongo, as artérias arqueína faríngeas (PAAs) surgem como pares bilaterais simétricos de artérias que conectam o coração com a aortae dorsal1. À medida que o embrião se desenvolve, o primeiro e o segundo pares de PAAs regredem, enquanto os3º,4ºe6º PAAs passam por uma série de eventos de remodelação assimétrica para formar as artérias arqueoréticas2.
Os PAAs 3, 4 e 6 desenvolvem-se através da vasculogênese, que é a formação de novo dos vasos sanguíneos3. Defeitos na formação ou remodelação dessas artérias arqueais dão origem a vários defeitos cardíacos congênitos, como os observados em pacientes com Síndrome de DiGeorge4,5. Portanto, a compreensão de mecanismos que regulam o desenvolvimento de PAAs pode levar a uma melhor compreensão da etiologia da doença cardíaca congênita (CHD).
As abordagens atuais para visualizar e analisar o desenvolvimento do PAA incluem imunofluorescência de seções teciduais, moldes vasculares, injeção de tinta índia, microscopia episcópica de alta resolução e/ou imunohistoquímica de montagem total1,,4,,5,6,7. Aqui, descrevemos um protocolo que combina imunofluorescência total, microscopia confocal e renderização de imagem 3D, a fim de coletar, analisar e quantificar dados volumétricas, conectividade vascular e identidade celular. Além disso, detalhamos um método para compartimentar e quantificar os números de CE em cada arco faríngeo como forma de estudar a formação do plexo vascular do arco faríngeo e sua remodelação nos PAAs. Embora este protocolo seja projetado para analisar o desenvolvimento do PAA, ele pode ser usado para analisar outras redes vasculares em desenvolvimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

A formação inadequada ou a remodelação das artérias do arco faríngeo (PAAs) 3, 4 e 6 contribuem para algumas das formas mais graves de doença cardíaca congênita. Para estudar a formação de PAAs, desenvolvemos um protocolo utilizando imunofluorescência de montagem completa juntamente com a limpeza de tecido de álcool benzílico/benzoato de benzílico (BABB) e microscopia confocal. Isso permite a visualização do endotélio do arco faríngeo em uma resolução celular fina, bem como a conectividade 3D da vasculatura. Usando software, estabelecemos um protocolo para quantificar o número de células endoteliais (CEIs) em PAAs, bem como o número de CE dentro do plexo vascular em torno dos PAAs dentro dos arcos faríngea3, 4 e 6. Quando aplicada a todo o embrião, essa metodologia proporciona uma visualização abrangente e análise quantitativa da vasculatura embrionária.

O protocolo de imunofluorescência de montagem completa aqui apresentado produz resultados claros e limpos, permitindo a reconstrução 3D do endotélio do arco faríngeo, como visto na Figura 1A. É importante incubar embriões por tempo suficiente em cada solução de anticorpos para garantir a penetração completa através da amostra, bem como, lavar completamente os embriões após a incubação de anticorpos. Na Fig...

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Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar e analisar as artérias do arco faríngeo 3, 4 e 6 dos embriões de camundongos usando imunofluorescência de montagem total, limpeza de tecidos, microscopia confocal e reconstrução 3D.

Visualização e Análise de Artérias ariníngeos usando Imunohistoquímica de montagem integral e Reconstrução 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Este método permite que cada arco faringeal seja compartimentalizado. Os números de células endoteliais podem então ser quantificados em cada arco como um meio de estudar o desenvolvimento da artéria do arco faringeal. As principais vantagens dessa abordagem são a capacidade de visualizar a relação entre diferentes estruturas vasculares e a capacidade de determinar quantitativamente como as estruturas afetaram os mutantes.Artérias arcadas aórticas são comumente mutadas em doenças cardíacas congênitas. Nosso método permite o estudo de como as mutações alteram o processo fisiológico de formação e remodelação de vasos. Embora usemos este método para obter insights sobre os mecanismos de doença cardíaca congênita, ele pode ser aplicado a outros sistemas particularmente com o advento da microscopia de folha de luz.Comece usando uma pipeta de vidro para transferir cada embrionário de camundongos dia 9,5 ou 10,5 embriões em dois tubos mililitros individuais contendo um mililitro de PBS. Após a fixação, use fórceps finos para beliscar cuidadosamente o embrião logo acima da plataforma traseira e fazer um corte transversal para remover a metade posterior do embrião. Para permeabilizar os embriões, substitua o PBS por PBST e coloque os embriões a quatro graus Celsius com agitação suave durante a noite.No dia seguinte, substitua o PBST por 600 microliters de tampão de bloqueio sem tocar nos embriões para uma incubação de 16 a 18 horas a quatro graus Celsius por agitação suave. Na manhã seguinte, substitua o tampão de bloqueio por 600 microliters do anticorpo primário de interesse por tubo para uma incubação de quatro a cinco dias a quatro graus Celsius por agitação suave. No final da incubação, lave os embriões em um mililitro de PBST por quatro a cinco horas com agitação suave à temperatura ambiente mudando o PBS a cada hora, seguido de uma incubação durante a noite em PBST fresco a quatro graus Celsius e quatro a cinco lavagens adicionais de uma hora no dia seguinte.Após a última lavagem, substitua o PBST em cada tubo por 600 microliters da solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de quatro a cinco dias a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave os embriões em um mililitro de PBST fresco por lavagem como acabou de demonstrar e use uma pipeta de vidro para transferir suavemente cada embrião em moldes individuais de parafina plástica. Remova cuidadosamente qualquer PBST ao redor de cada embrião e oriente cada embrião em uma posição sagital.Em seguida, adicione rapidamente cerca de 500 microliters de agarose quente a cada molde até que cada embrião esteja apenas coberto e coloque os moldes no gelo cobertos com papel alumínio até que a ágarose se solidifique. Para a desidratação das amostras embrionárias, use um bisturi limpo para cortar um bloco de agarose em torno de cada embrião e use fórceps para agarrar a agarose para transferência em um tubo de dois mililitros rotulados contendo um mililitro de 25% de metanol. Após uma incubação de uma hora com agitação suave no escuro, substitua 25% de metanol por um mililitro de 50% de metanol por tubo para uma incubação adicional de uma hora no escuro.Após o fim da desidratação, substitua o metanol de 100% por um mililitro de 50% BABB para uma incubação de uma hora com agitação suave no escuro. Ao final da incubação, substitua o BABB de 50% por um mililitro de 100% BABB por tubo para uma incubação de uma hora com agitação suave no escuro, seguido de uma segunda incubação com 100% BABB como apenas demonstrado. Para montar os embriões para imagem, remova o adesivo de um para-choque rápido e coloque o para-choques em um deslizamento de vidro de 24 por seis mililitros.Aplique uma pressão suave no adesivo para remover quaisquer bolhas de ar entre o deslizamento de tampa e o para-choque e descarte cuidadosamente o BABB 100% de cada tubo. Em seguida, use fórceps finos para transferir cuidadosamente o embrião para o poço rápido sem tocar no embrião e colocar uma segunda mancha de cobertura no para-choque. Para emergir o endotélio em todo o terceiro arco faringeal, abra a imagem de interesse no software e clique em adicionar nova superfície.Superfície de duplo clique e renomeie a nova superfície para terceiro arco faringeal. Selecione pular a criação automática, editar manualmente e definir a orientação de superfície para o plano YZ. Use a posição de fatia para colocar o terceiro plano de superfície do arco faringeal para onde o terceiro PAA e a aorta dorsal se conectam.Gire a imagem para que o terceiro plano de superfície do arco faringeal esteja à vista e desligue o cortador de orto. No modo contorno de saque, selecione a função do modo de desenho de distância e ajuste as configurações do parâmetro conforme necessário. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, pressione a tecla Escape e clique em desenhar para rastrear o perímetro do terceiro arco faringeal com o cursor do mouse.Em seguida, use a posição de fatia para mover 10 a 25 fatias e traçar o perímetro do arco faringeal. Quando todo o arco tiver sido rastreado, clique em criar superfície para gerar a superfície da região rastreada. Para mascarar as estruturas superficiais, no menu de edição, selecione a seleção de máscaras para o terceiro PAA e DAPI e clique em OK. Em seguida, renomeie o novo canal como PAA DAPI.Repita esta etapa para os canais restantes. Para visualizar o plexo endotelial separadamente do PAA, selecione a seleção de máscaras para o terceiro PAA e selecione DAPI. Desmarque voxels externos e verifique voxels selecionados dentro da superfície para.Defina voxels selecionados dentro da superfície para zero e clique em OK. Renomeie o novo canal como DAPI não-PAA. Repita esta etapa para os canais restantes. Selecione a seleção de máscaras para o terceiro PA e selecione o DAPI não-PAA e clique em OK. Renomeie o novo canal como plexus DAPI.Repita esta etapa para os canais restantes. Para quantificar as células endoteliais individuais dentro de cada estrutura de interesse, no painel de ajustes de exibição, desligue todos os canais, exceto o canal PAA ERG. No menu de propriedades, clique em adicionar novas manchas e clique para renomear manchas de um número total de células endoteliais do PAA.Clique na seta azul e selecione o canal PAA ERG para o canal de origem. Ajuste o diâmetro XY estimado para quatro micrômetros e clique na seta azul para prosseguir para o próximo painel. Use a escala deslizante para ajustar o número de manchas para garantir que cada núcleo celular endotelial positivo do ERG seja representado por um ponto.Em seguida, clique na seta dupla verde e desligue o canal PAA ERG no painel de ajuste de exibição. Ligue o canal PAA VEGFR2 para visualizar o endotélio PAA e clique em editar e adicionar/excluir para selecionar a superfície do objeto. Em seguida, pressione Escape e segure Shift para excluir quaisquer pontos que não sejam POSITIVOS VEGFR2 e clique na guia estatísticas para determinar o número total de células endoteliais.A imunofluorescência de montagem inteira produz resultados claros e limpos permitindo a reconstrução 3D do endotélio do arco faringeal. Nesta imagem, a presença dos grandes pontos brilhantes é o resultado de partículas no anticorpo ou no bloqueio de soluções tampão. Após a coloração do arco faringeal e da superfície paa, o uso da função da máscara permite que as regiões superficiais sejam visualmente separadas e analisadas independentemente.O mascaramento também permite a análise individual e quantificação dos números de células endoteliais dentro de cada estrutura. Por exemplo, aqui o recurso spot foi usado para quantificar o número total de células endoteliais tanto no PAA quanto no plexo, atribuindo um único ponto para cada núcleo expressando ERG. Nesta imagem, pode-se observar um ponto negativo VEGFR2 positivo do ERG que foi gerado pela função spot.Portanto, é essencial verificar se cada ponto reconhecido pelo software representa realmente uma única célula endotelial. Para obter imagens limpas e claras, lembre-se de girar todas as soluções e lavar adequadamente e completamente cada embrião após incubações de anticorpos. É importante lembrar que o BABB é corrosivo e tóxico.Manuseie e descarte o solvente corretamente e certifique-se de selar completamente os embriões derretidos para evitar o vazamento de BABB.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

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Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Biologia do Desenvolvimento

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

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Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...