Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O'Donnell y Michael Warkala por la lectura y edición cuidadosa de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la financiación del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR cuenta con el apoyo de NHLBI HL103920-08S1 y la beca T32052283-11 del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de La Piel.

El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rutgers.
1. Preparación de soluciones
<ol><li>Preparar 1 L de solución salina tamponada de fosfato con 0.1% Triton-X-100 (PBST) y filtrar esterilizar. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) durante al menos un año.</li>
	<li>Preparar 600 l de tampón de bloqueo que consiste en 10% del suero de burro normal en PBST. Haga que esta so...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

La capacidad de visualizar el endotelio en embriones de ratón en 3D ha proporcionado nuevas perspectivas sobre su desarrollo3. Aquí presentamos un protocolo que permite la toma de imágenes 3D de alta resolución de embriones, la visualización de la conectividad vascular y los análisis cuantitativos de la formación de PAA. Este protocolo se puede emplear para ver cómo las alteraciones genéticas o los insultos ambientales afectan el desarrollo de la PAA. El procedimiento descrito aquí utili...

Durante la embriogénesis del ratón, las arterias del arco faríngeo (PAA) surgen como pares simétricos, bilaterales de arterias que conectan el corazón con las aortas dorsales1. A medida que el embrión se desarrolla, el primer y segundo par de PAA retroceden, mientras que losPAA 3,4y 6 se someten a una serie de eventos de remodelación asimétrica para formar las arterias del arco aórtico2.
Los PAA 3, 4 y 6 se desarrollan a través de vasculogénesis, que es la formación de novo de los vasos sanguíneos3. Los defectos en la formación o remodelación de estas arterias del arco dan lugar a diversos defectos cardíacos congénitos, como los observados en pacientes con Síndrome de DiGeorge4,5. Por lo tanto, comprender los mecanismos que regulan el desarrollo de los PAA puede conducir a una mejor comprensión de la etiología de las enfermedades cardíacas congénitas ( CHD).
Los enfoques actuales para visualizar y analizar el desarrollo de PAA incluyen inmunofluorescencia de secciones tisulares, moldes vasculares, inyección de tinta de la India, microscopía episcópica de alta resolución y/o inmunohistoquímica de montaje completo1,4,5,6,7. Aquí, describimos un protocolo que combina inmunofluorescencia de montaje completo, microscopía confocal y renderizado de imágenes 3D con el fin de recopilar, analizar y cuantificar datos volumétricos, conectividad vascular e identidad celular. Además, detallamos un método para compartimentar y cuantificar el número de CE en cada arco faríngeo como un medio para estudiar la formación del arco faríngeo plexo vascular y su remodelación en los PAA. Si bien este protocolo está diseñado para analizar el desarrollo de PAA, se puede utilizar para analizar otras redes vasculares en desarrollo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

La formación o remodelación inadecuadas de las arterias del arco faríngeo (PAA) 3, 4 y 6 contribuyen a algunas de las formas más graves de cardiopatía congénita. Para estudiar la formación de PAA, desarrollamos un protocolo utilizando inmunofluorescencia integral junto con la limpieza de tejido de alcohol bencílico/benzilo bencílico (BABB), y microscopía confocal. Esto permite la visualización del endotelio del arco faríngeo a una resolución celular fina, así como la conectividad 3D de la vasculatura. Utilizando software, hemos establecido un protocolo para cuantificar el número de células endoteliales (ECs) en PAA, así como el número de ECs dentro del plexo vascular que rodea a los PAA dentro de los arcos faríngeos 3, 4 y 6. Cuando se aplica a todo el embrión, esta metodología proporciona una visualización integral y un análisis cuantitativo de la vasculatura embrionaria.

El protocolo de inmunofluorescencia de montaje completo presentado aquí produce resultados claros y limpios, permitiendo la reconstrucción 3D del endotelio del arco faríngeo, como se ve en la Figura 1A. Es importante incubar embriones durante una cantidad suficiente de tiempo en cada solución de anticuerpos para asegurar una penetración completa a través de la muestra, así como lavar a fondo los embriones después de la incubación de ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Aquí, describimos un protocolo para visualizar y analizar las arterias del arco faríngeo 3, 4 y 6 de embriones de ratón utilizando inmunofluorescencia de montaje completo, limpieza de tejidos, microscopía confocal y reconstrucción 3D.

Visualización y análisis de arterias de arco faríngeo utilizando inmunohistoquímica de montaje completo y reconstrucción 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Este método permite compartimentar cada arco faríngeo. Los números de células endoteliales se pueden cuantificar en cada arco como un medio para estudiar el desarrollo de la arteria del arco faríngeo. Las principales ventajas de este enfoque son la capacidad de visualizar la relación entre diferentes estructuras vasculares y la capacidad de determinar cuantitativamente cómo las estructuras afectaron a los mutantes.Las arterias del arco aórtico suelen mutarse en la cardiopatía congénita. Nuestro método permite el estudio de cómo las mutaciones alteran el proceso fisiológico de formación y remodelación de los vasos. Aunque utilizamos este método para obtener información sobre los mecanismos de las enfermedades cardíacas congénitas, se puede aplicar a otros sistemas particularmente con la llegada de la microscopía de láminas de luz.Comience usando una pipeta de vidrio para transferir cada ratón embrionario 9.5 o 10.5 embrión a dos tubos individuales de dos mililitros que contienen un mililitro de PBS. Después de la fijación, utilice fórceps finos para pellizcar cuidadosamente el embrión justo por encima de la extremidad posterior y hacer un corte transversal para eliminar la mitad posterior del embrión. Para permeabilizar los embriones, reemplace el PBS con PBST y coloque los embriones en cuatro grados Celsius con agitación suave durante la noche.Al día siguiente, reemplace el PBST con 600 microlitros de tampón de bloqueo sin tocar los embriones durante una incubación de 16 a 18 horas a cuatro grados centígrados con agitación suave. A la mañana siguiente, reemplace el tampón de bloqueo con 600 microlitros del anticuerpo primario de interés por tubo para una incubación de cuatro a cinco días a cuatro grados centígrados con agitación suave. Al final de la incubación, lave los embriones en un mililitro de PBST durante cuatro a cinco horas con agitación suave a temperatura ambiente cambiando el PBS cada hora, seguido de una incubación nocturna en PBST fresco a cuatro grados centígrados y de cuatro a cinco lavados adicionales de una hora al día siguiente.Después del último lavado, reemplace el PBST en cada tubo con 600 microlitros de la solución de anticuerpos secundaria apropiada para una incubación de cuatro a cinco días a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave los embriones en un mililitro de PBST fresco por lavado como se acaba de demostrar y utilice una pipeta de vidrio para transferir suavemente cada embrión a moldes de parafina de plástico individuales. Retire cuidadosamente cualquier PBST alrededor de cada embrión y oriente cada embrión en una posición sagital.A continuación, agregue rápidamente unos 500 microlitros de agarosa caliente a cada molde hasta que cada embrión esté cubierto y coloque los moldes sobre hielo cubierto con papel de aluminio hasta que la agarosa se haya solidificado. Para la deshidratación de las muestras embrionarias, utilice un bisturí limpio para cortar un bloque de agarosa alrededor de cada embrión y utilice fórceps para agarrar la agarosa para transferirla a un tubo de dos mililitros etiquetado que contenga un mililitro de metanol al 25%. Después de una incubación de una hora con agitación suave en la oscuridad, reemplace 25%metanol con un mililitro de 50%metanol por tubo para una incubación adicional de una hora en la oscuridad.Después del final de la deshidratación, reemplace el 100% metanol por un mililitro de 50%BABB para una incubación de una hora con agitación suave en la oscuridad. Al final de la incubación, reemplace el 50%BABB por un mililitro de 100%BABB por tubo para una incubación de una hora con agitación suave en la oscuridad, seguido de una segunda incubación con 100% BABB como acaba de demostrar. Para montar los embriones para la toma de imágenes, retire el adhesivo de un parachoques de pozo rápido y coloque el parachoques en un cubreobjetos de vidrio de 24 por seis mililitros de 1,5.Aplique una presión suave al adhesivo para eliminar cualquier burbuja de aire entre el cubreobjetos y el parachoques y deseche cuidadosamente el 100% BABB de cada tubo. A continuación, utilice fórceps finos para transferir cuidadosamente el embrión al pozo rápido sin tocar el embrión y colocar un segundo cubreobjetos en el parachoques. Para mostrar el endotelio en todo el tercer arco faríngeo, abra la imagen de interés en el software y haga clic en Añadir nueva superficie.Haga doble clic en la superficie uno y cambie el nombre de la nueva superficie a tercer arco faríngeo. Seleccione Omitir creación automática, editar manualmente y establecer la orientación de la superficie en el plano YZ. Utilice la posición de la rebanada para colocar el tercer plano de superficie del arco faríngeo a donde se conectan la tercera PAA y la aorta dorsal.Gire la imagen para que el tercer plano de superficie del arco faríngeo esté a la vista y desactive la cortadora ortogonal. En el modo de curva de nivel de dibujo, seleccione la función de modo de dibujo de distancia y ajuste la configuración de parámetros según sea necesario. Una vez establecidos todos los parámetros, pulse la tecla Escape y haga clic en Draw para trazar el perímetro del tercer arco faríngeo con el cursor del ratón.A continuación, utilice la posición de la rebanada para mover de 10 a 25 rebanadas y trazar el perímetro del arco faríngeo. Cuando se haya trazado todo el arco, haga clic en crear superficie para generar la superficie de la región trazada. Para enmascarar las estructuras con superficie, en el menú de edición, seleccione la selección de máscara para el tercer PAA y DAPI y haga clic en Aceptar. A continuación, cambie el nombre del nuevo canal como PAA DAPI.Repita este paso para los canales restantes. Para visualizar el plexo endotelial por separado del PAA, seleccione la selección de máscara para el tercer PAA y seleccione DAPI. Desactive seleccionar voxels fuera de la superficie y marque seleccionar voxels dentro de la superficie.Establezca seleccionar vóxeles dentro de la superficie en cero y haga clic en Aceptar. Cambie el nombre del nuevo canal como DAPI que no sea PAA. Repita este paso para los canales restantes. Seleccione la selección de máscara para el tercer PA y seleccione DAPI que no sea PAA y haga clic en Aceptar. Cambie el nombre del nuevo canal como plexus DAPI.Repita este paso para los canales restantes. Para cuantificar las celdas endoteliales individuales dentro de cada estructura de interés, en el panel de ajustes de visualización, desactive todos los canales excepto el canal PAA ERG. En el menú de propiedades, haga clic en Agregar nuevos puntos y haga clic para cambiar el nombre de las manchas de un número total de celdas endoteliales PAA.Haga clic en la flecha azul y seleccione el canal PAA ERG para el canal de origen. Ajuste el diámetro XY estimado a cuatro micrómetros y haga clic en la flecha azul para pasar al siguiente panel. Utilice la escala deslizante para ajustar el número de puntos para asegurarse de que cada núcleo celular endotelial positivo ERG esté representado por un punto.A continuación, haga clic en la flecha doble verde y desactive el canal PAA ERG en el panel de ajuste de la pantalla. Encienda el canal PAA VEGFR2 para visualizar el endotelio PAA y haga clic en editar y agregar/eliminar para seleccionar la superficie del objeto. Luego presione Escape y mantenga presionada la tecla Mayús para eliminar los puntos que no sean VEGFR2 positivos y haga clic en la pestaña de estadísticas para determinar el número total de celdas endoteliales.La inmunofluorescencia de montaje completo produce resultados claros y limpios que permiten la reconstrucción 3D del arco faríngeo endotelio. En esta imagen, la presencia de los grandes puntos brillantes es el resultado de partículas en las soluciones de anticuerpos o tampón de bloqueo. Después de la tinción de superficie de arco faríngeo y PAA, el uso de la función de máscara permite separar visualmente las regiones de superficie y analizarse de forma independiente.El enmascaramiento también permite el análisis individual y la cuantificación de números de células endoteliales dentro de cada estructura. Por ejemplo, aquí se utilizó la entidad de punto para cuantificar el número total de células endoteliales tanto en el PAA como en el plexo asignando un único punto para cada núcleo que expresa el ERG. En esta imagen, se puede observar un punto negativo VEGFR2 positivo ERG que ha sido generado por la función spot.Por lo tanto, es esencial verificar que cada punto reconocido por el software realmente representa una sola célula endotelial. Para obtener imágenes limpias y claras, recuerde girar hacia abajo todas las soluciones y lavar adecuadamente y a fondo cada embrión después de las incubaciones de anticuerpos. Es importante recordar que BABB es corrosivo y tóxico.Manipule y deseche el disolvente correctamente y asegúrese de sellar completamente los embriones derretidos para evitar fugas de BABB.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...