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June 6th, 2020
DOI :
June 6th, 2020
•0:04
Introduction
1:07
Quantification and Oligomerization of Monomeric Biotinylated Protein
3:26
Genetic Screening for Cell Surface Binding
5:13
Bioinformatics Analysis to Identify the Receptor and Related Pathways
6:05
Results: Genetic Screens for the Identification of Cell Surface Binding Partners
7:57
Conclusion
Transcript
वर्तमान में उपलब्ध जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके सेल सतह बातचीत का पता लगाना अभी भी तकनीकी चुनौतियां बन गया है। यह प्रोटोकॉल कोशिका की सतह पर रिसेप्टर लिगांड इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए जीनोम स्केल सेल स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके एक आनुवंशिक विकल्प प्रदान करता है। अधिकांश अन्य मौजूदा तरीकों के विपरीत, यह विधि रिसेप्टर्स के जीव विज्ञान के बारे में कोई अनुमान नहीं लगाती है।
यह कोशिका सतह अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा मध्यस्थता बातचीत की पहचान करने के अवसर प्रदान करता है । कोशिका सतह के अणु सीधे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जैसी दवाओं के लिए सुलभ होते हैं। इसलिए, इन अणुओं द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत की पहचान से महत्वपूर्ण चिकित्सीय निहितार्थ हो सकते हैं ।
यह विधि आम तौर पर सेलुलर सिग्नलिंग और मान्यता प्रक्रियाओं की खोज में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं पर लागू होती है, जिसमें तंत्रिका और प्रतिरक्षात्मक बातचीत के साथ-साथ मेजबान रोगजनक बातचीत शामिल है। प्रोटोकॉल के लिए एक उच्च थ्रूपुट सेल छंटाई मशीन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मशीनों की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले ये सुविधाएं उपलब्ध कराना सुनिश्चित करें।
एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन नमूनों के आठ धारावाहिक कमजोर करने से शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक कमजोर पड़ने की अंतिम मात्रा कम से कम 200 माइक्रोलीटर है और एक टैग-केवल नियंत्रण शामिल है। प्रत्येक कुएं से 100 माइक्रोलीटर निकालकर नमूनों की डुप्लीकेट प्लेट बनाएं और इसे एक नई 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। एक टैग केवल प्रोटीन नियंत्रण है कि सभी बाध्यकारी निबंध में एक नियंत्रण जांच के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा शामिल हैं ।
एक प्लेट में कुओं में ०.१ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के १०० माइक्रोलीटर और दूसरी प्लेट के कुओं में कमजोर पड़ने बफर के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए थाली इनक्यूबेट। इस बीच, स्ट्रेप्टाविडिन एन्कोडेड प्लेट के कुओं को 15 मिनट के लिए कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ ब्लॉक करें।
थाली धोने के बाद यह सुनिश्चित कर लें कि वह सूखा है। फिर दोनों प्लेटों से नमूने की कुल मात्रा को स्ट्रेप्टाविडिन कोडेड प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद प्लेट को वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर से तीन बार धोएं।
माउस एंटी-रैट सीडी4डी3 + 4 आईजीजी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेट को एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। धोरें दोहराएं। एक एंटी-माउस क्षारीय फॉस्फेटे के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेट को एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
फिर कुओं को वॉश बफर के साथ तीन बार धोएं और एक बार कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ। डाई इथेनॉलमाइन बफर में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट तैयार करें और प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन 15 मिनट के बाद, अवशोषण को मापने के प्रत्येक अच्छी तरह से 405 नैनोमीटर पर है।
न्यूनतम कमजोर पड़ने का उपयोग करें जिस पर प्लेट पर कोई संकेत नहीं है, उपयुक्त कमजोर पड़ने के कारक के रूप में टेट्रामर्स बनाने के लिए। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-पीई और उपयुक्त बायोटिनेलेटेड प्रोटीन कमजोर पड़ने। फिर आगे के उपयोग तक चार डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकाश संरक्षित ट्यूब में संयुग्मित प्रोटीन स्टोर करें।
पांच मिनट के लिए 200 बार जी पर इलाज और नियंत्रण नमूनों के साथ शंकु ट्यूबों स्पिन। सुपरनेट को निकालें और बाद में उपयोग के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों में से एक को फ्रीज करें। 1% बीएसए के साथ पीबीएस के 10 मिलीलीटर में अन्य ट्यूब में गोली को फिर से निलंबित करें और 96-अच्छी प्लेट पर नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर को अलग करें।
फिर शंकु नली में और 96-वेल प्लेट में सेल सस्पेंशन में प्री-कंजूस्ड रीकॉम्बिनेंट प्रोटीन जोड़ें। कोमल रोटेशन के साथ एक बेंचटॉप रोटर पर चार डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक घंटे के लिए सेल धुंधला प्रदर्शन करें। इसके बाद पांच मिनट के लिए 200 बार जी पर कोशिकाओं को गोली दें और सुपरनेट निकालें।
कोशिकाओं को दो बार धोने के बाद, उन्हें पीबीएस के पांच मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें। कोशिका समूहों को हटाने के लिए 30 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को तनाव दें। फिर उन्हें एक प्रवाह सोडोर के साथ विश्लेषण करें।
बीएफपी पॉजिटिव और पीई निगेटिव सेल्स के लिए गेट करने के लिए निगेटिव कंट्रोल सैंपल का इस्तेमाल करें। फिर नमूना सॉर्ट करें और 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइजिंग ट्यूब में 500, 000 से 1 मिलियन बीएफपी पॉजिटिव और पीई नकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा करें। गले में पिंजरे प्रोटीन के लिए कोशिकाओं के बाध्यकारी पर निर्भर करेगा, लेकिन आम तौर पर पीई नकारात्मक नमूनों का एक से 5% एकत्र कर रहे हैं ।
अब पांच मिनट के लिए 500 बार जी के लिए अपकेंद्री द्वारा हल कोशिकाओं चलो, तो ध्यान से सुपरनैंट हटा दें। गोली को छह महीने तक शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। संदर्भ पुस्तकालय के लिए unsorted और क्रमबद्ध आबादी से दृश्यों को मैप करने के लिए जादू की गिनती समारोह का उपयोग करें, जो एक कच्ची गिनती फ़ाइल निकलेगा।
नियंत्रण के रूप में अनसोर्ट नियंत्रण नमूने से कच्चे मायने रखता है और उपचार के रूप में हल नमूने से गिनती का उपयोग कर जादू के परीक्षण समारोह चलाएं। उत्पन्न जीन सारांश फ़ाइल खोलें और आरोही क्रम में ठहराव रैंक कॉलम रैंक। फिर बिंदु 0.05 से कम की झूठी खोज दर के साथ हिट की पहचान करें।
रिसेप्टर आमतौर पर उच्च अक्सर पहली स्थिति में स्थान पर है । अंत में सकारात्मक चयन के लिए मजबूत रैंकिंग एल्गोरिदम स्कोर को प्लॉट करने के लिए आर या एक समकक्ष सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। मानव TNFSF9 और पी फाल्सीपेरम या मानव TNFSF9 और पी फाल्सीपेरम Rh5 के बाध्यकारी साथी की पहचान के लिए जीनोम स्केल नॉकडाउन स्क्रीन क्रमशः एनसीआई-SNU-1 और एचईसी-२९३ कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया ।
Rh5 के बाध्यकारी व्यवहार दोनों heparan सल्फेट से प्रभावित था और यह रिसेप्टर BSG जाना जाता है, जबकि टीएन-FRSF-9 अपने ज्ञात रिसेप्टर टीएन-FSF-9 के लिए बाध्यकारी खोना नहीं था । घुलनशील हेपरिन के साथ पूर्व इनक्यूबेशन पर। नियंत्रण उत्परिवर्ती पुस्तकालय में जीएनए वितरण से पता चला है कि प्रयोग के दौरान पुस्तकालय जटिलता को बनाए रखा गया था।
आवश्यक जीन के संदर्भ सेट के वितरण की तुलना में जी-आरएनए के गैर-आवश्यक जीनों के संदर्भ सेट को लक्षित करने के देखे गए गुना परिवर्तनों के वितरण की जांच करके स्क्रीन की तकनीकी गुणवत्ता का आकलन किया गया था । इसके अलावा, पाथवे स्तर संवर्धन से पता चला है कि अपेक्षित आवश्यक रास्तों की पहचान की गई थी और पढ़ाई बीच में छोड़ने वाली आबादी में काफी समृद्ध थे । नियंत्रण नमूने की तुलना मूल प्लाज्मिड लाइब्रेरी से करते समय।
मजबूत रैंक एल्गोरिदम या आरआरए-स्कोर एक उपाय प्रदान करता है जिसमें जी-आरएनए को लगातार उम्मीद से अधिक स्थान दिया जाता है। TNFRSF9 के लिए स्क्रीन में, शीर्ष हिट TNFSF9 था, जो एक ज्ञात बाध्यकारी साथी है । इसके अलावा टीपी53 पाथवे से संबंधित कई जीन की भी पहचान की गई।
RH5 के मामले में, ज्ञात रिसेप्टर के अलावा, और सल्फेटेड परिहास के उत्पादन के लिए आवश्यक जीन, SLC16A1 जीन की भी पहचान की गई थी । स्क्रीनिंग दृष्टिकोण आमतौर पर बहुत मजबूत है और सीधे बातचीत रिसेप्टर अत्यधिक जनसंख्या के इस क्रम में समृद्ध जीन की सूची में स्थान दिया जाना चाहिए । स्क्रीन से प्राप्त हिट को मान्य करना महत्वपूर्ण है।
यदि इंटरैक्शन प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की जाती है, तो बाइनरी प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किए गए जैव रासायनिक दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, आगे सत्यापन अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की निष्पक्ष जीनोम पैमाने की प्रकृति के कारण, हम आशा करते हैं कि यह लिपिड, मल्टीपास झिल्ली प्रोटीन और ग्लाइकन जैसे सेल अणुओं का अध्ययन करने के लिए मुश्किल से मध्यस्थता की गई बातचीत की खोज करने में सहायता करेगा। यह रिसेप्टर तस्करी और जीव विज्ञान के लिए आवश्यक उपन्यास रास्तों को भी प्रकट कर सकता है ।
यह पांडुलिपि बाह्य रिसेप्टर-लिगामेंट इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए जीनोम-स्केल सेल-आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन करती है।
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