13.5K Views
•
08:49 min
•
June 6th, 2020
DOI :
June 6th, 2020
•0:04
Introduction
1:07
Quantification and Oligomerization of Monomeric Biotinylated Protein
3:26
Genetic Screening for Cell Surface Binding
5:13
Bioinformatics Analysis to Identify the Receptor and Related Pathways
6:05
Results: Genetic Screens for the Identification of Cell Surface Binding Partners
7:57
Conclusion
Transcript
Påvisning av celleoverflateinteraksjoner ved hjelp av tilgjengelige biokjemiske tilnærminger utgjør fortsatt tekniske utfordringer. Denne protokollen gir et genetisk alternativ ved hjelp av genom skala celle screening tilnærming for å identifisere reseptor ligand interaksjoner på celleoverflaten. I motsetning til de fleste andre eksisterende metoder, gjør denne metoden ingen antagelser om biologien til reseptorene.
Det gir muligheter til å identifisere interaksjoner mediert av et bredt spekter av celleoverflatemolekyler. Celleoverflatemolekyler er direkte tilgjengelige for legemidler som monoklonale antistoffer. Derfor kan identifisering av interaksjoner mediert av disse molekylene ha viktige terapeutiske implikasjoner.
Denne metoden gjelder generelt for forskere som er interessert i å utforske cellulære signal- og anerkjennelsesprosesser, i et bredt spekter av biologiske sammenhenger, inkludert nevrale og immunologiske interaksjoner samt vertspatogeninteraksjoner. Protokollen krever en høy gjennomstrømningscellesorteringsmaskin og neste generasjons sekvenseringsmaskiner. Kontroller at disse fasilitetene er tilgjengelige før du starter protokollen.
Begynn med å lage åtte seriefortynninger av biotinylertproteinprøver i en 96-brønns plate som sikrer at det endelige volumet av hver fortynning er minst 200 mikroliter og at en tag-only-kontroll er inkludert. Lag en duplisert plate av prøvene ved å fjerne 100 mikroliter fra hver brønn og overføre den til en ny 96-brønnsplate. Inkluder en proteinkontroll kun for tagger som skal brukes som en kontrollsonde i alle bindende essays.
Tilsett 100 mikroliter på 0,1 mikrogram per milliliter streptavidin-PE til brønnene i en av platene, og 100 mikroliter fortynningsbuffer til brønnene på den andre platen. Inkuber platen i 20 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden blokkerer brønnene på streptavidin kodet plate med fortynningsbufferen i 15 minutter.
Etter vask av platen, sørg for at den er tørr. Deretter overfører du det totale volumet av prøven fra begge platene til individuelle brønner av streptavidin kodet plate og inkubere den i en time ved romtemperatur. Etter inkubasjonen, vask platen tre ganger med 200 mikroliter vaskebuffer.
Tilsett 100 mikroliter mus anti-rotte Cd4d3 +4 IgG Og inkuber platen i en time. Gjenta vaskene. Tilsett 100 mikroliter av en anti-mus alkalisk fosfatase konjugat og la platen ved romtemperatur i en time.
Vask deretter brønnene tre ganger med vaskebuffer og en gang med fortynningsbuffer. Forbered p-nitrophenylfosfat på ett milligram per milliliter i fargeetanolaminbuffer og tilsett 100 mikroliter til hver brønn. Etter en 15 minutters inkubasjon, måle absorbansen har hver brønn på 405 nanometer.
Bruk minimum fortynning der det ikke er noe signal på platen som riktig fortynningsfaktor for å lage tetramers. Inkuber streptavidin-PE og riktig biotinylert proteinfortynning i 30 minutter ved romtemperatur. Oppbevar deretter konjugerte proteiner i et lett beskyttet rør ved fire grader Celsius til videre bruk.
Spinn de koniske rørene med de behandlede og kontroller prøvene ved 200 ganger G i fem minutter. Fjern det overnaturlige og frys et av rørene ved minus 20 grader Celsius for senere bruk. Re-suspendere pellet i det andre røret i 10 milliliter PBS med 1% BSA og sette av 100 mikroliter celler som en negativ kontroll på en 96-brønns plate.
Tilsett deretter det forhåndskonjugerte rekombinante proteinet til cellesuspensjonen i konisk rør og i 96-brønnplaten. Utfør cellefarging i minst en time ved fire grader Celsius på en benkeplaterotor med mild rotasjon. Deretter pellet cellene ved 200 ganger G i fem minutter og fjern supernatanten.
Etter å ha vasket cellene to ganger, re-suspendere dem i fem milliliter pbs. Sil cellene gjennom en 30 mikrometersil for å fjerne celleklynger. Analyser dem deretter med en flyt Sodor.
Bruk den negative kontrollprøven til gate for BFP positive og PE negative celler. Sorter deretter prøven og samle 500,000 til 1 million BFP positive og PE negative celler i en 1,5 milliliter sentrifugering tube. Det såre buret vil avhenge av bindingen av cellene til proteinet, men normalt samles en til 5% av PE negative prøver.
La nå de sorterte cellene ved sentrifugering i 500 ganger G i fem minutter, og fjern deretter overnaturanten forsiktig. Pelleten kan lagres ved minus 20 grader Celsius i opptil seks måneder. Bruk funksjonen for telling av magi til å kartlegge sekvenser fra den usorterte og sorterte populasjonen til referansebiblioteket, som vil gi en rå tellingsfil.
Kjør testfunksjonen til magi ved hjelp av rå tellinger fra den usorterte kontrollprøven som kontroll og tellingene fra den sorterte prøven som behandling. Åpne den genererte gensammendragsfilen, og ranger kolonnen for pauserangering i stigende rekkefølge. Deretter identifisere treff med en falsk oppdagelsesfrekvens på mindre enn punkt 0,05.
Reseptoren er vanligvis rangert høyt ofte i første posisjon. Til slutt bruker du R eller en tilsvarende programvare for å plotte den robuste rangeringsalgoritmen score for positivt utvalg. Genom skala knockdown skjermer for identifisering av bindende partner av menneskeligE TNFSF9 og P falciparum eller H5 av human tnfsf9 og P falciparum Rh5 ble utført i NCI-SNU-1 og HEC-293 celler henholdsvis.
Den bindende oppførselen til Rh5 ble påvirket av både heparansulfat og det er kjent reseptor BSG mens TN-FRSF-9 ikke mistet bindingen til sin kjente reseptor TN-FSF-9. Ved pre-inkubasjon med løselig heparin. GNA-distribusjonen i kontrollmutantbiblioteket viste at bibliotekkompleksiteten ble opprettholdt i løpet av eksperimentet.
Den tekniske kvaliteten på skjermene ble vurdert ved å undersøke fordelingen av observerte foldeendringer av G-RNA rettet mot et referansesett med ikke-essensielle gener, sammenlignet med fordelingen for et referansesett av essensielle gener. I tillegg viste veinivåberikelse at forventede viktige veier ble identifisert og betydelig beriket i frafallet. Når du sammenligner kontrolleksempelet med det opprinnelige plasmidbiblioteket.
Den robuste rangeringsalgoritmen eller RRA-poengsummen gir et mål på hvilke G-RNA-er som konsekvent rangeres høyere enn forventet. På skjermen for TNFRSF9 var topp treffet TNFSF9, som er en kjent bindingspartner. I tillegg ble det også identifisert en rekke gener relatert til TP53-banen.
I tilfelle av RH5, i tillegg til den kjente reseptoren, og genet som kreves for produksjon av sulfaterte gags, ble SLC16A1 genet også identifisert. Screeningtilnærmingen er vanligvis svært robust, og den direkte interagerende reseptoren bør rangeres høyt på listen over gener beriket i denne rekkefølgen av befolkningen. Det er avgjørende å validere treff innhentet fra skjermen.
Hvis samspillet er mediert av proteiner, biokjemiske tilnærminger designet for å studere binære Protein Protein interaksjoner, for eksempel, kan brukes til videre validering studier. På grunn av den objektive genomskalaen til denne tilnærmingen, forventer vi at det vil hjelpe til med å utforske interaksjonene mediert av vanskelige å studere cellemolekyler som lipider, multipassmembranproteiner og glykaner. Det kan også avsløre nye veier som kreves for reseptorhandel og biologi.
Dette manuskriptet beskriver en genom-skala celle-basert screening tilnærming for å identifisere ekstracellulære reseptor-ligand interaksjoner.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved