13.5K Views
•
08:49 min
•
June 6th, 2020
DOI :
June 6th, 2020
•0:04
Introduction
1:07
Quantification and Oligomerization of Monomeric Biotinylated Protein
3:26
Genetic Screening for Cell Surface Binding
5:13
Bioinformatics Analysis to Identify the Receptor and Related Pathways
6:05
Results: Genetic Screens for the Identification of Cell Surface Binding Partners
7:57
Conclusion
Transcript
Detektion av cellytans interaktioner med hjälp av för närvarande tillgängliga biokemiska metoder innebär fortfarande tekniska utmaningar. Detta protokoll ger ett genetiskt alternativ med hjälp av genomet skala cell screening strategi för att identifiera receptor ligand interaktioner på cellytan. Till skillnad från de flesta andra befintliga metoder, gör denna metod inga antaganden angående biologin hos receptorerna.
Det ger möjligheter att identifiera de interaktioner som förmedlas av ett brett spektrum av cellytan molekyler. Cellytans molekyler är direkt åtkomliga för läkemedel som monoklonala antikroppar. Därför kan identifiering av interaktioner medierad av dessa molekyler har viktiga terapeutiska konsekvenser.
Denna metod är i allmänhet tillämplig på forskare som är intresserade av att utforska cellulära signalering och erkännande processer är i ett brett spektrum av biologiska sammanhang, inklusive neurala och immunologiska interaktioner samt värd patogen interaktioner. Protokollet kräver en cellsorteringsmaskin med hög genomströmning och nästa generations sekvenseringsmaskiner. Se till att dessa anläggningar är tillgängliga innan protokollet startas.
Börja med att göra åtta serieutspädningar av de biotinylerade proteinproverna i en 96-brunnsplatta som säkerställer att den slutliga volymen för varje utspädning är minst 200 mikroliter och att en kontroll med endast taggar ingår. Gör en dubblettplatta av proverna genom att ta bort 100 mikroliter från varje brunn och överför den till en ny 96-brunnsplatta. Inkludera en tagg-bara proteinkontroll som kommer att användas som en kontroll sond i alla bindande uppsatser.
Tillsätt 100 mikroliter på 0,1 mikrogram per milliliter streptavidin-PE till brunnarna i en av plattorna, och 100 mikroliter av utspädningsbuffert till brunnarna i den andra plattan. Inkubera plattan i 20 minuter i rumstemperatur. Under tiden blockera brunnarna i streptavidin kodad platta med utspädningsbufferten i 15 minuter.
Efter tvätt av plattan, se till att den är torr. Överför sedan provets totala volym från båda plattorna till enskilda brunnar av streptavidinkodad platta och inkubera det i en timme vid rumstemperatur. Efter inkubationen, tvätta plattan tre gånger med 200 mikroliter av tvättbuffert.
Tillsätt 100 mikroliter av mus anti-råtta Cd4d3+4 IgG Och inkubera plattan i ytterligare en timme. Upprepa tvättar. Tillsätt 100 mikroliter av en anti-mus alkalisk fosfatas konjugat och lämna plattan i rumstemperatur i en timme.
Tvätta sedan brunnarna tre gånger med tvättbuffert och en gång med utspädningsbuffert. Förbered p-nitrofenylfosfat på ett milligram per milliliter i dye etanolamin buffert och tillsätt 100 mikroliter till varje brunn. Efter en 15 minuters inkubation, mät absorbansen har varje brunn vid 405 nanometer.
Använd den minsta utspädning vid vilken det inte finns någon signal på plattan som lämplig spädningsfaktor för att skapa tetramerer. Inkubera streptavidin-PE och lämplig biotinylerad proteinutspädning under 30 minuter vid rumstemperatur. Förvara sedan konjugerade proteiner i ett lätt skyddat rör vid fyra grader Celsius tills vidare används.
Snurra de koniska rören med de behandlade och kontrollproverna vid 200 gånger G i fem minuter. Ta bort supernatanten och frys ett av rören vid minus 20 grader Celsius för senare användning. Åter upphäva pelleten i det andra röret i 10 milliliter PBS med 1%BSA och avsätta 100 mikroliter celler som en negativ kontroll på en 96-brunnsplatta.
Tillsätt sedan det förkonjugerade rekombinanta proteinet till cellupphängningen i koniska röret och i 96-brunnsplattan. Utför cellfärgning i minst en timme vid fyra grader Celsius på en bänkskivasrotor med varsam rotation. Pelleta sedan cellerna vid 200 gånger G i fem minuter och ta bort supernatanten.
Efter tvättning av cellerna två gånger, åter avbryta dem i fem milliliter PBS. Sila cellerna genom en 30 mikrometer sil för att ta bort cellkluster. Analysera dem sedan med ett flöde Sodor.
Använd det negativa kontrollprovet för att gate för BFP positiva och PE negativa celler. Sortera sedan provet och samla in 500, 000 till 1 miljon BFP positiva och PE negativa celler i en 1,5 milliliter centrifuger röret. Den ömma buren kommer att bero på bindningen av cellerna till proteinet, men normalt en till 5%av PE negativa prover samlas in.
Låt nu de sorterade cellerna genom att centrifugera i 500 gånger G i fem minuter och ta sedan försiktigt bort supernatanten. Pelleten kan förvaras vid minus 20 grader Celsius i upp till sex månader. Använd räkningsfunktionen av magi för att mappa sekvenser från den osorterade och sorterade populationen till referensbiblioteket, vilket kommer att ge en obehandlad räkningsfil.
Kör testfunktionen av magi med hjälp av råa räknas från osorterade kontrollprov som kontroll och räknarna från sorterade provet som behandling. Öppna den genererade gensammanfattningsfilen och rangordna kolumnen pausrankning i stigande ordning. Identifiera sedan träffar med en falsk identifieringsfrekvens på mindre än punkt 0.05.
Receptorn är oftast rankas högt ofta i första positionen. Slutligen använda R eller en likvärdig programvara för att rita den robusta ranking algoritm poäng för positivt urval. Genom skala knockdown skärmar för identifiering av bindande partner av mänskliga TNFSF9 och P falciparum eller H5 av mänskliga TNFSF9 och P falciparum Rh5 utfördes i NCI-SNU-1 och HEC-293 celler respektive.
Bindning beteende Rh5 påverkades av både heparansulfat och det är känt receptor BSG medan TN-FRSF-9 inte förlora bindande för sin kända receptor TN-FSF-9. Vid förinkubation med lösligt heparin. GNA-distributionen i kontrollmutsabiblioteket visade att bibliotekskomplexiteten upprätthölls under hela experimentet.
Skärmarnas tekniska kvalitet bedömdes genom att man undersökte fördelningen av observerade vikförändringar av G-RNA:s inriktning på en referensuppsättning icke-väsentliga gener, jämfört med fördelningen för en referensuppsättning av väsentliga gener. Dessutom visade spridning på utbildningsavsnitt att förväntade viktiga vägar identifierades och berikades avsevärt i avhoppspopulationen. Vid jämförelse av kontrollprovet med det ursprungliga biblioteket i Plasmid.
Den robusta rankningsalgoritmen eller RRA-score ger ett mått på vilka G-RNA är genomgående rankade högre än förväntat. I skärmen för TNFRSF9, var den översta träffen TNFSF9, som är en känd bindande partner. Dessutom identifierades också ett antal gener relaterade till TP53-vägen.
I fallet med RH5, utöver den kända receptorn, och den gen som krävs för produktion av sulfated gags, var SLC16A1 genen också identifieras. Screeningmetoden är vanligtvis mycket robust och den direkt interagerande receptorn bör vara högt rankad på listan över gener som berikas i denna ordning av befolkningen. Det är avgörande att validera de träffar som erhållits från skärmen.
Om interaktionen medieras av proteiner, biokemiska metoder för att studera binära Protein Protein interaktioner, till exempel, skulle kunna användas för ytterligare validering studier. På grund av den opartiska arvsmassan karaktär av detta tillvägagångssätt, vi räknar med att det kommer att bidra till att utforska de interaktioner som förmedlas av svåra att studera cellmolekyler såsom lipider, multipass membranproteiner och glyk. Det kan också avslöja nya vägar som krävs för receptorhandel och biologi.
Detta manuskript beskriver en genomskala cell-baserade screening metod för att identifiera extracellulära receptor-ligand interaktioner.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved