Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Исследование было поддержано фондами Калифорнийского университета в Дэвисе, Центра здоровья животных (CCAH 2018-30-F). Авторы хотели бы отметить д-р Кевин Вулард для использования флуоресценции микроскопа.

Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. Некропсии и биопсии тканей проводились с согласия владельцев.
1. Фиксация тканей...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Мы описываем протокол для выявления NETs в фиксированной кошачьей кардиогенных тромбов с помощью двойного протокола иммуномаркировки и иммунофлуоресценции микроскопии. Хотя только кардиогенные артериальные тромбы были окрашены, в теории этот протокол может быть использован для други...

Кошки с гипертрофической кардиомиопатией подвергаются риску опасных для жизни тромбоэмболических осложнений1,,2. Несмотря на высокую заболеваемость и смертность, связанные с кошачьей кардиогенной тромбоэмболией (КАТЭ), лежащая в основе патофизиология CATE у кошек плохо понимается. Есть также ограниченные диагностические и терапевтические инструменты для лечения и выявления кошек, подверженных риску этого разрушительного состояния3.
В дополнение к своей роли в врожденном иммунитете, нейтрофилы, как было показано, играют роль в тромбозе, выпустив нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), которые веб-подобных сетей клеточной ДНК (cfDNA) инкрустированы гистонами и гранулированных белков, как нейтрофил эластазы (NE) и миелопероксиды. Нейтрофилы проходят образование NET в ответ на системное воспаление, прямое столкновение с патогенными микроорганизмами, а также взаимодействие с активированными тромбоцитами4,,55,6,,7. У собак днк, полученная из нейтрофилов, подавляет лизис тромбов, в то время как протеины NET ускоряют образование тромбов. Способность NETs улавливать циркулирующие клетки и компоненты коагуляции также является ключом к их тромбогенным свойствам8,,9,,10,,11,,12.
NET обнаруживаются путем колокализации внеклеточных нейтрофильных белков, гистонов и cfDNA. Из-за этого, выявление и количественное определение NETs в фиксированных тканях иммунофлуоресценции депарафинизированных тканей превосходит традиционные гематоксилин и эозин (H и E) пятно с использованием яркой микроскопии поля4,5. Несколько человеческих исследований с использованием иммунофлуоресценционной микроскопии определили NETs как структурные компоненты коронарных артериальных тромбов, тромбов мозгового инсульта, атеротромбоза и венозной тромбы13,14,16,,17.17 На сегодняшний день не описан стандартизированный метод выявления и количественной оценки NET в кошачьих тромби. Поскольку выявление NET s в кошачьих кардиогенных артериальных тромбов может облегчить будущие трансляционные исследования в NETs и тромбоз, мы описываем методы net идентификации и оценки в парафинавстроенных артериальных тромбов у кошек.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), состоящий из клеточной ДНК (cfDNA) и белков, как гистоны и нейтрофил эластаза (NE), высвобождаются нейтрофилов в ответ на системное воспаление или патогенов. Хотя ранее было показано, что NETs увеличивают образование тромбов и подавляют фибринолиз у людей и собак, роль NETs у кошек с кардиогенной артериальной тромбоэмболией (CATE), опасным для жизни осложнением, вторичным по отношению к гипертрофической кардиомиопатии , неизвестно. Стандартизированный метод для выявления и количественной оценки NET в кардиогенных артериальных тромбов у кошек будет способствовать нашему пониманию их патологической роли в CATE. Здесь мы описываем метод выявления NETs в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных тромбо в аортальной бифуркации, извлеченные во время некропсии. После депарафинизации с ксиленом, аортальные секции прошли непрямой тепло-индуцированного антигена поиска. Разделы были затем заблокированы, permeabilized, и ex vivo NETs были определены путем coлокализации клеточной ДНК (cfDNA), цитруллинированный гистон H3 (citH3), и нейтрофил elastase (NE) с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Для оптимизации иммунообнаружения NETвов в тромби, аутофлуоресценция элементов ткани была ограничена с помощью процесса закалки аутофлюоресценции до микроскопии. Этот метод может быть полезным инструментом для изучения NETs и тромбоза в других видах и предлагает новые идеи в патофизиологии этого сложного состояния.

Используя этот протокол для депарафинизации, теплового антигена поиска, и двойной иммуномаркировки парафина встроенных тромбов, мы определили NETs в кошачьих CATE в первый раз. Тромби в аортальной бифуркации были обнаружены флуоресценцией микроскопии и яркой полевой микроскопией с испол...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Мы описываем метод выявления нейтрофилов внеклеточных ловушек (NETs) в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных кошачьих кардиогенных артериальных тромбов с использованием тепло-индуцированного антигена поиска и двойной иммуномаркировки протокола.

Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Этот протокол парафинизации с последующим поиском антигена парафин-встроенных аортальных секций может быть полезным инструментом для изучения роли нейтрофиловых трехклеточных ловушек в кошачьем тромбозе. Обнаружение нейтрофиловых трехклеточных ловушек путем иммунофторесценции в фиксированной и парафиновой ткани превосходит обычные гистологические стенты, такие как HNE, так как позволяет одновременно обнаруживать более безопасную ДНК и внеклеточные белки. Этот протокол может быть использован в других типах тромбов и в других ветеринарных видов.Выявление нейтрофиловых внеклеточных ловушек в кошачьих артериальных тромбах позволяет предположить, что они могут играть определенную роль в тромбозе у кошек. Протоколы, представленные здесь, являются руководящими принципами. Мы настоятельно рекомендуем следователям скорректировать продолжительность и условия процесса поиска антигена, чтобы дать удовлетворительный сигнал.Для использования автоматизированной системы для выполнения депарафинизации и регидратации секций на стеклянных горках поместите стеклянные горки в стеллажи. Погрузите полностью в 100 процентов солевой раствор в течение трех минут. Повторите этот шаг дважды.Не смойте между ступенями. Погрузиться полностью в снижение концентрации этанола при комнатной температуре три раза в течение трех минут каждый. Полностью погрузиться в деионизированную воду на две минуты и повторить еще раз.После лечения TBST, заполнить резервуар с деионизированной водой нагревается до 100 градусов по Цельсию. Разрешить пароход камеры для equilibrate в течение 20 минут. На тепловой плите нагрейте коммерчески доступный антигенный раствор, содержащий Tris и EDTA при рН от 9,0 до 95 до 97 градусов по Цельсию.Убедитесь, что он не кипит. Suberge слайды полностью в подогревом антиген поиска раствора и продолжить применение внешнего отопления через пароход в течение 20 минут. Затем трижды мыть горки с помощью TBST в течение пяти минут.Теперь поместите разделы в блокирующий буфер 1. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре при нежном раскачивание между 30 и 50 об/мин. Без стирки немедленно нанесите 100 микролитров разбавленного кролика на поликлональный анти-человеческий цитруллинированный гистон H3 антитела непосредственно на слайд.Поместите крышку скольжения на каждом разделе, чтобы обеспечить равномерное распределение смеси антител. Инкубировать в течение 12 до 16 часов при четырех градусах по Цельсию с нежным качания. После этого, мыть слайды три раза с TBST в течение пяти минут каждый раз.Чтобы применить антитела, используйте пипетку и равномерно распределите 100 микролитров козьего анти-кроличьего антитела, спряженного с Alexa Fluor 488. Обложка слайды с фольгой и инкубировать слайды в течение одного часа при комнатной температуре под нежным качания. После мытья с TBST в соответствии с рукописью, инкубировать разделы в блокировании буфера 2 ночь при четырех градусах по Цельсию под нежным качания.Защитите от света. Мыть с TBST три раза в течение пяти минут каждый раз. Блокируйте секции в блокировании буфера 3, как это было сделано ранее при комнатной температуре в течение двух часов под нежным раскачивание.Инкубировать разделы с биотином laded ployclonal кролика анти-человеческого нейтрофила эластазы антитела на четыре градуса по Цельсию в течение 12 до 16 часов, как описано ранее. После мытья с TBST инкубировать слайды с Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate в течение одного часа при комнатной температуре. После этого, мыть с TBST один раз в течение пяти минут.Нанесите 100 микролитров смеси раствора Autofluorescense непосредственно на секции в течение одной минуты по указанию производителя. Немедленно мыть горки с TBST шесть раз в течение 10 минут каждый раз. Обложка каждого слайда с 100 микролитров 300 наномолярных DAPI в течение пяти минут в темноте.Затем мыть с TBST пять раз в течение трех минут каждый раз. Нанесите каплю антифадной крепления среды прямо на стеклянную горку, окружающую секцию. Поместите крышку скольжения мягко на раздел, не создавая никаких пузырьков.Разрешить образцы для лечения в ночное время в темноте при четырех градусах по Цельсию. Чтобы найти тромби, сканирование черепно caudally по длине аорты, аортальной бифуркации и каждой фемеральной артерии с помощью фазовой контрастной микроскопии с 10x цели. Сначала изучите разделы для клеточной ДНК с помощью канала DAPI с возбуждением на 357 и 44 нанометров.Определите внеклеточную нейтрофиловую эластазу и цитруллинированный гистон H3 на техасских красных и зеленых флуоресцентных белковых каналах соответственно. Поддержание последовательного времени экспозиции и прибыли каждого канала на протяжении всего приобретения изображений, чтобы избежать насыщения интенсивностью пикселей. Нейтрофиловые внеклеточные ловушки идентифицируются на основе совместной локализации нейтрофиловой эластазы, цитруллинированного гистона H3 и клеточной ДНК.Используя гематоксилин и эозин пятно, а также яркую микроскопию, кошачьи артериальные тромбы состоят из красных кровяных телец, лейкоцитов, фибрина и тромбоцитов. NETs появились как сети темно-фиолетовых нитей различной длины, окружающих близлежащие эритроциты и лейкоциты. Используя этот протокол, микроскопия иммунофлюоресценции выявила большие агрегаты NETs, состоящие из клеточной ДНК, внеклеточной цитруллинированной гистона H3 и нейтрофиловой эластазы.При фазовом контрасте в иммунной микроскопии тромб характеризовался как хорошо разграниченое строение в сосудистом пространстве. Тем не менее, тромби не были обнаружены ни в одном из контрольных образцов. Эта цифра демонстрирует глубокую аутофторесценцию элементов сгустка, таких как эритроциты, когда изображены на длине волны 488 нанометров.Краткое затухание аутофторенсии после иммунолабеллинга значительно повышает чувствительность коализализации белка и обнаружения NET даже в районах с обилием эритроцитов. Длительность фиксации влияет на иммунореактивность некоторых антигенов. Мы рекомендуем фиксации в течение не более 24 часов номинальной обезвоживания и парафина встраивания.Кроме того, параформальдегид без метанола может быть использован для ограничения артефакта фирмической кислотой и кетонами от окисления формальдегида. Чтобы предотвратить помехи при использовании первичных антител, происходящих из одного и того же вида, мы включили дополнительный блокирующий шаг, чтобы насытить все оставшиеся связывающие участки вторичными антителами. Исследователи должны включать негативный контроль, состоящий из изотипных антител, исключение либо первичных антител и иммуно-маркировки шаг и биологический контроль от кошек без тромбоза.Аутофлюоресценция пределов тканей тромби может забить микроскопическую идентификацию нейтрофиловых внеклеточных ловушек. Следователь может свести к минимуму флуоресценцию с помощью далеко-красных флюорофоров. Этот метод может быть ценным инструментом для изучения нейтрофиловых внеклеточных ловушек у других ветеринарных видов.Это может обеспечить лучшее понимание патофизиологии тромбоза.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

В Ситу обнаружения бактерий внутри парафин тканей с использованием дигоксина меченных ДНК зонд таргетинга 16S рРНК

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

В пробирке Формирование собак нейтрофилов внеклеточного ловушка: Динамические и количественный анализ по микроскопии флуоресцирования

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Морфологический и композиционный анализ внеклеточных ловушек нейтрофилов, индуцированных микробными и химическими раздражителями

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...