Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Los autores quieren reconocer al Dr. Kevin Woolard por el uso del microscopio de fluorescencia.

Todos los métodos descritos aquí se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis. Las necropsias y biopsias de tejidos se realizaron con el consentimiento de los propietarios.
1. Fijación de tejidos, incrustación y seccionamiento
<ol><li>Diseccionar la bifurcación aórtica, incluyendo la aorta descendente, la arteria femoral y las arterias ilíacas comunes(Figura 1A),...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Describimos un protocolo para identificar NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos fijos utilizando un protocolo de doble inmunoetiquetado y una microscopía de inmunofluorescencia. Aunque sólo se tiñó el trombo arterial cardiogénico, en teoría este protocolo podría utilizarse para otros tipos de trombos y en otras especies veterinarias. La identificación de NETs dentro de trombos arteriales felinos sugiere que los NET pueden desempeñar un papel en la trombosis en gatos.
La de...

Los gatos con miocardiopatía hipertrófica corren el riesgo de sufrir complicaciones tromboembólicas potencialmente mortales1,2. A pesar de la alta morbilidad y mortalidad asociada s con el tromboembolismo arterial cardiogénico felino (CATE), la fisiopatología subyacente del CATE en gatos se entiende mal. También hay herramientas diagnósticas y terapéuticas limitadas para tratar e identificar gatos en riesgo de esta devastadora condición3.
Además de su papel en la inmunidad innata, se ha demostrado que los neutrófilos desempeñan un papel en la trombosis mediante la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son redes similares a redes de ADN libre de células (CFDNA) incrustadas con histonas y proteínas granulares como la elastasa de neutrófilos (NE) y la mieloperoxidasa. Los neutrófilos se someten a la formación de NETs en respuesta a la inflamación sistémica, el encuentro directo con patógenos y la interacción con las plaquetas activadas4,5,6,7. En perros, se ha demostrado que el ADN derivado de neutrófilos inhibe la lisis de coágulos, mientras que las proteínas NET aceleran la formación de coágulos. La capacidad de los NETs para atrapar células circulantes y componentes de coagulación también es clave para sus propiedades trombogénicas8,9,10,11,12.
Los NET se detectan mediante la colocación de proteínas neutrófilas extracelulares, histonas y ADNr. Debido a esto, la identificación y cuantificación de neTs en tejidos fijos por inmunofluorescencia de tejidos desparafinados es superior a la hematoxilina tradicional y la mancha de eosina (H&E) utilizando la microscopía de campo brillante4,5. Varios estudios en humanos con microscopía de inmunofluorescencia identificaron las NET como componentes estructurales de trombos arteriales coronarios, trombos cerebral, aterombosis y trombosa venosa13,,14,,15,,16,,17. Hasta la fecha, no se ha descrito un método estandarizado para detectar y cuantificar NETs en trombos felinos. Debido a que la identificación de NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos puede facilitar futuras investigaciones traslacionales en NETys y trombosis, describimos técnicas de identificación y evaluación de LA RED en trombos arteriales incrustados en parafina en gatos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), compuestas de ADN libre de células (CFDNA) y proteínas como histonas y neutrófilos elastasa (NE), son liberadas por neutrófilos en respuesta a inflamación sistémica o patógenos. Aunque anteriormente se ha demostrado que los NET aumentan la formación de coágulos e inhiben la fibrinólisis en humanos y perros, el papel de las NET en gatos con tromboembolismo arterial cardiogénico (CATE), una complicación potencialmente mortal secundaria a la cardiomiopatía hipertrófica , es desconocido. Un método estandarizado para identificar y cuantificar los NETen s en trombos arteriales cardiogénicos en gatos hará avanzar nuestra comprensión de su papel patológico en CATE. Aquí, describimos una técnica para identificar NETs en trombos fijas y incrustadas en parafina dentro de la bifurcación aórtica, extraídas durante la necropsia. Después de la desfinación con xileno, las secciones aórticas se sometieron a una recuperación indirecta de antígenoininina inducido por calor. Las secciones fueron bloqueadas, permeabilizadas y ex vivo NETs fueron identificadas por la colocalización de ADN libre de células (cfDNA), histona citrulinated H3 (citH3), y elastasa de neutrófilos (NE) utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Para optimizar la inmunodetección de NETs en trombos, la autofluorescencia de los elementos tisulares se limitó mediante el uso de un proceso de enfriamiento de autofluorescencia antes de la microscopía. Esta técnica podría ser una herramienta útil para estudiar NETs y trombosis en otras especies y ofrece nuevas perspectivas sobre la fisiopatología de esta condición compleja.

Usando este protocolo para la desfinación, la recuperación de antígenos inducidos por calor y la doble inmunoetiquetado de trombos incrustados en parafina, identificamos neTs en CATE felino por primera vez. Los trombos dentro de la bifurcación aórtica se localizaban mediante microscopía de fluorescencia y microscopía de campo brillante utilizando tinción estándar de H&E y microscopía de contraste de fase. En la microscopía de campo brillante, los trombos arteriales felinos consistían en glóbulos rojos, leuco...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Describimos un método para identificar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en trombos arteriales cardiogénicas felinos finos fijos fijos fijos y con parafina incorporados de formaldehído mediante la recuperación de antígenos inducidos por calor y un protocolo de doble inmunoetiquetado.

Identificación de trampas extracelulares de neutrófilos en tromba arterial felino incrustada en parafina mediante microscopía de inmunofluorescencia

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Este protocolo de la parafinización seguido de la recuperación de antígenos de secciones aórticas incrustadas en parafina puede ser una herramienta útil para estudiar el papel de las trampas tricelulares neutrófilas en la trombosis felina. La detección de trampas tricelulares neutrófilas por inmunofluorescencia en tejido fijo e incrustado en parafina, es superior a los stents histológicos convencionales como HNE, ya que permite la detección simultánea de ADN más seguro y proteínas extracelulares. Este protocolo se puede utilizar en otro tipo de trombos y en otras especies veterinarias.La identificación de trampas extracelulares de neutrófilos dentro de trombos arteriales felinos sugiere que pueden desempeñar un papel en la trombosis en gatos. Los protocolos presentados aquí son directrices. Recomendamos encarecidamente a los investigadores que ajusten la duración y las condiciones del proceso de recuperación de antígenos para producir una señal satisfactoria.Para utilizar un sistema automatizado para realizar la desparafinanciación y la rehidratación de las secciones en los portaobjetos de vidrio, coloque los portaobjetos de vidrio en bastidores. Sumérgete completamente en solución salina al 100 por ciento durante tres minutos. Repita este paso dos veces.No enjuague entre pasos. Sumérgete completamente en concentraciones de disminución de etanol a temperatura ambiente tres veces durante tres minutos cada una. Sumérgete completamente en agua desionizada durante dos minutos y repite una vez más.Después del tratamiento con TBST, llene el depósito con agua desionizada calentada a 100 grados centígrados. Deje que la cámara del vapor se equilibre durante 20 minutos. En una placa de calor, caliente la solución de recuperación de antígenos disponible comercialmente que contiene Tris y EDTA a pH 9.0 a 95 a 97 grados Celsius.Asegúrese de que no hierva. Suberge los portaobjetos completamente en la solución de recuperación de antígenos calentados y continuar la aplicación de calefacción externa a través del vapor durante 20 minutos. A continuación, lave los portaobjetos tres veces con TBST durante cinco minutos.Ahora, coloque las secciones en el búfer de bloqueo 1. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente bajo un suave balanceo entre 30 y 50 rpm. Sin lavado, aplique inmediatamente 100 microlitros de anticuerpos de histona citrulinado citrulinado policlonal diluido de conejo directamente sobre el portaobjetos H3 en el portaobjetos.Coloque un resbalón de cubierta en cada sección para permitir una distribución uniforme de la mezcla de anticuerpos. Incubar durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados con un suave balanceo. Después de eso, lave los portaobjetos tres veces con TBST durante cinco minutos cada vez.Para aplicar anticuerpos, utilice una pipeta y distribuya uniformemente 100 microlitros de anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con Alexa Fluor 488. Cubra los portaobjetos con papel de aluminio e incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente bajo un suave balanceo. Después de lavar con TBST según el manuscrito, incubar las secciones en el tampón de bloqueo 2 durante la noche a cuatro grados centígrados bajo suave balanceo.Protéjase de la luz. Lavar con TBST tres veces durante cinco minutos cada vez. Bloquee las secciones en el tampón de bloqueo 3 como se hizo anteriormente a temperatura ambiente durante dos horas bajo un suave balanceo.Incubar las secciones con anticuerpos de elastasa anti-humano de conejo con cuñalo con la biotina a cuatro grados Celsius durante 12 a 16 horas como se describió anteriormente. Después de lavar con TBST incubar los toboganes con Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate durante una hora a temperatura ambiente. Después de eso, lavar con TBST una vez durante cinco minutos.Aplique 100 microlitros de la mezcla de solución Autofluorescense Quenching directamente en las secciones durante un minuto según las instrucciones del fabricante. Lave inmediatamente los portaobjetos con TBST seis veces durante 10 minutos cada vez. Cubra cada diapositiva con 100 microlitros de 300 DAPI nanomolares durante cinco minutos en la oscuridad.A continuación, lave con TBST cinco veces durante tres minutos cada vez. Aplique una gota de medio de montaje antifada directamente sobre el portaobjetos de vidrio que rodea la sección. Coloque un resbalón de cubierta suavemente sobre la sección sin crear burbujas.Deje que las muestras se curen durante la noche en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Para localizar el trombo, escanee cránidamente a caudalmente a lo largo de la longitud de la aorta, la bifurcación aórtica y cada arteria femeral utilizando microscopía de contraste de fase con un objetivo de 10x. En primer lugar, examine las secciones en busca de ADN libre de células utilizando el canal DAPI con la excitación a 357 y 44 nanómetros.Identificar la elastasa de neutrófilos extracelulares y la histona citrulinada H3 en los canales de proteína fluorescente roja y verde de Texas respectivamente. Mantenga un tiempo de exposición y ganancias constantes de cada canal a lo largo de la adquisición de imágenes para evitar la saturación en la intensidad de píxeles. Las trampas extracelulares de neutrófilos se identifican en base a la co-localización de la elastasa de neutrófilos, la histona citrulinada H3 y el ADN libre de células.Usando hematoxilina y eosina mancha, y microscopía de campo brillante, trombos arteriales felinos consisten en glóbulos rojos, leucocitos, fibrina y plaquetas. Los GRAF aparecieron como redes de hilos púrpuras profundos de varias longitudes que rodean los eritrocitos y leucocitos cercanos. Utilizando este protocolo, la microscopía de inmunofluorescencia reveló grandes agregados de NPT compuestos de ADN libre de células, histona citrulinada extracelular H3 y elastasa neutrófilos.Bajo contraste de fase en la microscopía inmune, un trombo se caracterizó como una estructura bien demarcada dentro del espacio vascular. Sin embargo, no se detectaron trombos en ninguna de las muestras de control. Esta figura demuestra una profunda autofluoresencia de elementos de coágulos como eritrocitos cuando se muestra en la longitud de onda de 488 nanómetros.El breve enfriamiento de la autofluoresencia después del inmunoetiqueje aumentó significativamente la sensibilidad de la co-localización de proteínas y la detección de NET incluso en áreas con abundancia de eritrocitos. La duración de la fijación afecta a la inmunoreactividad de ciertos antígenos. Recomendamos fijar durante no más de 24 horas la deshidratación y la incrustación de parafina.Alternativamente, el paraformaldehído libre de metanol se puede utilizar para limitar el artefacto por ácido fórmico y cetonas de la oxidación del formaldehído. Para evitar interferencias al utilizar anticuerpos primarios procedentes de la misma especie, incluimos un paso de bloqueo adicional para saturar los sitios de unión restantes en los anticuerpos secundarios. Los investigadores deben incluir controles negativos consistentes en anticuerpos isotipos, exclusión de anticuerpos primarios y pasos de inmunoetiquedo y controles biológicos de gatos sin trombosis.La autofluoresncia de los límites tisulares del trombo puede martillar la identificación microscópica de las trampas extracelulares de neutrófilos. El investigador puede minimizar la fluorescencia mediante el uso de fluoróforos de color rojo lejano. Esta técnica puede ser una herramienta valiosa para el estudio de trampas extracelulares de neutrófilos en otras especies veterinarias.Esto puede proporcionar una mejor comprensión de la fisiopatología de la trombosis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Tinción e imágenes para visualizar trampas extracelulares de neutrófilos

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Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

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