Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Studien stöddes av medel från University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Författarna vill erkänna Dr Kevin Woolard för användning av fluorescens mikroskop.

Alla metoder som beskrivs här utfördes i enlighet med riktlinjerna i institutionella Animal Care and Use Committee vid University of California, Davis. Obduktioner och tarmbiopsier av vävnader utfördes med ägarnas samtycke.
1. Vävnadsfixering, inbäddning och snittning
<ol><li>Dissekera ut aorta bifurkation, inklusive fallande aorta, femorala artär, och den gemensamma iliaca artärer (Figur 1A), strax efter human dödshjälp eller död. Trubbig dissekera ...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Vi beskriver ett protokoll för att identifiera UNGATs i fasta feline cardiogenic kranskärlens trombi med hjälp av en dubbel immunmärkning protokoll och immunofluorescens mikroskopi. Även om endast cardiogenic kranskärlens trombi var färgade, i teorin detta protokoll kan användas för andra typer av trombi och i andra veterinärmedicinska arter. Identifiering av unga som varken arbetar eller studerar inom felint arteriell trombi tyder på att unga som varken arbetar eller studerar kan spela en roll i trombos hos k...

Katter med hypertrofisk kardiomyopati löper risk för livshotande tromboembolic komplikationer1,2. Trots den höga sjuklighet och dödlighet som är associerade med felin kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), är den underliggande patofysiologi av CATE hos katter dåligt förstås. Det finns också begränsade diagnostiska och terapeutiska verktyg för att behandla och identifiera katter som löper risk för detta förödande tillstånd3.
Förutom sin roll i medfödd immunitet, neutrofiler har visat sig spela en roll i trombos genom att släppa neutrofil extracellulära fällor (NET), som är webb-liknande nätverk av cell-fria DNA (cfDNA) täckt med histoner och granulat proteiner som neutrofil elastas (NE) och myeloperoxidase. Neutrofiler genomgår nets bildas som svar på systemisk inflammation, direkt möte med patogener och interaktion med aktiverade trombocyter4,,5,,6,7. Hos hundar har neutrofilt-härledda DNA visat sig hämma koaguleringslys, medan NET-proteiner påskyndar koaguleringsbildningen. Nets förmåga att fånga cirkulerande celler och koaguleringskomponenter är också nyckeln till deras trombogenic egenskaper8,,9,,10,,11,12.
Unga och unga är detekt genom colocalization av extracellulära neutrofila proteiner, histoner och cfDNA. På grund av detta är identifiering och kvantifiering av unga som varken arbetar eller studerar i fasta vävnader genom immunfluorescens av deparaffinerade vävnader överlägsen traditionell hematoxylin- och eosinfläck (H&E) med hjälp av ljus fältmikroskopi4,,5. Flera humanstudier med immunofluorescensmikroskopi identifierade ungasum som strukturella komponenter i kranskärlstrombi, cerebral stroketrombi, aterolombos och venös trombi13,14,15,16,17. Hittills har en standardiserad metod för att upptäcka och kvantifiera unga som varken arbetar eller studerar i felint trombi beskrivits. Eftersom identifiering av unga som varken arbetar eller studerar i felin cardiogenic arteriell trombi kan underlätta framtida translationell forskning i unga och medelstora företag, beskriver vi tekniker för NET identifiering och bedömning i paraffin-inbäddade arteriell trombi hos katter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Neutrophil extracellulära fällor (NET), bestående av cellfria DNA (cfDNA) och proteiner som histoner och neutrofil elastase (NE), frigörs av neutrofiler som svar på systemisk inflammation eller patogener. Även om unga som varken arbetar eller studerar har visat sig öka bildningen av blodproppar och hämma fibrinolys hos människor och hundar, har net-värdets roll hos katter med kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), en livshotande komplikation sekundärt till hypertrofisk kardiomyopati , är okänd. En standardiserad metod för att identifiera och kvantifiera unga och unga i kardiogen arteriell trombi hos katter kommer att öka vår förståelse av deras patologiska roll i CATE. Här beskriver vi en teknik för att identifiera UNGATs i formaldehyd-fasta och paraffin-inbäddade trombi inom kolorektal bifurkation, extraheras under obduktion. Efter deparaffinering med xylen genomgick kolorektal sektioner indirekt värme-inducerad antigen hämtning. Avsnitt blockerades sedan, permeabilized och ex vivo EL IDENTIFIERADEs genom colocalization av cell-fria DNA (cfDNA), citrullinerade histon H3 (citH3) och neutrophil elastase (NE) med hjälp av immunofluorescence mikroskopi. För att optimera immunodetection av NETs i trombi, autofluorescens av vävnadselement begränsades med hjälp av en autofluorescens släckning process före mikroskopi. Denna teknik kan vara ett användbart verktyg för att studera unga och grundläggande teknik hos andra arter och ger nya insikter i patofysiologin i detta komplexa tillstånd.

Med hjälp av detta protokoll för deparaffinisering, värme-inducerad antigen hämtning och dubbel immunolabeling av paraffin-inbäddade trombi, identifierade vi UNGAT i katt CATE för första gången. Trombi inom kolorektal bifurkation lokaliserades genom fluorescensmikroskopi och ljusa fältmikroskopi med standard H & E färgning och fas kontrast mikroskopi. På ljusa fältmikroskopi bestod felint arteriell trombi av röda blodkroppar, leukocyter, fibrin och trombocyter (figur 3A). Även ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Vi beskriver en metod för att identifiera neutrophil extracellulära fällor (ELT) i formaldehyde-fasta och paraffin-inbäddade feline cardiogenic kranskärlens trombi med värme-inducerad antigen hämtning och en dubbel immunmärkning protokoll.

Identifiering av neutrofila extracellulära fällor i paraffinin embedded felintens arteriell trombi med immunofluorescensmikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Detta protokoll av parafinization följt av antigen hämtning av paraffin-inbäddade aortic sektioner kan vara ett användbart verktyg för att studera rollen av neutrophilic tricellular fällor i felint blodpropp. Påvisande av neutrofila tricellulära fällor genom immunofluorescens i fast och paraffin-inbäddad vävnad, är överlägsen konventionella histologiska stent som HNE, eftersom det möjliggör samtidig detektering av säkrare DNA och extracellulära proteiner. Detta protokoll kan användas i annan typ av trombi och i andra veterinära arter.Identifiering av neutrophil extracellulära fällor inom felint kranskärlens thrombi tyder på att de kan spela en roll i blodpropp hos katter. Protokoll som presenteras här är riktlinjer. Vi uppmuntrar starkt utredarna att justera varaktigheten och villkoren för antigenhämtningsprocessen för att ge en tillfredsställande signal.För att använda ett automatiserat system för att utföra deparaffinisering och återhydrering av sektionerna på glasglas, placera glasglasen i rack. Submerge helt i 100 procent saltlösning i tre minuter. Upprepa det här steget två gånger.Skölj inte mellan stegen. Dränka helt i minskande koncentrationer av etanol vid rumstemperatur tre gånger i tre minuter vardera. Dränk ner helt i avjoniserat vatten i två minuter och upprepa en gång till.Efter behandling med TBST fyller du reservoaren med avjoniserat vatten som värms upp till 100 grader Celsius. Låt ångkokarkammaren ekvilligt ekvilligt under 20 minuter. På en värmeplatta värmer du den kommersiellt tillgängliga antigenhämtningslösningen som innehåller Tris och EDTA vid pH 9,0 till 95 till 97 grader Celsius.Se till att det inte kokar. Suberge objektglasen helt i den uppvärmda antigenhämtningslösningen och fortsätt appliceringen av extern uppvärmning via ångbåten i 20 minuter. Därefter tvättar du bilderna tre gånger med TBST i fem minuter.Nu placerar du avsnitten i blockerande buffert 1. Inkubera i två timmar i rumstemperatur under skonsam gungning mellan 30 och 50 rpm. Utan tvätt, omedelbart tillämpa 100 mikroliter av utspädd kanin polyclonal anti-mänskliga citrullinated histone H3 antikropp direkt på bilden.Placera en täckslir på varje sektion för att möjliggöra jämn fördelning av antikroppsblandningen. Inkubera i 12 till 16 timmar vid fyra grader Celsius med mild gungning. Därefter tvättar du diabilderna tre gånger med TBST i fem minuter varje gång.För att applicera antikropp, använd en pipet och jämnt fördela 100 mikroliter av get anti-kanin antikropp konjugerat till Alexa Fluor 488. Täck objektglasen med tennfolie och inkubera objektglasen i en timme vid rumstemperatur under varsam gungning. Efter tvättning med TBST enligt manuskriptet, inkubera sektionerna i blockerande buffert 2 över natten vid fyra grader celsius under skonsam gungning.Skydda från ljuset. Tvätta med TBST tre gånger i fem minuter varje gång. Blockera sektionerna i blockerande buffert 3 som tidigare gjorts vid rumstemperatur i två timmar under skonsam gungning.Inkubera avsnitten med biotin laded ployclonal kanin anti-mänskliga neutrophil elastase antikroppar vid fyra grader Celsius i 12 till 16 timmar som beskrivits tidigare. Efter tvättning med TBST inkubera objektglasen med Alexa Fluor 594 Streptavidin Konjugat i en timme i rumstemperatur. Därefter tvättar du med TBST en gång i fem minuter.Applicera 100 mikroliter av Autofluorescense Quenching-lösningsblandning direkt på sektionerna i en minut enligt instruktioner från tillverkaren. Tvätta omedelbart objektglasen med TBST sex gånger i 10 minuter varje gång. Täck varje bild med 100 mikroliter av 300 nanomolar DAPI i fem minuter i mörkret.Tvätta sedan med TBST fem gånger i tre minuter varje gång. Applicera en droppe antifade monteringsmedium direkt på glasglaset som omger sektionen. Placera en lucka försiktigt på sektionen utan att skapa några bubblor.Låt proverna att bota över natten i mörker vid fyra grader Celsius. För att lokalisera thrombi, skanna cranially till caudally längs längden av aorta, kolorektal bifurkation och varje femeral gatan med hjälp av fas kontrast mikroskopi med en 10x mål. Först undersöka avsnitten för cell-free DNA med hjälp av DAPI-kanalen med excitation på 357 och 44 nanometer.Identifiera extracellulära neutrophil elastase och citrullinated histone H3 på Texas röda och gröna fluorescerande protein kanaler respektive. Behåll konsekvent exponeringstid och vinster av varje kanal under hela förvärvet av bilder för att undvika mättnad i pixelintensitet. Neutrofil extracellulära fällor identifieras baserade samlokalisering av neutrofil elastase, citrullinated histone H3 och cell-free DNA.Använda hematoxylin och eosin fläck, och brightfield mikroskopi, kattdjur arteriell trombi består av röda blodkroppar, leukocyter, fibrin och trombocyter. NETs verkade som nätverk av djupa lila trådar av olika längder som omger närliggande erytrocyter och leukocyter. Med hjälp av detta protokoll, immunofluorescens mikroskopi avslöjade stora aggregat av NETs består av cell-free DNA, extracellulära citrullinated histone H3 och neutrophil elastase.Under faskontrast i immunmikroskopi karakteriserades en tromb som en väl avgränsad struktur inom kärlrummet. Thrombi upptäcktes dock inte i något av kontrollproverna. Denna siffra visar djupgående autofluoresence av clot element som erytrocyter när bilden vid 488 nanometer våglängd.Kort autofluoresence släckning efter immunolabelling avsevärt ökat känsligheten för protein co-lokalisering och NET upptäckt även i områden med ett överflöd av erytrocyter. Varaktigheten av fixeringseffekter immunoreactivity av vissa antigener. Vi rekommenderar fixering för inte längre än 24 timmar par dehydrering och paraffin inbäddning.Alternativt kan metanolfri paraformaldehyd användas för att begränsa artefakt genom myrsyra och ketoner från oxidation av formaldehyd. För att förhindra interferens vid användning av primära antikroppar som härstammar från samma art, inkluderade vi ytterligare blockerande steg för att mätta eventuella återstående bindningsställen på de sekundära antikropparna. Prövare måste inkludera negativa kontroller bestående av isotypantikroppar, uteslutande av antingen primära antikroppar och immuno-märkningssteg och biologiska kontroller från katter utan trombos.Autofluoresence av vävnad gränser av thrombi kan hammare mikroskopisk identifiering av neutrofil extracellulära fällor. Utredaren kan minimera fluorescensen genom användning av långtröda fluorforer. Denna teknik kan vara ett värdefullt verktyg för studier av neutrofil extracellulära fällor i andra veterinära arter.Detta kan ge en bättre förståelse för trombosens patofysiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofila Extracellulär Fällor: Hur att generera och visualisera dem

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Förenklad Human Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) Isolering och Hantering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Upptäckt av bakterier inom paraffininbäddade vävnader med hjälp av en Digoxin-märkt DNA-sond Inriktning 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiserad bildbaserad kvantifiering av neutrofila extracellulära fällor med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologisk och kompositionell analys av neutrofila extracellulära fällor inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kvantifiering av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex från neutrofila extracellulära fällor med hjälp av en modifierad sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...