Name: efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

نود أن نشكر هايدي أولريش على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة.

ملاحظة: تم توفير خط مراسل H9 PHOX2B:GFP من قبل Oh وآخرون19. تم الحصول على بعض التمهيديات qPCR المستخدمة في هذه الورقة من تقنيات OriGene ، في حين يتم الحصول على بعض التسلسلات من Frith et al.20،30.
1. إعداد لطلاء الأطباق، وإعداد وسائل الإعلام، وصيانة hPSC
...

<ol>
	<li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia:+History,+genotype,+phenotype+and+translational+research.">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li><li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments.">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li><li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals.">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li><li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+renal+sympathetic+denervation:+2013+and+beyond.">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li><li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Anatomy,+Physiology,+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System.">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li><li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neural Crest. , (1999).</li><li>Sim&#245;es-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis.">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li><li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development.">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li><li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model.">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li><li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation.">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li><li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP,+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border.">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).</li><li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells.">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li><li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons.">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li><li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives.">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li><li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insm1+(IA-1)+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage.">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), 473-481 (2008).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).</li><li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons.">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li><li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling:+current+hurdles+and+future+promise.">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li><li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons.">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li><li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro.">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition.">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).</li><li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).</li><li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia.">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li><li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages.">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li><li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+systems+in+stress:+structural+and+molecular+genetic+approaches.">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li><li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate.">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).</li><li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling,+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders:+a+review.">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li><li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications.">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li></ol>

لقد نشرنا مؤخرا استعراضين، واحد مناقشة استخدام symNs المشتقة من hPSC لنمذجة المرض31، فضلا عن مقارنة متعمقة من بروتوكولات التمايز المتاحة22. وهكذا، هنا نركز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها البروتوكول الحالي لمساعدة الباحث المهتم على النجاح في صنع symNs. خلال عملية التمايز ?...

الخلايا العصبية المتعاطفة بعد ganglionic (symNs) تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإراجي (ANS) ولها أدوار هامة متعددة في الاستجابة وتنظيم التوازن في الجسم مستقلة عن الوعي. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد السمنون ويثير استجابة القتال أو الطيران التي تؤدي إلى زيادة في معدل ضربات القلب وضغط الدم والتعرق. تتأثر SymNs في اضطرابات بشرية متعددة بسبب علم الوراثة أو السمية / الإصابة ، أو كمرافقين لأمراض أخرى. مثال على الاعتلال العصبي الوراثي هو اضطراب الطفولة Dysautonomia (FD) ، حيث يؤدي خلل التنظيم الشديد للsymNs إلى أزمة dysautonomic ، واضحة من خلال التعرق ، لطخة الجلد ، نوبات القيء ، ارتفاع ضغط الدم ، والقلق1. مثال على السمية هو العلاج الكيميائي، الذي أفيد أن له آثار جانبية سامة على الخلايا العصبية اللاإراية2. ومن المعروف أن الإرادي اللاإرادي وفرط التعصيب يمكن أن يؤدي إلى، أو يرافق، أمراض مثل مرض باركنسون أو مرض الكلى ارتفاع ضغط الدم3,4. وبالتالي ، فإن القدرة على إجراء البحوث وفهم آليات علم الأحياء والعيوب في سياق المرض مفيد للبحث عن علاجات جديدة وفعالة.
تشريح يتفرع الجهاز العصبي المحيطي إلى الانقسامات الحسية واللاإراسية. الأعصاب المنفأة في الجهاز العصبي الحسي هي المسؤولة عن الإحساس بالألم واللمس ، في حين أن ANS مسؤولة عن نقل المعلومات من جميع الأجهزة إلى الدماغ. وينقسم ANS إلى الجهاز العصبي المعوي، والداخلية في الجهاز الهضمي، والجهاز العصبي شبه متعاطف، وهو أمر مهم للاسترخاء، والجهاز العصبي المتعاطف (SNS)، وهو أمر مهم لتنشيط / تنظيم الأجهزة. SNS تتكيف مع نظام اثنين من الخلايا العصبية5. المحاور العصبية المتعاطفة قبل ganglionic في الحبل الشوكي المشروع الأول إلى ganglia متعاطفة، حيث توجد أجسام الخلية symN ما بعد ganglionic. ثم ترسل هذه الخلايا العصبية إسقاطات طويلة لإيوينال الأنسجة المستهدفة من كل عضو في الجسم. الإشارات التي تنتقل عن طريق الخلايا العصبية قبل الغانغليونية هي الكوليني، في حين أن symNs ما بعد الغانغليونية هي التحسسية وبالتالي التعبير عن النورادرينالين (NE) كناقل عصبي رئيسي. هناك استثناءات قليلة ملحوظة من الخلايا العصبية ما بعد ganglionic, متعاطفة التي هي الكوليني, بما في ذلك تلك الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا العصبية الأيدرينرجية ما بعد ganglionic التعبير عن إنزيمات التيروزين هيدروكسيلاز (TH), العطرية L-الأمينية حمض decarboxylase (AAAD), الدوبامين α-هيدروكسيلاز (DBH), وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO-A), جميع المسؤولة عن توليد واستقلاب NE. وعلاوة على ذلك، فإنها تعبر عن ناقلات إعادة التدوير NE و / أو مستقبلات α-adrenergic (ADRA2)، مستقبلات الأدريين (ADR2B)، الناقل النورادرينالين (NET1)، وناقل اليورياميني الفيمركب (VMAT1/2).
التنميه خلال تطور الجنين ية يتم اشتقاق symNs من القمة العصبية (NC), الذي يظهر بين الأنبوب العصبي وتراكب ectoderm6,ويمكن أن تفرق في أنساب متعددة الخلايا, بما في ذلك الخلايا الصباغية, العظام الخلايا, الخلايا الدهنية, غليا, الخلايا العصبية المعوية, الخلايا العصبية الحسية, والخلايا العصبية اللاإروية7. خلايا القمم العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تأخذ عدة طرق عبر الجنين. في هذه المرحلة المبكرة من NC التنمية، والخلايا التعبير عن علامات SNAIL1/2، FOXD3، وSOX108،9،10،11. يحدد مسار الترحيل مع الموقع المحوري الذي يتبنونه النوع الفرعي NC الذي ستتطور إليه. يمكن تمييز هذه الأنواع الفرعية NC من خلال التعبير الجيني HOX محددة: NCCs الجمجمة لا تعبر عن الجينات HOX, NCCs المبهمة التعبير HOX 1-5, NCCs الجذع التعبير HOX 6-9, وNCCs sacral التعبير HOX 10-1112. ومن بينها، يُعترف بمراكز الـ NCCs للجذع كمصدر رئيسي للسيومين. SymN السلائف التعبير عن عامل النسخ MASH1/ASCL113, الذي يعزز التعبير عن PHOX2B14 وINSM115. يتم التعبير عن عائلة GATA من عوامل النسخ أثناء التطور المتعاطف المتأخر. يتم التعبير عن GATA2 و GATA3 في symNs ، والتي بدورها ينشط DBH16. عامل النسخ HAND2 مهم أيضا للتعبير عن وصيانة DBH و TH17.
وخلايا HPSCs (مثل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة) هي أداة قوية18 لتلخيص النماذج التنموية وتوليد الخلايا السلية التي يمكن استخدامها بعد ذلك لنمذجة الأمراض لمختلف الاضطرابات البشرية. وهكذا، فبينما تولد السيوم الوطني من المراكز الاستراتيجية الوطنية، من الأهمية بمكان اتباع المبادئ التوجيهية الإنمائية وتقييم التعبير عن العلامات المناسبة على طول عملية التمايز.
بروتوكول symN السابق وقد ذكرت عدد قليل من مجموعات البحث سابقا توليد symNs من hPSCs19,20,21. المقارنة المباشرة لهذه البروتوكولات لبعضها البعض ولنا واستعرض مؤخرا22. في 201623, نشرنا بروتوكول التمايز لتوليد الخلايا العصبية اللاإراية مع حرف symN(الشكل 1A). استخدم هذا البروتوكول الوسيط القائم على KSR ، والذي تم استخدامه في كل من الحفاظ على hPSCs غير المتمايزة وتمايز الخلايا. وعلاوة على ذلك، تم الحفاظ على hPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (الخلايا المغذية MEF). لقد وظفنا هذا البروتوكول وPSCs من المرضى الذين يعانون من FD لنموذج اضطراب23. في عام 2019 ، وصفنا نسخة أكثر تفصيلاً من هذا البروتوكول القديم24. باختصار ، تم حث المصير العصبي عن طريق تثبيط SMAD المزدوج25 لمنع إشارات TGF-α و BMP في اليومين الأولين. تعزيز تفعيل WNT باستخدام CHIR99021 السلف العصبية لتصبح خلايا NC. في اليوم 11، تم فرز الخلايا من قبل FACS لCD49D+ أو SOX10+ السكان26،23، والتي أسفرت عن حوالي 40٪ كفاءة الجيل NC. ومن ثم، فإن الفرز ضروري لضمان الكفاءة والنقاء للخطوات التالية للتمايز. تم الحفاظ على NCCs وتضخيمها كspheroids مع المعالجة المشتركة من FGF2 وCHIR. بعد 4 أيام، تم مطلي spheroids NC من الصيانة وأعطيت BDNF، GDNF، وNGF لإنهاء نضوج symN. على الرغم من أن هذه symNs أعرب عن علامات symN قوية مثل ASCL1, TH, DBH, و PHOX2A, علامات لsymNs أكثر نضجا, بما في ذلك التعبير عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين (CHRNA3/CHRNB4) والناقل الحويصلة (VMAT1/2), كانت منخفضة حتى بعد 70 يوما من التمايز. لم يتم اختبار جينات HOX في هذا البروتوكول رسميًا ، ولم يتم التحقق من الخصائص العصبية الناضجة ، بما في ذلك النشاط الكهربي الفسيولوجي للخلايا.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لتوليد symNs(الشكل 1B). يتم الحفاظ على HPSCs في ظروف خالية من التغذية، على الأطباق المغلفة بالفيترونكتين (VTN)، باستخدام الوسائط الأساسية 8 (E8)27. وقد تم تعديل صيغة وسائل الإعلام التمايز في كل مرحلة، مما أدى إلى زيادة النسبة المئوية للسكان NC28. ويمكن القيام بنضوج symN على CD49D+/ SOX10+ فرزأو مجموعات NCC السائبة غير المصنفة. كلاهما تظهر مستويات عالية من التعبير علامة symN بحلول اليوم 30. وعلاوة على ذلك، فإن symNs ولدت مع هذا البروتوكول تستجيب للتسجيل الكهروفيزيولوجية والعلاجات مع المنشط symN والمركبات المثبطة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07 200 601 and 07 200 602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/20% O2 tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovation Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108311</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ascl1 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556604</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304313</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody (isotype)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400125</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DAPI antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DBH antibody</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22806</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>Host: Chicken; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HOXC9 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365692</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NET1 antibody</td>
			<td>Mab</td>
			<td>NET17-1</td>
			<td>Host: Mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PRPH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-377093/H0112</td>
			<td>Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50839</td>
			<td>Host: Mouse; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101- 150</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Countess II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>57021&#38;5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vial</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dbcAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 supplement</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15171-01</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>M768-tMEA-96W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX (for FACS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios EQ (for sorting)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (blue filter cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (white cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Thomson et al., (1998)</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Oh et al. (2016)</td>
			<td>H9-PHOX2B::eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin (FN)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher/Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Stock concentration: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN tank</td>
			<td>Custom Biogenic Systems</td>
			<td>V-1500AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA reader</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>Maestro Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin I (LM)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-01</td>
			<td>Stock concentration: 25 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Stock concentration: 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotics)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANTPM1</td>
			<td>Stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Stock concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris/R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN)</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>706308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions

أصبحت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قوية لنمذجة الأمراض ودراسة النمو الجنيني البشري في المختبر. قدمنا سابقا بروتوكول التمايز لاشتقاق الخلايا العصبية اللاإراية مع الطابع المتعاطف الذي تم تطبيقه على المرضى الذين يعانون من الاعتلال العصبي اللاإراجي. ومع ذلك ، تم بناء البروتوكول على استبدال مصل الضرب (KSR) وظروف الثقافة القائمة على التغذية ، ولضمان كفاءة التمايز العالية ، كان فرز الخلايا ضروريًا. هذه العوامل تسبب تقلب عالية، وارتفاع التكلفة، وانخفاض الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقق من الخصائص المتعاطفة الناضجة، بما في ذلك النشاط الكهربائي. هنا ، نقدم بروتوكولًا مثاليًا حيث يتم تنفيذ ثقافة PSC والتمايز في ظروف ثقافة خالية من التغذية ومحددة كيميائيًا. يتم تحديد العلامات الوراثية التي تحدد قمة الجذع العصبية. ويتحقق مزيد من التمايز في الخلايا العصبية المتعاطفة ما بعد ganglionic بعد 20 يوما دون الحاجة إلى فرز الخلايا. تسجيل الكهربية تظهر كذلك هوية الخلايا العصبية الوظيفية. يمكن تعزيز إطلاق النار المكتشف ة من الخلايا العصبية المتمايزة لدينا عن طريق النيكوتين وقمعها من قبل مستقبلات الأدينرجية خصم بروبرانولول. يمكن الحفاظ على السلف العصبية المتعاطفة المتوسطة في هذا البروتوكول كسفيرات عصبية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسمح بتوسيع الثقافات. باختصار، لدينا تحديث بروتوكول التمايز العصبية المتعاطفة يظهر كفاءة التمايز عالية، واستنساخ أفضل، والمزيد من المرونة، وتحسين النضج العصبي مقارنة مع الإصدار السابق. هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع الخلايا اللازمة لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي اللاإرادي.

في هذا البروتوكول، نعطي تعليمات حول كيفية توليد symNs من hPSCs. تم تحسين ظروف الثقافة المثبتة هنا من بروتوكول نشر سابق23،24 (الشكل 1A)إلى شروط خالية من التغذية ومحددة كيميائيا(الشكل 1B). يتم توفير خيارين، واحد حيث يتم symNs في غضون 20 يوما...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.

تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

يسمح هذا البروتوكول اشتقاق الخلايا العصبية المتعاطفة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. هذه الخلايا سوف تمكن عالما لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي المتعاطف. هذه التقنية تسمح اشتقاق الخلايا العصبية المتعاطفة في ظروف الاجتماع الخالية من التغذية المقسمة في كفاءة عالية قابلة للتطوير.أنه يؤدي في الخلايا العصبية النشطة كهربائيا في 20 يوما. ويمكن تطبيق هذه التقنية على الأمراض الناجمة عن خلل الجهاز العصبي متعاطفة، كما يمكن أن تستخدم النمذجة المرض، الطب التجديدي، وفحص المخدرات. يمكن استخدام هذه الخلايا في المختبر لابتكار أي أنسجة داخل نظام ثقافة مشترك ، على سبيل المثال ، لدراسة تنظيم أنسجة القلب.عندما تصل ثقافة الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء ، ينبغي ملاحظة المستعمرات الكبيرة ذات الحواف الساطعة الناعمة. لتقسيم، وغسل الثقافة مع برنامج تلفزيوني قبل معالجة الخلايا مع أربعة ملليلتر من 0.25 EDTA الضرس في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد دقيقتين، قم بمسح اللوحة بـ 10 ملليلترات من E8 المتوسطة ونقل تعليق الخلية المنفصل إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.ثم نقل 500 ميكرولترات من الخلايا إلى 9.5 ملليلتر aliquot من E8 المتوسطة الطازجة. وطبق الخلايا الجذعية على vitronectin جديدة المغلفة 100 ملليمتر أطباق. قبل يوم واحد من التمايز التعريفي، معطف العدد المناسب من ستة لوحات جيدا مع ملليلتر اثنين من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر.وخزن اللوحات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، تدفئة لوحات إلى درجة حرارة الغرفة وغسل جاهزة لتقسيم الإنسان متعددة القدرات ثقافة الخلايا الجذعية مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، تعامل مع الخلايا مع سبعة ملليلتر من 0.5 ملليمولار EDTA لمدة 15 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية قبل الطامح الخلايا الجذعية البشرية العائمة متعددة القدرات ونقل الخلايا المحصودة إلى أنبوب 50 ملليلتر.إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب لتخفيف EDTA وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من يوم 01 تمايز المتوسطة قبل إضافة حجم مناسب من المتوسطة للمحاسبة. تمييع الخلايا إلى 1.25 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز سنتيمتر مربع في ملليلتر من التمايز المتوسطة في البئر.استلهم كل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي حل من كل بئر من أعدت سابقا إلى ستة لوحة جيدا. ثم بذور مليلترين من الخلايا في كل بئر ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية. في صباح اليوم التالي، تغذية الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من اليوم 01 تمايز المتوسطة في بئر.في اليوم الثاني من التمايز ، وإطعام الخلايا بثلاثة ملليلترات من اليوم الثاني إلى 10 تمايز متوسطة في البئر ، ثم تغذية الخلايا كل يوم حتى اليوم 10. لتجميع خلايا القمة العصبية في الخلايا الرّئية، في اليوم العاشر، اغسل الخلايا بـ PBS. وإضافة مليلترين من الانفصام المتوسط لكل بئر.بعد 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية ، قم بنقل الخلايا العائمة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وإحضار حجم التعليق في الأنبوب إلى 50 ملليلتر مع PBS جديدة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. و resuspend بيليه في حجم كاف من اليوم 10 إلى 14 وسيلة 14 spheroid للعد.بعد العد، تمييع الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز ميكرولترس 500 باستخدام اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة. ولوحة 500 ميكروليتر من الخلايا في كل بئر من مرفق منخفضة جدا 24-جيدا لوحة. ثم قم بإرجاع الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.للحث على ثقافة أدنى spheroid ، في اليوم 11 من الثقافة ، وإطعام الذرة العصبية مع 500 ميكرولترات إضافية من اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة في البئر. في اليوم 12، إمالة لوحة لتتراكم الزفيرويدات على جانب واحد من لوحة. واتّهم بعناية قدر الإمكان من المتوسط من كل بئر دون أن تُشعّب ِ بُرَوّة.ثم تغذية spheroids مع ملليلتر واحد من اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة في بئر. للحث على ثقافة واسعة من الزفيرويد، في اليوم 15، تغذية spheroids مع 1.5 ملليلتر من اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة تكملها 0.5 حمض الريتينويك ميكرومولر في بئر. ثم قم بإرجاع spheroids إلى حاضنة ثقافة الخلية.للتمايز العصبية المتعاطفة، في اليوم 14 أو 28، إمالة لوحة لتراكم spheroids على جانب واحد من لوحة وpirate بعناية متوسطة قدر الإمكان. تغذية الخلايا مع ملليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية المتعاطفة. لتفريق المجاميع spheroid كبيرة في spheroids أصغر ، إضافة ما لا يزيد عن ملليلتر واحد من المتوسطة في البئر والميصة spheroids خمس إلى 10 مرات قبل تقسيم.وإزالة الليفي اللامينيين الزائدة من لوحات 24-جيدا أعدت سابقا. تقسيم لوحة ملليلتر واحد من spheroids من كل بئر على لوحة ثقافة spheroid 24-آبار بين أربعة آبار منفصلة من لوحة جديدة المغلفة 24 جيدا. إضافة 250 ميكرولترات من الخلايا العصبية متعاطفة جديدة المتوسطة لكل بئر.ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية. في صباح اليوم التالي، استبدال المتوسطة في كل بئر مع ملليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية المتعاطفة تكمل مع 0.125 حمض الريتينويك ميكرومولار والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية. بعد يوم 35، تغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال بعناية فقط نصف الوسط الموجود في كل بئر مع المتوسطة الطازجة.قبل التمايز، ينبغي أن تكون مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات مستديرة بحافات لامعة وسلسة والقليل أو لا تمايز. الخلايا تعبر عن علامة القمة العصبية Sox10 من الأيام الأربعة إلى 10. تظهر خلايا القمة العصبية في التلال الكثيفة الداكنة التي تكون مرئية من اليوم السادس.هذه التلال أيضا تعبر عن Sox10. في مرحلة الخلايا العصبية، يرتبط Sox10 مع علامة سطح الخلية CD49D، والتي يمكن استخدامها لفرز الخلايا القمة العصبية. أنتجت مجموعات سكانية إيجابية مفروزة وغير متنوعة ذرّة عصبية بطريقة مماثلة.في حين أن الخلايا المفكوزة السلبية لا تجمع بشكل صحيح ، لا تنتج دائرية ، ناعمة صحية تبحث spheroids ويموت في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. وعلاوة على ذلك، عندما تتم مقارنة الذرى العصبية spheroids في اليوم 14، وcredase عكس الكمية PCR لذرة العصبية و العلامات السلف العصبي متعاطفة، لا يمكن الكشف عن اختلافات كبيرة بين الخلايا فرزها وغير فرزها. في اليوم 20 أو 35 ، والبروتوكولات الحد الأدنى أو الموسعة ، يمكن ملاحظة الأعصاب تنمو في نمط شعاعي من الزنجيات المرفقة.يتم التعبير عن علامات تتعلق تخليق نافرينفيرين والنقل في هذه المرحلة, وكذلك Hox6 من خلال تسعة الجينات الجذع العصبية قمة. كما يكشف التسجيل الكهربائي النشاط العصبي من اليوم 20. يمكن تعزيز مثل هذا النشاط أو قمعه من قبل الأدوية التي تستهدف التقبلات الذاتية للخلايا العصبية المتعاطفة تعديل وظيفة الخلايا العصبية المتمايزة.يجب أن يكون المؤيد البشري نفسه بصحة جيدة بدءًا من اليوم الصفري للتمايز ، وإلا ، من المرجح أن تفشل التجربة. يمكن إضافة مثبطات دوائية أو منشطات إلى الخلايا العصبية لفهم سلوكهم الطبيعي أو المرضي. هذه الطريقة تفتح طريقا جديدا لدراسة البيولوجيا متعاطفة وعلم الأمراض منذ أنه من الممكن الآن الحصول على خزعات من الخلايا العصبية المتعاطفة من البشر بسهولة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

محددة وقابلة للتطوير الجيل من الخلايا تشبه الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...