Name: efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Vi vil gerne takke Heidi Ulrichs for kritisk læsning og redigering af manuskriptet.

BEMÆRK: H9 PHOX2B:GFP reporter linjen blev leveret af Oh et al.19. Nogle qPCR primere, der anvendes i dette papir blev fremstillet af OriGene Technologies, mens et par sekvenser er fremstillet af Frith et al.20,30.
1. Opsætning til overfladebehandling af fad, medieforberedelse og hPSC-vedligeholdelse
<ol><li>Skål belægning<ol>
<li>
Vitronectin (VTN) belægning
		<ol>
<li>Hætteglas med VTN...

<ol>
	<li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia:+History,+genotype,+phenotype+and+translational+research.">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li><li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments.">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li><li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals.">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li><li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+renal+sympathetic+denervation:+2013+and+beyond.">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li><li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Anatomy,+Physiology,+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System.">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li><li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neural Crest. , (1999).</li><li>Sim&#245;es-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis.">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li><li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development.">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li><li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model.">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li><li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation.">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li><li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP,+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border.">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).</li><li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells.">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li><li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons.">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li><li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives.">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li><li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insm1+(IA-1)+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage.">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), 473-481 (2008).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).</li><li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons.">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li><li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling:+current+hurdles+and+future+promise.">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li><li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons.">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li><li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro.">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition.">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).</li><li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).</li><li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia.">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li><li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages.">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li><li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+systems+in+stress:+structural+and+molecular+genetic+approaches.">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li><li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate.">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).</li><li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling,+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders:+a+review.">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li><li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications.">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li></ol>

Vi har for nylig offentliggjort to anmeldelser, en diskuterer brugen af hPSC-afledte symNs for sygdom modellering31 samt en dybtgående sammenligning af tilgængelige differentiering protokoller22. Således, her fokuserer vi på fejlfinding den nuværende protokol for at hjælpe den interesserede forsker lykkes at gøre symNs. Under hele differentieringsprocessen bør kontaminering i alle faser kontrolleres nøje for at opnå ensartede data samt sunde differentierede celler...

Postganglionic sympatiske neuroner (symNs) hører til det autonome nervesystem (ANS) og har flere vigtige roller i at reagere og regulere homøostase i kroppen uafhængigt af bevidsthed. For eksempel stimulerer stress symNs og fremkalder kampen-eller-flugt reaktion, der fører til en stigning i puls, blodtryk, og svedtendens. SymNs er påvirket i flere menneskelige lidelser på grund af genetik, toksicitet / skade, eller som ledsagere til andre sygdomme. Et eksempel på en genetisk neuropati er børnesygdommen Familiær Dysautonomi (FD), hvor en alvorlig dysregulering af symNs forårsager dysautonomisk krise, tydeligt ved svedtendens, blotching af huden, opkastning sangreb, hypertension, og angst1. Et eksempel på toksicitet er kemoterapi behandling, som er blevet rapporteret at have toksiske bivirkninger på autonome neuroner2. Det er kendt, at autonome denervation og hyper-innervation både kan føre til, eller ledsage, sygdomme som Parkinsons sygdom eller hypertensive nyresygdom3,4. Således er det gavnligt for søgningen af nye og effektive behandlinger at være i stand til at forske og forstå mekanismerne i symNbiologi og defekter i forbindelse med sygdom.
Anatomi Det perifere nervesystem grene i sensoriske og autonome divisioner. De afferente nerver i det sensoriske nervesystem er ansvarlige for følelse af smerte og berøring, mens ANS er ansvarlig for at formidle oplysninger fra alle organer til hjernen. ANS er opdelt i det enteriske nervesystem, innervating mave-tarmkanalen, det parasympatiske nervesystem, som er vigtigt for afslapning, og det sympatiske nervesystem (SNS), som er vigtigt for aktivering / regulering af organer. SNS tilpasser et to-neuron system5. Preganglionic sympatiske neurale axoner i rygmarven første projekt til den sympatiske ganglier, hvor postganglionic symN celle organer er placeret. Disse neuroner derefter sende lange fremskrivninger til innervate målet væv af hvert organ i kroppen. Signaler, der transmitteres af præganglioniske neuroner er kolinerge, mens postganglionic symNs er adrenerge og dermed udtrykke noradrenalin (NE) som deres vigtigste neurotransmitter. Der er få bemærkelsesværdige undtagelser fra postganglionic, sympatiske neuroner, der er kolinerge, herunder dem innervating blodkar. Adrenerge postganglioniske neuroner udtrykker enzymerne tyrosin hydroxylase (TH), aromatisk L-aminosyre decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroxylase (DBH) og monoaminoxidase (MAO-A), alle ansvarlige for at generere og metabolisere NE. Endvidere udtrykker de NE-genbrugstransportører og/eller receptorer α-adrenerge receptorer (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalintransporter (NET1) og vesikulær monoamintransportør (VMAT1/2).
Udvikling Under embryonale udvikling symNs er afledt af neurale crest (NC), som opstår mellem neuralrørssystemet og overliggende ektoderm6, og kan differentiere i flere celle slægter, herunder melanocytter, osteoblaster, adipocytter, glia, enteriske neuroner, sensoriske neuroner, og autonome neuroner7. Neurale crest celler (NCC) er stærkt vandrende celler, der tager flere ruter gennem fosteret. På dette tidlige stadium af NC udvikling, cellerne udtrykke markører SNAIL1/2, FOXD3, og SOX108,9,10,11. Migrationsruten sammen med den aksiale placering, de vedtager, bestemmer den nc-undertype, som de vil udvikle sig i. Disse NC-undertyper kan skelnes ved deres specifikke HOX-genekspression: Kranie-NCC'er udtrykker ikke HOX-gener, vagus-NCC'er udtrykker HOX 1-5, trunk-NCC'er udtrykker HOX 6-9, og sakrale NCC'er udtrykker HOX 10-1112. Blandt dem, trunk NCC'er er anerkendt som den vigtigste kilde til symNs. SymN prækursorer udtrykke transskription faktor MASH1/ASCL113, som fremmer udtryk for PHOX2B14 og INSM115. GATA familie af transskription faktorer kommer til udtryk i slutningen af sympatisk udvikling. GATA2 og GATA3 udtrykkes i symNs, som igen aktiverer DBH16. Transskriptionsfaktoren HAND2 er også vigtig for dbh'ens og TH17'sudtryk og vedligeholdelse .
HPSCs (f.eks embryonale og inducerede pluripotente stamceller) er et kraftfuldt værktøj18 til at opsummere udviklingsmæssige paradigmer og generere symNs, der derefter kan anvendes til sygdommodellering af forskellige menneskelige lidelser. Samtidig med at der genereres symNs fra hPSCs, er det derfor afgørende at følge udviklingsretningslinjerne og vurdere udtryk for passende markører langs differentieringsprocessen.
Forrige symN-protokol Kun få forskergrupper har tidligere rapporteret om generering af symNs fra HPSCs19,20,21. Den direkte sammenligning af disse protokoller til hinanden og vores blev gennemgået for nylig22. I 201623offentliggjorde vi en differentieringsprotokol for generering af autonome neuroner med symN-karakter (Figur 1A). Denne protokol anvendte KSR-baseret medium, som blev brugt til både vedligeholdelse af udifferentierede HPSC'er og celledifferentiering. Desuden blev hPSCs opretholdt på mus embryonale fibroblaster (MEF feeder celler). Vi anvendte denne protokol og KPC'er fra patienter med FD til at modellere lidelsen23. I 2019 beskrev vi en mere detaljeret version af denne ældre protokol24. Sammenfattende blev den neurale skæbne induceret af dobbelt SMAD-hæmning25 for at blokere TGF-β og BMP-signalering i de første 2 dage. WNT aktivering ved hjælp af CHIR99021 fremmes neurale sformere til at blive NC celler. På dag 11 blev cellerne sorteret efter FACS for CD49D+ eller SOX10+ populationer26,23, hvilket gav omkring 40% NC generation effektivitet. Sortering var således nødvendig for at sikre effektivitet og renhed for de næste trin i differentieringen. NCC'erne blev opretholdt og forstærket som sfæroider med kombineret behandling af FGF2 og CHIR. Efter 4 dage blev NC sfæroider af vedligeholdelse belagt og givet BDNF, GDNF, og NGF at afslutte symN modning. Selv om disse symNs udtrykt stærke symN markører såsom ASCL1, TH, DBH, og PHOX2A, markører for mere modne symNs, herunder udtryk for den nicotiniske acetylcholin receptor (CHRNA3/CHRNB4) og vesikel transportør (VMAT1/2), var lav, selv efter 70 dages differentiering. HOX gener i denne protokol blev ikke formelt testet, og modne neurale egenskaber, herunder elektrofysiologisk aktivitet af cellerne, blev ikke verificeret.
Her præsenterer vi en optimeret protokol til at generere symNs (Figur 1B). HPSC'er vedligeholdes under foderautomatfrie forhold på vitronectin (VTN)-belagte retter ved hjælp af Essential 8 (E8) media27. Formlen for differentieringsmediet er blevet ændret på hvert trin, hvorved procentdelen af NC's befolkninger steget 28. Den symN modning kan gøres på CD49D+/ SOX10+ sorteret eller usorteret bulk NCC populationer. Begge viser høje niveauer af symN markør udtryk ved dag 30. Desuden er symNs genereret med denne protokol reagerer på elektrofysiologisk optagelse og til behandlinger med symN aktivator og inhibitor forbindelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07 200 601 and 07 200 602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/20% O2 tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovation Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108311</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ascl1 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556604</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304313</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody (isotype)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400125</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DAPI antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DBH antibody</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22806</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>Host: Chicken; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HOXC9 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365692</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NET1 antibody</td>
			<td>Mab</td>
			<td>NET17-1</td>
			<td>Host: Mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PRPH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-377093/H0112</td>
			<td>Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50839</td>
			<td>Host: Mouse; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101- 150</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Countess II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>57021&#38;5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vial</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dbcAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 supplement</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15171-01</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>M768-tMEA-96W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX (for FACS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios EQ (for sorting)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (blue filter cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (white cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Thomson et al., (1998)</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Oh et al. (2016)</td>
			<td>H9-PHOX2B::eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin (FN)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher/Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Stock concentration: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN tank</td>
			<td>Custom Biogenic Systems</td>
			<td>V-1500AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA reader</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>Maestro Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin I (LM)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-01</td>
			<td>Stock concentration: 25 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Stock concentration: 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotics)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANTPM1</td>
			<td>Stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Stock concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris/R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN)</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>706308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er blevet et effektivt redskab til sygdomsmodellering og studiet af menneskelig embryonal ebiotionisk udvikling in vitro. Vi har tidligere præsenteret en differentieringsprotokol for afledning af autonome neuroner med sympatisk karakter, der er blevet anvendt på patienter med autonom neuropati. Men protokollen blev bygget på Knock Out Serum Replacement (KSR) og feeder-baserede dyrkningbetingelser, og for at sikre høj differentieringeffektivitet var cellesortering nødvendig. Disse faktorer forårsager høj variation, høje omkostninger, og lav reproducerbarhed. Desuden er modne sympatiske egenskaber, herunder elektrisk aktivitet, ikke blevet verificeret. Her præsenterer vi en optimeret protokol, hvor PSC-kultur og differentiering udføres i feeder-fri og kemisk definerede dyrkningsbetingelser. Genetiske markører, der identificerer stammenneuralt våbenskjold, er identificeret. Yderligere differentiering i postganglionic sympatiske neuroner opnås efter 20 dage uden behov for cellesortering. Elektrofysiologisk optagelse viser yderligere den funktionelle neuron identitet. Fyring opdaget fra vores differentierede neuroner kan forbedres ved nikotin og undertrykt af adrenerge receptor antagonist propranolol. Mellemliggende sympatiske neurale sformere i denne protokol kan opretholdes som neurale sfæroider i op til 2 uger, som giver mulighed for udvidelse af kulturerne. Sammenfattende, vores opdaterede sympatiske neuron differentiering protokol viser høj differentiering effektivitet, bedre reproducerbarhed, mere fleksibilitet, og bedre neurale modning i forhold til den tidligere version. Denne protokol vil give forskerne de celler, der er nødvendige for at studere menneskelige lidelser, der påvirker det autonome nervesystem.

I denne protokol giver vi instruktioner om, hvordan du genererer symNs fra HPSCs. De kulturbetingelser, der blev påvist her, blev forbedret fra en tidligere offentliggjort protokol23,24 (figur 1A) til feederfrie og kemisk definerede betingelser ( figur1B). Der er to muligheder, hvor den ene er lavet inden for 20 dage, og en anden, hvor De Nationale Rådgivende Råd kan udvides i 2 uger for at generere f...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

I denne protokol beskriver vi en stabil, yderst effektiv differentieringsstrategi for generering af postganglioniske sympatiske neuroner fra menneskelige pluripotente stamceller. Denne model vil gøre neuroner til rådighed for brug af undersøgelser af flere autonome lidelser.

Effektiv differentiering af postganglioniske sympatiske neuroner ved hjælp af humane pluripotente stamceller under Feeder-fri og kemisk definerede kulturbetingelser

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Denne protokol tillader afledning af sympatiske neuroner fra menneskelige pluripotente stamceller. Disse celler vil gøre det muligt for en videnskabsmand at studere menneskelige lidelser, der påvirker det sympatiske nervesystem. Denne teknik gør det muligt at udlede sympatiske neuroner i opdelte feeder-fri mødebetingelser på en høj skalerbar effektivitet.Det resulterer i elektrisk aktive neuroner i 20 dage. Denne teknik kan anvendes på sygdomme forårsaget af en dysfunktionel sympatisk nervesystem, det også kan bruges til sygdom modellering, regenerativ medicin, og lægemiddelscreening. Disse celler kan anvendes in vitro til at innovere væv i et co-kultursystem, for eksempel til undersøgelse af regulering af hjertevæv.Når den menneskelige pluripotente stamcellekultur når 80 til 90% sammenløbet, bør store kolonier med glatte lyse kanter observeres. Til opdeling vaskes kulturen med PBS, før cellerne behandles med fire milliliter 0,25 molar EDTA ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid. Efter to minutter skylles pladen med 10 milliliter E8-medium, og den fritliggende cellesuspension overføres til et konisk rør på 15 milliliter.Derefter overføres 500 mikroliter af celler til et 9,5 milliliter aliquot frisk E8-medium. Og plade stamcellerne på nye vitronectin belagt 100 millimeter retter. En dag før differentiering induktion, pels det passende antal af seks godt plader med to milliliter kælder membran matrix per brønd.Og opbevar pladerne ved fire grader Celsius natten over. Næste morgen, varm pladerne til stuetemperatur og vask klar til at opdele menneskelige pluripotente stamcellekultur to gange med frisk PBS per vask. Efter den anden vask behandles cellerne med syv milliliter 0,5 millimolar EDTA i 15 minutter i cellekulturinkubatoren, før de flydende humane pluripotente stamceller aspirerer, og de høstede celler overføres til et 50 milliliterrør.Der tilsættes et tilsvarende volumen PBS til røret for at fortynde EDTA'en og indsamle cellerne ved centrifugering. Pelletsuspendrer pelletet igen i et milliliter af dag 01-differentieringsmediet, før der tilsættes et passende mediumvolumen til regnskabsføring. Fortyndes cellerne til en 1,25 gange 10 til de femte celler pr kvadratcentimeter koncentration i milliliter differentiering medium pr brønd.Aspirere alle kælderen membran matrix løsning fra hver brønd af den tidligere forberedt til seks godt plade. Derefter frø to milliliter celler i hver brønd og læg pladen i cellekulturinkubatoren. Den næste morgen, fodre cellerne med tre milliliter af dagen 01 differentiering medium per brønd.På dag to af differentiering, fodre cellerne med tre milliliter dag to til 10 differentiering medium pr brønd, derefter fodre cellerne hver anden dag indtil dag 10. At samle neurale crest celler i sfæroider, på dag 10, vaske cellerne med PBS. Og tilsæt to milliliter dissociation medium til hver brønd.Efter 20 minutter i cellekulturinkubatoren overføres de flydende celler til et konisk rør på 50 milliliter, og suspensionsmængden i røret bringes op på 50 milliliter med frisk PBS. Indsamle cellerne ved centrifugering. Og resuspend pellet i et tilstrækkeligt volumen af dag 10 til 14 sfæroide medium til optælling.Efter optællingen fortyndes cellerne til fem gange 10 til de femte celler pr. 500 mikroliters koncentration ved hjælp af dag 10 til 14 sfæroide medium. Og plade 500 mikroliter af celler i hver brønd af en ultra lav vedhæftet fil 24-brønd plade. Vend derefter cellerne tilbage til cellekulturskuvøsen.At fremkalde en minimal sfæroid kultur, på dag 11 af kultur, fodre neurale crest sfæroider med en yderligere 500 mikroliter af dagen 10 til 14 sfæroide medium per godt. På dag 12 vippes pladen for at samle sfæroiderne på den ene side af pladen. Og omhyggeligt aspirere så meget medium som muligt fra hver brønd uden at aspirere sfæroider.Derefter fodres sfæroider med en milliliter dag 10 til 14 sfæroide medium per brønd. At fremkalde en udvidet sfæroide kultur, på dag 15, fodre sfæroider med 1,5 milliliter af dagen 10 til 14 sfæroide medium suppleret med 0,5 mikromolar retinsyre per brønd. Derefter returneres sfæroiderne til cellekulturinkubatoren.For sympatisk neuron differentiering, på dag 14 eller 28, vippe pladen til at akkumulere sfæroider på den ene side af pladen og omhyggeligt aspirere så meget medium som muligt. Fodre cellerne med en milliliter af sympatisk neuron medium. At bryde op store sfæroid aggregater i mindre sfæroider, tilføje ikke mere end en milliliter medium per godt og pipette sfæroider fem til 10 gange før opdeling.Og fjern den overskydende laminin fibronectin fra tidligere forberedte 24-brønds plader. Split pladen en milliliter af sfæroider fra hver brønd på 24-brønde sfæroide kultur plade mellem fire separate brønde af den nye belagte 24-brønd plade. Tilføj 250 mikroliter af frisk sympatisk neuron medium til hver brønd.Og læg pladen i cellekulturskuvøsen. Den næste morgen, erstatte mediet i hver brønd med en milliliter sympatisk neuron medium suppleret med 0,125 mikromolar retinsyre og returnere pladen til cellekultur inkubator. Efter dag 35 fodres neuronerne ved omhyggeligt at erstatte halvdelen af det eksisterende medium i hver brønd med frisk medium.Før differentiering, bør den menneskelige pluripotente stamceller kolonier være runde med skinnende, glatte kanter og lidt at ingen differentiering. Cellerne udtrykker den neurale crest markør Sox10 fra dag fire til 10. Neurale crest celler opstår i tætte mørke højderygge, der er synlige fra dag seks på.Disse kamme også udtrykke Sox10. På neurale crest celler fase, Sox10 korrelerer med cellen overflade markør CD49D, som kan bruges til at sortere neurale crest celler. Positive sorterede og usorterede populationer produceret neurale crest sfæroider på en lignende måde.Mens negative sorterede celler ikke samles ordentligt, ikke producerer runde, glat sundt udseende sfæroider og dø inden for tre til fire dage. Endvidere, når neurale crest sfæroider sammenlignes på dag 14, den kvantitative omvendte transskription PCR for neurale crest og sympatiske nerve progenitor markører, betydelige forskelle mellem de sorterede og usorterede celler kan ikke påvises. På dag 20 eller 35, de respektive minimale eller udvidede protokoller, neuroider kan observeres vokser i et radialt mønster fra de vedlagte sfæroider.Markører relateret til noradrenalin syntese og transport er udtrykt på dette tidspunkt, samt Hox6 gennem ni stammen neurale crest gener. Elektrofysiologisk optagelse registrerer også neural aktivitet fra dag 20 på. En sådan aktivitet kan forbedres eller undertrykkes af lægemidler, der er målrettet autoreceptorer af sympatiske neuroner justere funktionaliteten af differentierede neuroner.Den menneskelige fortaler selv skal være sund starter på dag nul af differentiering, ellers vil forsøget sandsynligvis mislykkes. Farmakologiske hæmmere eller aktivatorer kan føjes til neuroner til at forstå deres normale eller patologiske adfærd. Denne metode åbner en ny vej for at studere sympatisk biologi og patologi, da det nu er muligt at opnå biopsier af sympatiske neuroner fra mennesker nemt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering af induceret pluripotente stamceller fra humane perifere T-celler Brug af Sendai Virus i Feeder-fri Betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering af pluripotente stamceller til NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreatisk progenitorer

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiering af humane pluripotente stamceller til trofoblastceller

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definerede Xeno-fri og Feeder-fri kultur betingelser for den Generation af menneskelige iPSC-afledte Retinal Cell modeller

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering af humane pluripotente stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...