Name: efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

We willen Heidi Ulrichs bedanken voor het kritisch lezen en bewerken van het manuscript.

OPMERKING: De H9 PHOX2B:GFP reporter lijn werd geleverd door Oh et al.19. Sommige qPCR primers gebruikt in dit papier werden verkregen van OriGene Technologies, terwijl een paar sequenties worden verkregen uit Frith et al.20,30.
1. Opstelling voor schotelcoating, mediavoorbereiding en hPSC-onderhoud
<ol><li>De laag van de schotel<ol>
<li>
Vitronectine (VTN) coating
		<ol>
<li>Plaats flesjes VT...

<ol>
	<li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia:+History,+genotype,+phenotype+and+translational+research.">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li><li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments.">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li><li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals.">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li><li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+renal+sympathetic+denervation:+2013+and+beyond.">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li><li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Anatomy,+Physiology,+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System.">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li><li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neural Crest. , (1999).</li><li>Sim&#245;es-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis.">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li><li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development.">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li><li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model.">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li><li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation.">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li><li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP,+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border.">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).</li><li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells.">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li><li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons.">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li><li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives.">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li><li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insm1+(IA-1)+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage.">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), 473-481 (2008).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).</li><li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons.">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li><li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling:+current+hurdles+and+future+promise.">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li><li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons.">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li><li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro.">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition.">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).</li><li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).</li><li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia.">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li><li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages.">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li><li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+systems+in+stress:+structural+and+molecular+genetic+approaches.">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li><li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate.">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).</li><li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling,+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders:+a+review.">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li><li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications.">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li></ol>

We publiceerden onlangs twee reviews, een bespreken van het gebruik van hPSC-afgeleide symNs voor ziekte modellering31 evenals een diepgaande vergelijking van de beschikbare differentiatie protocollen22. Dus, hier richten we ons op het oplossen van problemen met het huidige protocol om de geïnteresseerde onderzoeker te helpen slagen in het maken van symNs. Tijdens het gehele differentiatieproces, om consistente gegevens en gezonde gedifferentieerde cellen te verkrijgen, mo...

Postganglionic sympathische neuronen (symNs) behoren tot het autonome zenuwstelsel (ANS) en hebben meerdere belangrijke rollen in het reageren en reguleren van homeostase van het lichaam onafhankelijk van bewustzijn. Stress stimuleert bijvoorbeeld symnen en roept de vecht-of-vluchtrespons op die leidt tot een toename van hartslag, bloeddruk en zweten. Symns worden beïnvloed in veelvoudige menselijke wanorde toe te schrijven aan genetica, giftigheid/verwonding, of als metgezellen aan andere ziekten. Een voorbeeld van een genetische neuropathie is de kinderziekte Familiale Dysautonomia (FD), waar een ernstige dysregulatie van symns dysautonome crisis veroorzaakt, duidelijk door zweten, vlekken van de huid, braken aanvallen, hypertensie, en angst1. Een voorbeeld van toxiciteit is chemotherapie behandeling, waarvan is gemeld dat toxische bijwerkingen hebben op autonome neuronen2. Het is bekend dat autonome denerhonger en hyper-innervatie beide kunnen leiden tot, of begeleiden, ziekten zoals de ziekte van Parkinson of hypertensieve nierziekte3,4. Dus, in staat zijn om onderzoek te doen en de mechanismen van symN biologie en gebreken in de context van de ziekte te begrijpen is gunstig voor het zoeken naar nieuwe en effectieve behandelingen.
Anatomie Het perifere zenuwstelsel vertakt zich in zintuiglijke en autonome divisies. De afferente zenuwen van het zintuiglijke zenuwstelsel zijn verantwoordelijk voor het gevoel van pijn en aanraking, terwijl de ANS verantwoordelijk is voor het doorgeven van informatie van alle organen naar de hersenen. Het ANS is verdeeld in het enterische zenuwstelsel, waarbij het maag-darmkanaal, het parasympathische zenuwstelsel, dat belangrijk is voor ontspanning, en het sympathische zenuwstelsel (SNS), dat belangrijk is voor activering/regulatie van organen. De SNS past een twee-neuron systeem5. Preganglionic sympathische neurale axonen in het ruggenmerg eerste project aan de sympathische ganglia, waar postganglionic symN cel lichamen bevinden. Deze neuronen sturen dan lange projecties om de doelweefsels van elk orgaan in het lichaam innervate. Signalen overgedragen door preganglionic neuronen zijn cholinerge, terwijl postganglionic symNs zijn adrenergic en dus express noradrenaline (NE) als hun belangrijkste neurotransmitter. Er zijn enkele opmerkelijke uitzonderingen van postganglionic, sympathische neuronen die cholinerg zijn, met inbegrip van degenen innervating bloedvaten. Adrenerge postganglionic neuronen uitdrukken de enzymen tyrosine hydroxylase (TH), aromatische L-aminozuur decarboxylase (AAAD), dopamine β-hydroxylase (DBH), en monoamine oxidase (MAO-A), allemaal verantwoordelijk voor het genereren en metaboliseren NE. Voorts drukken zij de NE-recyclingtransporters en/of receptoren α-adrenerge receptor (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalinetransporter (NET1) en vesiculaire monoaminetransporter (VMAT1/2) uit.
Ontwikkeling Tijdens de embryonale ontwikkeling symNs zijn afgeleid van de neurale crest (NC), die ontstaat tussen de neurale buis en overlaying ectoderm6, en kan zich onderscheiden in meerdere celgeslachten, met inbegrip van melanocyten, osteoblasten, adipocyten, glia, enterische neuronen, sensorische neuronen, en autonome neuronen7. Neurale crest cellen (NPC's) zijn zeer migrerende cellen die verschillende routes door het embryo. In dit vroege stadium van nc-ontwikkeling drukken de cellen de markers SNAIL1/2, FOXD3 en SOX108,9,10,11uit . De migratieroute bepaalt samen met de axiale locatie die ze aannemen het NC-subtype waarin ze zich zullen ontwikkelen. Deze NC-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun specifieke HOX-genexpressie: CranialN NPC's drukken geen HOX-genen uit, vagalNcc's express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9 en sacrale NPC's express HOX 10–1112. Onder hen, stam NPC's worden erkend als de belangrijkste bron van symNen. SymN precursoren uiten de transcriptiefactor MASH1/ASCL113, die de expressie van PHOX2B14 en INSM115bevordert . De GATA familie van transcriptie factoren wordt uitgedrukt tijdens de late sympathische ontwikkeling. GATA2 en GATA3 worden uitgedrukt in de symNs, die op hun beurt activeert DBH16. De transcriptiefactor HAND2 is ook belangrijk voor de expressie en het onderhoud van DBH en TH17.
HPSCs (bijvoorbeeld embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) zijn een krachtig instrument18 om ontwikkelingsparadigma's te recapituleren en symNs te genereren die vervolgens kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering van verschillende menselijke aandoeningen. Het genereren van symnen uit hPSCs is dus van cruciaal belang om ontwikkelingsrichtlijnen te volgen en de expressie van geschikte markeringen langs het differentiatieproces te beoordelen.
Vorig symN-protocol Weinig onderzoeksgroepen hebben eerder gemeld de generatie van symN's van hPSCs19,20,21. De directe vergelijking van deze protocollen met elkaar en de onze werd onlangs herzien22. In 201623, publiceerden we een differentiatie protocol voor het genereren van autonome neuronen met symN karakter (Figuur 1A). Dit protocol gebruikte KSR-gebaseerd medium, dat werd gebruikt bij zowel het onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs als celdifferentiatie. Bovendien werden hPSC's gehandhaafd op embryonale fibroblasten van muizen (MEF-feedercellen). We gebruikten dit protocol en PSC's van patiënten met FD om de aandoening 23 temodelleren. In 2019 beschreven we een meer gedetailleerde versie van dit oudere protocol24. Samengevat werd het neurale lot veroorzaakt door dubbele SMAD-remming25 om TGF-β en BMP-signalering in de eerste 2 dagen te blokkeren. WNT activering met chir99021 bevorderd neurale voorlopers om NC-cellen te worden. Op dag 11 werden cellen gesorteerd door FACS voor CD49D+ of SOX10+ populaties26,23, wat ongeveer 40% NC-generatie efficiëntie opleverde. Zo was sorteren nodig om de efficiëntie en zuiverheid voor de volgende stappen van differentiatie te waarborgen. De NPC's werden gehandhaafd en versterkt als sferoïden met de gecombineerde behandeling van FGF2 en CHIR. Na 4 dagen werden de NC sferoïden van onderhoud verguld en kregen BDNF, GDNF en NGF de symN rijping te voltooien. Hoewel deze symN's sterke symN-markers zoals ASCL1, TH, DBH en PHOX2A uitten, waren markers voor meer volwassen symnen, inclusief expressie van de nicotinische acetylcholine-receptor (CHRNA3/CHRNB4) en blaastransporter (VMAT1/2), laag, zelfs na 70 dagen differentiatie. HOX-genen in dit protocol werden niet formeel getest en volwassen neurale eigenschappen, waaronder elektrofysiologische activiteit van de cellen, werden niet geverifieerd.
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van symNs (figuur 1B). HPSC's worden onderhouden in feeder-vrije omstandigheden, op vitronectine (VTN)-gecoate gerechten, met behulp van Essential 8 (E8) media27. De formule van de differentiatiemedia is in elk stadium gewijzigd, waardoor het percentage van de NC-populatie28is verhoogd. De symN rijping kan worden gedaan op CD49D+/ SOX10+ gesorteerdof ongesorteerde bulk NCC populaties. Beide tonen hoge niveaus van symN marker expressie door dag 30. Bovendien reageren de symnen die met dit protocol worden gegenereerd, op elektrofysiologische opname en op behandelingen met symN-activator- en inhibitorverbindingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07 200 601 and 07 200 602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/20% O2 tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovation Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108311</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ascl1 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556604</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304313</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody (isotype)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400125</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DAPI antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DBH antibody</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22806</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>Host: Chicken; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HOXC9 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365692</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NET1 antibody</td>
			<td>Mab</td>
			<td>NET17-1</td>
			<td>Host: Mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PRPH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-377093/H0112</td>
			<td>Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50839</td>
			<td>Host: Mouse; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101- 150</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Countess II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>57021&#38;5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vial</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dbcAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 supplement</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15171-01</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>M768-tMEA-96W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX (for FACS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios EQ (for sorting)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (blue filter cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (white cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Thomson et al., (1998)</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Oh et al. (2016)</td>
			<td>H9-PHOX2B::eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin (FN)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher/Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Stock concentration: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN tank</td>
			<td>Custom Biogenic Systems</td>
			<td>V-1500AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA reader</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>Maestro Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin I (LM)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-01</td>
			<td>Stock concentration: 25 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Stock concentration: 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotics)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANTPM1</td>
			<td>Stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Stock concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris/R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN)</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>706308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn uitgegroeid tot een krachtig instrument voor ziekte modellering en de studie van de menselijke embryonale ontwikkeling in vitro. We presenteerden eerder een differentiatieprotocol voor de afleiding van autonome neuronen met sympathiek karakter dat is toegepast op patiënten met autonome neuropathie. Het protocol werd echter gebouwd op Knock Out Serum Replacement (KSR) en op feeder gebaseerde cultuuromstandigheden, en om een hoge differentiatie-efficiëntie te garanderen, was celsortering noodzakelijk. Deze factoren veroorzaken een hoge variabiliteit, hoge kosten en een lage reproduceerbaarheid. Bovendien zijn volwassen sympathieke eigenschappen, waaronder elektrische activiteit, niet geverifieerd. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol waarbij PSC-cultuur en differentiatie worden uitgevoerd in feedervrije en chemisch gedefinieerde cultuuromstandigheden. Genetische markers die hoofdwapen identificeren, worden geïdentificeerd. Verdere differentiatie in postganglionic sympathieke neuronen wordt bereikt na 20 dagen zonder de noodzaak voor celsortering. Elektrofysiologische opname toont verder de functionele neuron identiteit. Afvuren gedetecteerd van onze gedifferentieerde neuronen kan worden versterkt door nicotine en onderdrukt door de adrenerge receptor antagonist propranolol. Intermediaire sympathische neurale voorouders in dit protocol kunnen tot 2 weken worden gehandhaafd als neurale sferoïden, waardoor de culturen kunnen worden uitgebreid. Kortom, onze bijgewerkte sympathische neuron differentiatie protocol toont een hoge differentiatie efficiëntie, betere reproduceerbaarheid, meer flexibiliteit, en een betere neurale rijping in vergelijking met de vorige versie. Dit protocol zal onderzoekers voorzien van de cellen die nodig zijn om menselijke aandoeningen te bestuderen die het autonome zenuwstelsel beïnvloeden.

In dit protocol geven we instructies over het genereren van symns van hPSCs. De hier aangetoonde cultuuromstandigheden werden verbeterd van een eerder gepubliceerd protocol23,24 (figuur 1A) tot feedervrije en chemisch gedefinieerde omstandigheden ( figuur1B). Er zijn twee opties beschikbaar, een waarbij symnen binnen 20 dagen worden gemaakt, en een andere waar de NPC's gedurende 2 weken kunnen worden uit...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Dit protocol maakt de afleiding van sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen mogelijk. Deze cellen zullen een wetenschapper in staat stellen om menselijke aandoeningen te bestuderen die het sympathische zenuwstelsel beïnvloeden. Deze techniek maakt de afleiding van sympathische neuronen in verdeelde feeder-vrije vergaderomstandigheden op een hoge schaalbare efficiëntie.Het resulteert in elektrisch actieve neuronen in 20 dagen. Deze techniek kan worden toegepast op ziekten veroorzaakt door een disfunctioneel sympathisch zenuwstelsel, het kan ook worden gebruikt voor ziektemodellering, regeneratieve geneeskunde en screening van geneesmiddelen. Deze cellen kunnen in vitro worden gebruikt om elk weefsel binnen een co-cultuursysteem te innoveren, bijvoorbeeld voor de studie van cardiale weefselregulatie.Wanneer de menselijke pluripotente stamcelcultuur 80 tot 90% samenvloeiing bereikt, moeten grote kolonies met gladde heldere randen worden waargenomen. Voor het splitsen, was de cultuur met PBS voor de behandeling van de cellen met vier milliliter van 0,25 molaire EDTA bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Spoel de plaat na twee minuten door met 10 milliliter E8-medium en breng de vrijstaande celsuspensie over naar een conische buis van 15 milliliter.Breng vervolgens 500 microliter cellen over naar een 9,5 milliliter aliquot van vers E8-medium. En plaat de stamcellen op nieuwe vitronectin gecoate 100 millimeter schotels. Een dag voor differentiatie inductie, vacht het juiste aantal van zes goed platen met twee milliliter van kelder membraan matrix per put.En bewaar de platen op vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, verwarm de platen op kamertemperatuur en was de klaar om de menselijke pluripotente stamcelcultuur twee keer te splitsen met verse PBS per wasbeurt. Behandel de cellen na de tweede wasbeurt gedurende 15 minuten met zeven milliliter EDTA in de celkweekbrocor voordat u de drijvende pluripotente stamcellen aspireert en de geoogste cellen overdraagt in een buis van 50 milliliter.Voeg een gelijk volume van PBS aan de buis om de EDTA te verdunnen en het verzamelen van de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in een milliliter van dag 01 differentiatie medium alvorens een passend volume van medium voor de boekhouding toe te voegen. Verdun de cellen tot een 1,25 keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter concentratie in milliliters van differentiatie medium per put.Aspirate alle van de kelder membraan matrix oplossing van elke put van de eerder voorbereid tot zes goed plaat. Zaad dan twee milliliter cellen in elke put en plaats de plaat in de celcultuur incubator. De volgende ochtend, voeden de cellen met drie milliliter van dag 01 differentiatie medium per put.Op dag twee van differentiatie, voeden de cellen met drie milliliters van dag twee tot 10 differentiatie medium per goed, dan voeden de cellen om de andere dag tot dag 10. Om de neurale kamcellen te aggregeren in sferoïden, was de cellen op dag 10 met PBS. En voeg twee milliliter dissociatiemedium toe aan elke put.Breng na 20 minuten in de celkweek incubator de drijvende cellen over in een conische buis van 50 milliliter en breng het suspensievolume in de buis op 50 milliliter met verse PBS. Verzamel de cellen door centrifugatie. En resuspend de pellet in een voldoende volume van dag 10 tot 14 sferoïde medium voor het tellen.Verdun de cellen na het tellen tot een vijf keer 10 tot de vijfde concentratie van cellen per 500 microliters met behulp van dag 10 tot 14 sferoïde medium. En plaat 500 microliter cellen in elke put van een ultra lage bevestiging 24-put plaat. Breng de cellen dan terug naar de celkweek incubator.Om een minimale sferoïde cultuur te induceren, op dag 11 van de cultuur, voeden de neurale kam sferoïden met een extra 500 microliter van dag 10 tot 14 sferoïde medium per put. Kantel op dag 12 de plaat om de sferoïden aan één kant van de plaat op te hopen. En zorgvuldig aspirate zoveel mogelijk medium van elke put zonder aspirating sferoïden.Voer vervolgens de sferoïden met een milliliter van dag 10 tot 14 sferoïde medium per put. Om een uitgebreide sferoïde cultuur te induceren, voer op dag 15 de sferoïden met 1,5 milliliter dag 10 tot 14 sferoïde medium aangevuld met 0,5 micromolar retinoïnezuur per put. Breng de sferoïden terug naar de celkweek incubator.Voor sympathische neuron differentiatie, op dag 14 of 28, kantel de plaat om de sferoïden accumuleren aan de ene kant van de plaat en zorgvuldig aspirate zo veel medium mogelijk. Voer de cellen met een milliliter van sympathiek neuron medium. Om grote sferoïde aggregaten op te splitsen in kleinere sferoïden, voeg niet meer dan een milliliter medium per put toe en pipette de sferoïden vijf tot 10 keer voordat u splitst.En verwijder de overtollige laminine fibronectin van eerder voorbereide 24-well platen. Splits de plaat een milliliter van sferoïden van elke put op de 24-putten sferoïde cultuurplaat tussen vier afzonderlijke putten van de nieuwe gecoate 24-well plaat. Voeg 250 microliters van verse sympathieke neuron medium aan elke put.En plaats de plaat in de celcultuur incubator. De volgende ochtend, vervang het medium in elke put met een milliliter van sympathiek neuron medium aangevuld met 0,125 micromolar retinoïnezuur en de plaat terug te keren naar de celcultuur incubator. Na dag 35, voeden de neuronen door zorgvuldig te vervangen slechts de helft van het bestaande medium in elke put met vers medium.Vóór differentiatie moeten de menselijke pluripotente stamcelkolonies rond zijn met glanzende, gladde randen en weinig tot geen differentiatie. De cellen drukken de neurale kuif marker Sox10 van dag vier tot en met 10. Neurale kuifcellen ontstaan in dichte verduisterde richels die zichtbaar zijn vanaf dag zes.Deze ribbels drukken ook Sox10 uit. In het stadium van de neurale kamcellen correleert Sox10 met de celoppervlakmarkering CD49D, die kan worden gebruikt om de neurale kamcellen te sorteren. Positieve gesorteerde en ongesorteerde populaties produceerden neurale kamferoïden op een vergelijkbare manier.Terwijl negatieve gesorteerde cellen niet goed aggregeren, niet produceren ronde, glad gezond uitziende sferoïden en sterven binnen drie tot vier dagen. Bovendien, wanneer neurale kam sferoïden worden vergeleken op dag 14, de kwantitatieve omgekeerde transcriptase PCR voor neurale kam en sympathische zenuwverergisters, significante verschillen tussen de gesorteerde en ongesorteerde cellen kunnen niet worden gedetecteerd. Op dag 20 of 35, de respectieve minimale of uitgebreide protocollen, neuroïden kunnen worden waargenomen groeien in een radiaal patroon van de bijgevoegde sferoïden.Markers met betrekking tot noradrenaline synthese en transport worden uitgedrukt in dit stadium, evenals Hox6 door middel van negen stam neurale kuif genen. Elektrofysiologische opname detecteert ook neurale activiteit vanaf dag 20. Dergelijke activiteit kan worden verbeterd of onderdrukt door geneesmiddelen die zich richten op autoreceptoren van sympathische neuronen die de functionaliteit van gedifferentieerde neuronen aanpassen.De menselijke voorstander zelf moet gezond zijn vanaf dag nul van differentiatie, anders zal het experiment waarschijnlijk mislukken. Farmacologische remmers of activators kunnen worden toegevoegd aan de neuronen om hun normale of pathologische gedrag te begrijpen. Deze methode opent een nieuwe weg voor het bestuderen van sympathieke biologie en pathologie, omdat het nu mogelijk is om biopten van sympathische neuronen gemakkelijk van mensen te verkrijgen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Gedefinieerde Xeno-vrij en kweekomstandigheden Feeder-gratis voor de generatie van menselijke iPSC afkomstige Retinal cel modellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...