Name: efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Wir danken Heidi Ulrichs für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts.

HINWEIS: Die H9 PHOX2B:GFP Reporterlinie wurde von Oh et al.19zur Verfügung gestellt. Einige qPCR Primer, die in diesem Papier verwendet werden, wurden von OriGene Technologies bezogen, während einige Sequenzen von Frith et al.20,30erhalten werden.
1. Aufbau für Schalenbeschichtung, Medienaufbereitung und hPSC-Wartung
<ol><li>Tellerbeschichtung<ol>
<li>
Vitronectin (VTN) Beschichtung
		<ol>...

<ol>
	<li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia:+History,+genotype,+phenotype+and+translational+research.">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li><li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments.">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li><li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages.">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li><li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+systems+in+stress:+structural+and+molecular+genetic+approaches.">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li><li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate.">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).</li><li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling,+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders:+a+review.">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li><li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications.">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li></ol>

Wir haben vor kurzem zwei Rezensionen veröffentlicht, eine, die die Verwendung von hPSC-abgeleiteten SymNs für die Krankheitsmodellierung31 sowie einen eingehenden Vergleich der verfügbaren Differenzierungsprotokolle22diskutiert. Daher konzentrieren wir uns hier auf die Fehlerbehebung des aktuellen Protokolls, um dem interessierten Forscher zu helfen, SymNs zu erstellen. Während des gesamten Differenzierungsprozesses sollte die Kontamination in allen Stadien sorgfältig...

Postganglionische sympathische Neuronen (SymNs) gehören zum autonomen Nervensystem (ANS) und haben mehrere wichtige Rollen bei der Reaktion und Regulierung der Homöostase des Körpers unabhängig vom Bewusstsein. Zum Beispiel stimuliert Stress SymNs und ruft die Kampf-oder-Flug-Reaktion hervor, die zu einer Erhöhung der Herzfrequenz, des Blutdrucks und des Schwitzens führt. SymNs sind bei mehreren menschlichen Störungen aufgrund von Genetik, Toxizität/Verletzung oder als Begleiter zu anderen Krankheiten betroffen. Ein Beispiel für eine genetische Neuropathie ist die Kindheitsstörung Familiäre Dysautonomie (FD), bei der eine schwere Dysregulation von SymNs eine dysautonome Krise verursacht, die durch Schwitzen, Ausblasen der Haut, Erbrechen, Bluthochdruck und Angst1offensichtlich wird. Ein Beispiel für Toxizität ist die Chemotherapie, die toxische Nebenwirkungen auf autonome2Neuronen 2 haben soll. Es ist bekannt, dass autonome Denervation und Hyper-Innervation sowohl zu Krankheiten wie Parkinson oder hypertensiveNierenerkrankung,4führen können, als auch zu begleiten. Daher ist es für die Suche nach neuartigen und wirksamen Behandlungen von Vorteil, die Mechanismen der SymN-Biologie und Defekte im Zusammenhang mit Krankheiten zu erforschen und zu verstehen.
Anatomie Das periphere Nervensystem verzweigt sich in sensorische und autonome Divisionen. Die affevollen Nerven des sensorischen Nervensystems sind für das Gefühl von Schmerz und Berührung verantwortlich, während das ANS für die Weitergabe von Informationen von allen Organen an das Gehirn verantwortlich ist. Das ANS ist in das enterische Nervensystem unterteilt, das den Magen-Darm-Trakt, das parasympathische Nervensystem, das für die Entspannung wichtig ist, und das sympathische Nervensystem (SNS), das für die Aktivierung/Regulierung von Organen wichtig ist. Das SNS passt ein Zwei-Neuron-System5an. Präganglionische sympathische neuronale Axone im Rückenmark projizieren zunächst auf die sympathischen Ganglien, wo sich postganglionische SymN-Zellkörper befinden. Diese Neuronen senden dann lange Projektionen, um das Zielgewebe jedes Organs im Körper zu innervieren. Signale, die von präganglionischen Neuronen übertragen werden, sind cholinerge, während postganglionische SymNs adrenerge sind und somit Noradrenalin (NE) als ihren wichtigsten Neurotransmitter ausdrücken. Es gibt nur wenige bemerkenswerte Ausnahmen von postganglionischen, sympathischen Neuronen, die cholinergisch sind, einschließlich derer, die die Blutgefäße innervierend bilden. Adrenergetische postganglonische Neuronen drücken die Enzyme Tyrosinhydroxylase (TH), aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AAAD), Dopamin-Hydroxylase (DBH) und Monoaminoxidase (MAO-A) aus, die alle für die Erzeugung und Metabolisierung von NE verantwortlich sind. Darüber hinaus exprimieren sie die NE-Recycling-Transporter und/oder Rezeptoren a-adrenergen Rezeptor (ADRA2), den adrenergen Rezeptor (ADR2B), den Noradrenalin-Transporter (NET1) und den vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT1/2).
Entwicklung Während der embryonalen Entwicklung werden SymNs aus dem Neuralkamm (NC) abgeleitet, der zwischen dem Neuralrohr und dem überlagernden Ektoderm6entsteht und sich in mehrere Zelllinien differenzieren kann, einschließlich Melanozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Glia, enterischen Neuronen, sensorischen Neuronen und autonomen Neuronen7. Neurale Kammzellen (NCCs) sind hochwandernde Zellen, die mehrere Wege durch den Embryo nehmen. In diesem frühen Stadium der NC-Entwicklung exprimieren die Zellen die Marker SNAIL1'2, FOXD3 und SOX108,9,10,11. Die Migrationsroute zusammen mit der axialen Position, die sie annehmen, bestimmt den NC-Subtyp, zu dem sie sich entwickeln werden. Diese NC-Subtypen lassen sich durch ihre spezifische HOX-Genexpression unterscheiden: Cranial NCCs exprimieren keine HOX-Gene, vagal-NCCs drücken HOX 1–5 aus, Trunk-NCCs drücken HOX 6–9 aus und sakrale NCCs drücken HOX 10–1112aus. Unter ihnen werden Trunk-NCCs als Hauptquelle von SymNs anerkannt. SymN-Vorläufer drücken den Transkriptionsfaktor MASH1/ASCL113aus, der die Expression von PHOX2B14 und INSM115fördert. Die GATA-Familie von Transkriptionsfaktoren kommt während der späten sympathischen Entwicklung zum Ausdruck. GATA2 und GATA3 werden in den SymNs ausgedrückt, was wiederum DBH16aktiviert. Der Transkriptionsfaktor HAND2 ist auch wichtig für die Expression und Wartung von DBH und TH17.
HPSCs (z. B. embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen) sind ein leistungsfähiges Werkzeug18, um Entwicklungsparadigmen zu rekapitulieren und SymNs zu erzeugen, die dann zur Krankheitsmodellierung verschiedener menschlicher Störungen eingesetzt werden können. Daher ist es bei der Generierung von SymNs aus hPSCs von entscheidender Bedeutung, Entwicklungsrichtlinien zu befolgen und die Ausprägung geeigneter Marker entlang des Differenzierungsprozesses zu bewerten.
Vorheriges symN-Protokoll Nur wenige Forschungsgruppen haben bisher über die Generierung von SymNs aus hPSCs19,20,21berichtet. Der direkte Vergleich dieser Protokolle untereinander und unserer wurde vor kurzem22überprüft. Im Jahr 201623haben wir ein Differenzierungsprotokoll für die Erzeugung autonomer Neuronen mit SymN-Charakter veröffentlicht (Abbildung 1A). Dieses Protokoll verwendete KSR-basiertes Medium, das sowohl bei der Aufrechterhaltung undifferenzierter hPSCs als auch bei der Zelldifferenzierung verwendet wurde. Darüber hinaus wurden hPSCs auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF-Feederzellen) aufrechterhalten. Wir verwendeten dieses Protokoll und PSCs von Patienten mit FD, um die Störung23zu modellieren. Im Jahr 2019 haben wir eine detailliertere Version dieses älteren Protokolls24beschrieben. Zusammenfassend wurde das neuronale Schicksal durch die doppelte SMAD-Hemmung25 induziert, um die TGF-- und BMP-Signalisierung in den ersten 2 Tagen zu blockieren. Die WNT-Aktivierung mit CHIR99021 förderte neuronale Vorläufer zu NC-Zellen. Am 11. Tag wurden die Zellen nach FACS für CD49D+ oder SOX10+ Populationen26,23sortiert, was zu einer Effizienz von etwa 40 % NC-Erzeugung führte. Daher war eine Sortierung erforderlich, um die Effizienz und Reinheit für die nächsten Differenzierungsschritte zu gewährleisten. Die NCCs wurden mit der kombinierten Behandlung von FGF2 und CHIR als Sphäroide aufrechterhalten und verstärkt. Nach 4 Tagen wurden die NC-Sphäroide der Wartung plattiert und mit BDNF, GDNF und NGF versorgt, um die SymN-Reifung zu beenden. Obwohl diese SymNs starke SymN-Marker wie ASCL1, TH, DBH und PHOX2A exprimierten, waren Marker für reifere SymNs, einschließlich der Expression des Nicotinacetylcholin-Rezeptors (CHRNA3/CHRNB4) und des Vesikeltransporters (VMAT1/2), auch nach 70 Tagen Differenzierung niedrig. HOX-Gene in diesem Protokoll wurden nicht formal getestet, und reife neuronale Eigenschaften, einschließlich der elektrophysiologischen Aktivität der Zellen, wurden nicht überprüft.
Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SymNs vor (Abbildung 1B). HPSCs werden unter feederfreien Bedingungen auf vitronectin (VTN)-beschichteten Gerichten mit Essential 8 (E8) Medien27gehalten. Die Formel der Differenzierungsmedien wurde in jeder Phase geändert, wodurch der Prozentsatz der NC-Bevölkerungum 28erhöht wurde. Die SymN-Reifung kann auf CD49D+/SOX10+ sortierten oder unsortierten Massen-NCC-Populationen durchgeführt werden. Beide zeigen eine hohe SymN-Marker-Expression am 30. Tag. Darüber hinaus reagieren die mit diesem Protokoll erzeugten SymNs auf elektrophysiologische Aufzeichnungen und Auflagen mit SymN-Aktivator- und Inhibitorverbindungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07 200 601 and 07 200 602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/20% O2 tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovation Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108311</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ascl1 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556604</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304313</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody (isotype)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400125</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DAPI antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DBH antibody</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22806</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>Host: Chicken; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HOXC9 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365692</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NET1 antibody</td>
			<td>Mab</td>
			<td>NET17-1</td>
			<td>Host: Mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PRPH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-377093/H0112</td>
			<td>Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50839</td>
			<td>Host: Mouse; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101- 150</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Countess II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>57021&#38;5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vial</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dbcAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 supplement</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15171-01</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>M768-tMEA-96W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX (for FACS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios EQ (for sorting)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (blue filter cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (white cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Thomson et al., (1998)</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Oh et al. (2016)</td>
			<td>H9-PHOX2B::eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin (FN)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher/Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Stock concentration: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN tank</td>
			<td>Custom Biogenic Systems</td>
			<td>V-1500AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA reader</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>Maestro Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin I (LM)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-01</td>
			<td>Stock concentration: 25 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Stock concentration: 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotics)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANTPM1</td>
			<td>Stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Stock concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris/R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN)</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>706308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der menschlichen embryonalen Entwicklung in vitro geworden. Zuvor haben wir ein Differenzierungsprotokoll zur Ableitung autonomer Neuronen mit sympathischem Charakter vorgelegt, das auf Patienten mit autonomer Neuropathie angewendet wurde. Das Protokoll wurde jedoch auf Knock Out Serum Replacement (KSR) und Feeder-basierten Kulturbedingungen aufgebaut, und um eine hohe Differenzierungseffizienz zu gewährleisten, war eine Zellsortierung erforderlich. Diese Faktoren verursachen eine hohe Variabilität, hohe Kosten und geringe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus wurden reife sympathische Eigenschaften, einschließlich elektrischer Aktivität, nicht überprüft. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll, in dem PSC-Kultur und Differenzierung unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen durchgeführt werden. Genetische Marker, die den neuronalen Kamm des Stammes identifizieren, werden identifiziert. Eine weitere Differenzierung in postganglionische sympathische Neuronen wird nach 20 Tagen ohne Zellsortierung erreicht. Die elektrophysiologische Aufzeichnung zeigt die funktionelle Neuronenidentität weiter. Das aus unseren differenzierten Neuronen nachgewiesene Feuer kann durch Nikotin verstärkt und durch den adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol unterdrückt werden. Zwischensympathische neuronale Vorläufer in diesem Protokoll können als neuronale Sphäroide für bis zu 2 Wochen aufrechterhalten werden, was eine Erweiterung der Kulturen ermöglicht. Zusammenfassend zeigt unser aktualisiertes sympathisches Neuronendifferenzierungsprotokoll eine hohe Differenzierungseffizienz, eine bessere Reproduzierbarkeit, mehr Flexibilität und eine bessere neuronale Reifung im Vergleich zur vorherigen Version. Dieses Protokoll wird Forschern die Zellen zur Verfügung stellen, die notwendig sind, um menschliche Störungen zu untersuchen, die das autonome Nervensystem beeinflussen.

In diesem Protokoll geben wir Anweisungen, wie man SymNs von hPSCs generiert. Die hier gezeigten Kulturbedingungen wurden von einem früheren veröffentlichten Protokoll23,24 (Abbildung 1A) zu feederfreien und chemisch definierten Bedingungen ( Abbildung1B) verbessert. Es werden zwei Optionen angeboten, eine, bei der SymNs innerhalb von 20 Tagen hergestellt werden, und eine andere, in der die NCCs für 2...

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Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Ableitung von sympathischen Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Diese Zellen werden es einem Wissenschaftler ermöglichen, menschliche Störungen zu untersuchen, die das sympathische Nervensystem beeinflussen. Diese Technik ermöglicht die Ableitung von sympathischen Neuronen in geteilten feederfreien Meetingbedingungen bei hoher skalierbarer Effizienz.Es führt zu elektrisch aktiven Neuronen in 20 Tagen. Diese Technik kann auf Krankheiten angewendet werden, die durch ein dysfunktionales sympathisches Nervensystem verursacht werden, es kann auch für die Modellierung von Krankheiten, regenerative Medizin und Arzneimittelscreening verwendet werden. Diese Zellen könnten in vitro verwendet werden, um jedes Gewebe innerhalb eines Co-Kultur-Systems zu innovieren, zum Beispiel für die Untersuchung der Herzgeweberegulation.Wenn die menschliche pluripotente Stammzellkultur 80 bis 90% Konfluenz erreicht, sollten große Kolonien mit glatten hellen Rändern beobachtet werden. Zum Aufspalten die Kultur mit PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit vier Millilitern von 0,25 Molaren EDTA bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid behandeln. Nach zwei Minuten die Platte mit 10 Milliliterem E8-Medium spülen und die abgetrennte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konusrohr übertragen.Dann 500 Mikroliter Zellen in ein 9,5 Milliliter Aliquot frisches E8-Medium übertragen. Und die Stammzellen auf neue vitronectin beschichtete 100-Millimeter-Schalen aufstellen. Einen Tag vor der Differenzierungsinduktion die entsprechende Anzahl von sechs Brunnenplatten mit zwei Millilitern Kellermembranmatrix pro Brunnen beschichten.Und die Teller über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen die Teller auf Raumtemperatur erwärmen und die bereit, die menschliche pluripotente Stammzellkultur zweimal mit frischem PBS pro Wäsche zu teilen. Nach der zweiten Wäsche behandeln Sie die Zellen mit sieben Millilitern 0,5 Millimolar EDTA 15 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die schwimmenden menschlichen pluripotenten Stammzellen anspornen und die geernteten Zellen in eine 50-Milliliter-Röhre übertragen.Fügen Sie dem Rohr ein gleiches PBS-Volumen hinzu, um die EDTA zu verdünnen und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Tag 01 Differenzierungsmedium aus, bevor Sie ein entsprechendes Mediumvolumen für die Buchhaltung hinzufügen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,25 mal 10 bis die fünfte Zelle pro Quadratzentimeter Konzentration in Milliliter Differenzierungsmedium pro Brunnen.Aspirieren Sie die gesamte Kellermembranmatrixlösung aus jedem Brunnen der zuvor auf sechs Wellplatten vorbereiteten Wellplatte. Dann säen Sie zwei Milliliter Zellen in jeden Brunnen und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen füttern Sie die Zellen mit drei Millilitern Tag 01 Differenzierungsmedium pro Brunnen.Am zweiten Tag der Differenzierung, füttern Sie die Zellen mit drei Milliliter n. Tag zwei bis 10 Differenzierungsmedium pro Brunnen, dann füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag bis Tag 10. Um die neuralen Kammzellen zu Sphäroiden zu aggregieren, waschen Sie die Zellen am 10. Tag mit PBS. Und fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationsmedium zu jedem Brunnen.Nach 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator die schwimmenden Zellen in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen und das Suspensionsvolumen in der Röhre mit frischem PBS auf 50 Milliliter erhöhen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen von Tag 10 bis 14 Sphäroid medium zum Zählen wieder aus.Nach dem Zählen, verdünnen Sie die Zellen auf eine fünf mal 10 bis die fünfte Zelle pro 500 Mikroliter Konzentration mit Tag 10 bis 14 Sphäroid Medium. Und Platte 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer ultra niedrigen Befestigung 24-Well-Platte. Kehren Sie dann die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück.Um eine minimale Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie am 11. Tag der Kultur die neuralen Kammsphäroide mit zusätzlichen 500 Mikrolitern tag 10 bis 14 Sphäroidmedium pro Brunnen. Neigen Sie die Platte am 12. Tag, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte anzusammeln. Und sorgfältig so viel Medium wie möglich aus jedem Brunnen ohne animierende Sphäroide aspirieren.Dann füttern Sie die Sphäroide mit einem Milliliter Tag 10 bis 14 Sphäroid Medium pro Brunnen. Um eine erweiterte Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie am 15. Tag die Sphäroide mit 1,5 Millilitern Tag 10 bis 14 Sphäroidmedium, ergänzt mit 0,5 Mikromolar-Retinsäure pro Brunnen. Dann kehren Sie die Sphäroide an den Zellkultur-Inkubator zurück.Für eine sympathische Neuronendifferenzierung, am Tag 14 oder 28, kippen Sie die Platte, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte zu akkumulieren und sorgfältig so viel Medium wie möglich zu aspirieren. Füttern Sie die Zellen mit einem Milliliter sympathischen Neuronmedium. Um große Sphäroidaggregate in kleinere Sphäroide aufzuteilen, fügen Sie nicht mehr als einen Milliliter Medium pro Brunnen hinzu und pipette die Sphäroide fünf bis zehn Mal vor dem Aufteilen.Und entfernen Sie das überschüssige Laminin-Fibronectin von zuvor vorbereiteten 24-Well-Platten. Teilen Sie die Platte einen Milliliter Sphäroide aus jedem Brunnen auf die 24-Wells Sphäroid-Kulturplatte zwischen vier separaten Brunnen der neu beschichteten 24-Well-Platte. Fügen Sie 250 Mikroliter frisches sympathisches Neuronmedium zu jedem Brunnen hinzu.Und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Medium in jedem Brunnen durch einen Milliliter sympathischen Neuronmedium, ergänzt durch 0,125 Mikromolar-Retinsäure, und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach Tag 35 füttern Sie die Neuronen, indem Sie sorgfältig nur die Hälfte des vorhandenen Mediums in jedem Brunnen durch frisches Medium ersetzen.Vor der Differenzierung sollten die menschlichen pluripotenten Stammzellkolonien mit glänzenden, glatten Kanten und wenig bis gar keiner Differenzierung rund sein. Die Zellen drücken den neuralen Kammmarker Sox10 von den Tagen vier bis zehn aus. Neurale Kammzellen entstehen in dichten abgedunkelten Graten, die ab dem sechsten Tag sichtbar sind.Diese Grate drücken auch Sox10 aus. Im Stadium der neuralen Kammzellen korreliert Sox10 mit dem Zelloberflächenmarker CD49D, der verwendet werden kann, um die neuralen Kammzellen zu sortieren. Positiv sortierte und unsortierte Populationen produzierten neurale Kammsphäride in ähnlicher Weise.Während negativ sortierte Zellen nicht richtig aggregieren, produzieren Sie keine runden, glatten, gesund aussehenden Sphäroide und sterben innerhalb von drei bis vier Tagen. Wenn an Tag 14 die quantitative Reverse-Transkriptase-PCR für neurale Kamm- und sympathische Nervenvorläufermarker verglichen wird, können signifikante Unterschiede zwischen den sortierten und unsortierten Zellen nicht nachgewiesen werden. Am 20. oder 35. Tag, den jeweiligen minimalen oder erweiterten Protokollen, können Neuroiden beobachtet werden, die in einem radialen Muster aus den beigefügten Sphäroiden wachsen.Marker im Zusammenhang mit Noradrenalin-Synthese und Transport werden in diesem Stadium ausgedrückt, sowie Hox6 durch neun Stamm neurale Kamm Gene. Elektrophysiologische Aufzeichnung erkennt auch neuronale Aktivität ab Tag 20. Solche Aktivität kann durch Medikamente verbessert oder unterdrückt werden, die Autorezeptoren von sympathischen Neuronen, die die Funktionalität von differenzierten Neuronen anpassen ziel.Der menschliche Befürworter selbst muss gesund sein, beginnend am Tag Null der Differenzierung, sonst wird das Experiment wahrscheinlich scheitern. Pharmakologische Inhibitoren oder Aktivatoren können den Neuronen hinzugefügt werden, um ihr normales oder pathologisches Verhalten zu verstehen. Diese Methode eröffnet einen neuen Weg für das Studium sympathischer Biologie und Pathologie, da es nun leicht möglich ist, Biopsien sympathischer Neuronen vom Menschen zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...