Name: efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

ハイジ・ウルリッヒスの原稿の批判的な読み取りと編集に感謝します。

注意: H9 PHOX2B:GFPレポーターラインは、Ohららによって提供されました。この論文で使用されるいくつかのqPCRプライマーは、OriGene Technologiesから得られたもので、いくつかの配列はFrithら,、30から得られる。20
1. 食器のコーティング、メディアの準備、および hPSC メンテナンスのためのセットアップ
<ol><li>ディ?...

<ol>
	<li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia:+History,+genotype,+phenotype+and+translational+research.">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li><li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments.">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li><li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. 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F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages.">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li><li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+systems+in+stress:+structural+and+molecular+genetic+approaches.">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li><li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate.">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).</li><li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling,+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders:+a+review.">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li><li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications.">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li></ol>

我々は最近、2つのレビューを発表し、1つは、疾患モデリング31のためのhPSC由来のsymNの使用を議論し、利用可能な分化プロトコル22の詳細な比較を行った。そこで、興味のある研究者がsymNを作ることに成功するために、現在のプロトコルのトラブルシューティングに焦点を当てます。分化プロセス全体の間、一貫したデータと健康な分化細胞を得るために?...

神経節後交感神経ニューロン(symN)は自律神経系(ANS)に属し、意識から独立した身体の恒常性の応答および調節において複数の重要な役割を果たしています。例えば、ストレスはsymNを刺激し、心拍数、血圧、発汗の増加につながる戦いや飛行応答を呼び起こします。SymNは、遺伝学、毒性/傷害、または他の疾患の仲間として、複数のヒト障害に影響を受けます。遺伝的神経障害の一例は、小児期障害家族性自律神経障害(FD)であり、symNの重度の調節不変が自律神経障害を引き起こし、発汗、皮膚のしみ、嘔吐発作、高血圧、および不安1によって明らかである。毒性の一例は化学療法治療であり、自律神経細胞に毒性の副作用があると報告されている2.自律神経性脱化および超内腎症は、パーキンソン病または高血圧性腎疾患,3,4などの疾患に併生したり、併生したりすることが知られている。このように、疾患の文脈におけるsymN生物学や欠陥のメカニズムを研究し、理解できることは、新しい効果的な治療法の探索に有益である。
解剖 学 末梢神経系は、感覚と自律神経分裂に分岐します。感覚神経系の感覚神経は痛みや触覚の原因ですが、ANSはすべての臓器から脳への情報を中継する責任があります。ANSは腸神経系に分かれており、胃腸管を内面化し、リラクゼーションに重要な副交感神経系、および器官の活性化/調節に重要な交感神経系(SNS)に分かれています。SNSは、2ニューロンシステム5を適応させる。脊髄の前神経節交感神経軸索は、神経節後のsymN細胞体が位置する交感神経節に最初に投影される。これらのニューロンは、その後、体内のすべての臓器の標的組織を内側に向けるために長い投影を送信します。前ガングリオン性ニューロンによって伝達される信号はコリン作動性であるのに対し、ポストガングlionic symNはアドレナリン性であり、したがってノルエピネフリン(NE)を主な神経伝達物質として発現する。コリン作動性であるポストガンリオニック、交感神経ニューロンの顕著な例外はほとんどありません, 血管を内在するものを含みます.アドレナリン性ポストガングLION細胞は、酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ(AAAD)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)、モノアミンオキシダーゼ(MAO-A)を発現し、NEの生成と代謝を担います。さらに、NE循環性トランスポーターおよび/または受容体αアドレナリン受容体(ADRA2)、βアドレナリン受容体(ADR2B)、ノルエピネフリントランスポーター(NET1)、およびベスキュリモノアミントランスポーター(VMAT1/2)を発現する。
開発 胚発生時にsymNは神経堤(NC)に由来し、神経管とエクトダーム6を重ね合わせ、メラノサイト、骨芽細胞、椎細胞細胞、グリア、腸腸ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン7を含む複数の細胞系統に分化することができる。神経堤細胞(NCC)は、胚を通るいくつかの経路を取る高度に回遊性細胞である。NCの開発の初期のこの段階では、細胞はマーカーSNAIL1 / 2、FOXD3、およびSOX10898、9、10、1110,11を表します。,移行ルートと、それらが採用する軸方向の位置によって、それらが開発される NC サブタイプが決まります。これらのNCサブタイプは、その特定のHOX遺伝子発現によって区別することができる:頭蓋NCCはHOX遺伝子を発現しない、迷走NCCはHOX 1-5を発現し、トランクNCCはHOX 6–9を発現し、仙骨NCCはHOX 10-1112を発現する。その中でも、トランク NCC は symN の主なソースとして認識されます。SymN前駆体は、転写因子MASH1/ASCL113を発現し、これは、PHOX2B14およびINSM115の発現を促進する。15転写因子のGATAファミリーは、後期交感神経発達中に発現される。GATA2 と GATA3 は symN で表現され、DBH16がアクティブになります。転写因子 HAND2 は、DBH および TH17の発現および維持のためにも重要です。
HPSC(例えば、胚性および誘導多能性幹細胞)は、発達パラダイムを再現し、種々のヒト障害の疾患モデリングに使用できるsymNを生成する強力なツール18である。したがって、hPSCからsymNを生成する際には、発達ガイドラインに従い、分化プロセスに沿って適切なマーカーの発現を評価することが重要です。
以前の symN プロトコル これまでに hPSC19,20,,21から symN の生成を報告した研究グループはほとんどありません。20これらのプロトコルを相互に直接比較し、我々のプロトコルは、最近22を見直した。2016年23年には、symN文字を持つ自律神経細胞の生成のための分化プロトコルを発表しました(図1A)。このプロトコルは、未分化hPSCと細胞分化の両方で使用されたKSRベースの培地を使用しました。さらに、hPSCはマウス胚性線維芽細胞(MEFフィーダー細胞)上に維持された。我々は、障害23をモデル化するためにFD患者からこのプロトコルとPSCを採用しました.2019年には、この古いプロトコル24のより詳細なバージョンを説明しました。要約すると、神経運命は、最初の2日間でTGF-βおよびBMPシグナル伝達を遮断するために二重SMAD阻害25によって誘導された。CHIR99021を用いたWNT活性化は、神経前駆物質をNC細胞に昇格させた。11日目、細胞はCD49D++またはSOX10+集団26、23に対してFACSによってソートされ、23約40%のNC生成効率をもたらした。+したがって、分化の次のステップのための効率と純度を確保するためにソートが必要であった。NccはFGF2とCHIRの併用処理により、スフェロイドとして維持および増幅された。4日後、メンテナンスのNCスフェロイドをメッキし、BDNF、GDNF、およびNGFを与え、symN成熟を終了した。これらのsymNはASCL1、TH、DBH、およびPHOX2Aなどの強力なsymNマーカーを発現したが、ニコチン性アセチルコリン受容体(CHRNA3/CHRNB4)および小胞輸送体(VMAT1/2)の発現を含む、より成熟したsymNのマーカーは、70日後の分化後も低かった。このプロトコルのHOX遺伝子は正式に試験されておらず、細胞の電気生理学的活性を含む成熟した神経特性は検証されなかった。
ここでは、symN を生成するための最適化されたプロトコルを示します (図 1B)。HPSC は、エッセンシャル 8 (E8) メディア27を使用して、ビトロネクチン (VTN) コーティングされた皿のフィーダーフリー条件で維持されます。分化媒体の式は各段階で修正されており、NC母集団28の割合を増加させる。symN成熟はCD49D+/SOX10+ソートまたはソートされていないバルクNCC集団で行うことができます。どちらも30日目までに高レベルのsymNマーカー表現を示す。さらに、このプロトコルで生成されたsymNは、電気生理学的記録およびsymN活性化剤および阻害剤化合物を用いた治療に応答する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07 200 601 and 07 200 602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/20% O2 tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tissue culture tubes</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovation Cell Technologies</td>
			<td>AT104500</td>
			<td>Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108311</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ascl1 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556604</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304313</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD49D antibody (isotype)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400125</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 5 &#956;l/million cells in 100 &#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DAPI antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DBH antibody</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22806</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>Host: Chicken; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HOXC9 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365692</td>
			<td>Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NET1 antibody</td>
			<td>Mab</td>
			<td>NET17-1</td>
			<td>Host: Mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PRPH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-377093/H0112</td>
			<td>Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50839</td>
			<td>Host: Mouse; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101- 150</td>
			<td>Host: Rabbit; 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>Countess II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>57021&#38;5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration: 6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vial</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dbcAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Stock concentration: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 supplement</td>
			<td>gibco</td>
			<td>A15171-01</td>
			<td>Stock concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>M768-tMEA-96W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX (for FACS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios EQ (for sorting)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (blue filter cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (white cap)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Thomson et al., (1998)</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSCs</td>
			<td>Oh et al. (2016)</td>
			<td>H9-PHOX2B::eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin (FN)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher/Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Stock concentration: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN tank</td>
			<td>Custom Biogenic Systems</td>
			<td>V-1500AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA reader</td>
			<td>Axion BioSystems</td>
			<td>Maestro Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin I (LM)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-01</td>
			<td>Stock concentration: 25 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>Stock concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Stock concentration: 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotics)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANTPM1</td>
			<td>Stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td>Stock concentration: 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Stock concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris/R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN)</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>706308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td>Stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of postganglionic sympathetic neurons using human pluripotent stem cells under feeder-free and chemically defined culture conditions

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、疾患のモデル化やヒト胚発生の研究に役立つツールとなっています。我々は以前、自律神経障害患者に適用された交感神経を有する自律神経ニューロンの誘導のための分化プロトコルを提示した。しかし、このプロトコルは、ノックアウト血清置換(KSR)およびフィーダーベースの培養条件に基づいて構築され、高い分化効率を確保するために、細胞のソートが必要であった。これらの要因は、高い変動性、高コスト、および低い再現性を引き起こします。また、成熟した交感神経特性は、電気的活性を含めて、検証されていない。ここでは、PSC培養と分化がフィーダーフリーで化学的に定義された培養条件で行われる最適化されたプロトコルを提示する。幹神経堤を識別する遺伝子マーカーが同定される。ポストガンリオニック交感神経ニューロンへのさらなる分化は、細胞のソートを必要とせずに20日後に達成される。電気生理学的記録は、機能的ニューロン同一性をさらに示す。我々の分化されたニューロンから検出された発火はニコチンによって増強され、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールによって抑制することができる。このプロトコルにおける中間交感神経前駆物質は、最大2週間のニューラルスフェロイドとして維持することができ、培養の拡大を可能にする。要約すると、私たちの更新された交感神経分化プロトコルは、以前のバージョンと比較して、高い分化効率、より良い再現性、より柔軟性、およびより良い神経成熟を示しています。このプロトコルは、自律神経系に影響を与える人間の障害を研究するために必要な細胞を研究者に提供します。

このプロトコルでは、hPSC から symN を生成する方法について説明します。ここで示した培養条件は、以前に公開されたプロトコル23,24 (図 1A) からフィーダーフリーで化学的に定義された条件まで改善されました (図 1B)。2 つのオプションがあり、1 つは 20 日以内に symN を作成し、もう 1 つは NCC を 2 週間?...

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Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞からの交感神経の誘導を可能にする。これらの細胞は、科学者が交感神経系に影響を与える人間の障害を研究することを可能にする。この技術は、高いスケーラブルな効率で分割されたフィーダーフリーの会合条件における交感神経の導出を可能にする。それは20日で電気的に活性なニューロンをもたらす。この技術は、機能不全交感神経系に起因する疾患に適用することができ、また、疾患のモデル化、再生医療、および薬物スクリーニングに使用することができる。これらの細胞は、例えば心臓組織調節の研究のために、共培養系内の任意の組織を革新するためにin vitroを使用することができる。ヒト多能性幹細胞培養が80~90%の合流度に達すると、明るい縁が滑らかな大きなコロニーが観察されるべきである。分裂の場合は、37°Cと5%の二酸化炭素で0.25モルEDTAの4ミリリットルで細胞を処理する前にPBSで培養を洗浄します。2分後、10ミリリットルのE8媒体でプレートを洗い流し、剥離した細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。その後、新鮮なE8培地の9.5ミリリットルのアリコートに細胞の500マイクロリットルを転送します。そして、幹細胞を新しいビトロネクチンにプレートし、100ミリメートルの皿をコーティングしました。分化誘導の1日前に、6つのウェルプレートの適切な数を、ウェルあたり2ミリリットルの基基膜マトリックスでコーティングします。そして、一晩摂氏4度でプレートを保管します。翌朝、プレートを室温まで温め、洗浄ごとに新鮮なPBSでヒト多能性幹細胞培養を2回分割する準備を整えた。2回目の洗浄後、浮遊するヒト多能性幹細胞を吸引し、採取した細胞を50ミリリットルのチューブに移す前に、細胞培養インキュベーターで15分間、0.5ミリモルEDTAの7ミリリットルで細胞を処理します。PBSをチューブに均等に添加してEDTAを希釈し、遠心分離によって細胞を採取します。ペレットを01日分化培地の1ミリリットルで再懸濁してから、適切な量の培地を加えて会計処理を行います。細胞を1.25倍に10倍から5番目の細胞濃度/平方センチメートル濃度を、井戸当たりの分化培地のミリリットルに希釈します。前に準備した各ウェルから6つのウェルプレートに全ての基質膜マトリックス溶液を吸引する。その後、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種し、細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。翌朝、1日01分化培地を3ミリリットルで細胞に供給する。分化の2日目に、ウェルあたり2日目から10日目の分化培地の3ミリリットルで細胞を供給し、1日おきに10日目まで細胞を供給する。神経堤細胞をスフェロイドに凝集させるために、10日目にPBSで細胞を洗浄する。そして、各井戸に解離媒体の2ミリリットルを追加します。細胞培養インキュベーターで20分後、浮遊細胞を50ミリリットルの円錐状チューブに移し、新鮮なPBSでチューブ内の懸濁液の体積を50ミリリットルにします。遠心分離によって細胞を収集します。そして、ペレットを10〜14日の十分な体積でカウントするスフェロイド培地に再懸濁する。計数後、10~14日のスフェロイド培地を用いて500マイクロリットル濃度当たり50~5番目の細胞に細胞を5倍に希釈する。そして、超低い取り付け24ウェルプレートの各井戸に細胞の500マイクロリットルをプレート。次に細胞を培養インキュベーターに戻す。最小限のスフェロイド培養を誘導するために、培養の11日目に、10日から14日のスフェロイド培地を1ウェルあたり500マイクロリットル追加でニューラルクレストスフェロイドに供給する。12日目に、プレートを傾けて、プレートの片側に回転楕円体を蓄積します。そして、スフェロイドを吸引することなく、各ウェルからできるだけ多くの培地を慎重に吸引する。その後、1日10〜14回のスフェロイド培地を1ミリリットルでスフェロイドを供給します。拡大されたスフェロイド培養を誘導するために、15日目に、10日から14日の1.5ミリリットルのスフェロイド培地を10〜14個のスフェロイド培地に供給し、1回当たり0.5マイクロモルレチノイン酸を添加する。次に、スフェロイドを細胞培養インキュベーターに戻す。交感神経分化のために、14または28日目に、プレートを傾けてプレートの片側にスフェロイドを蓄積し、できるだけ多くの培地を慎重に吸引する。交感神経培地の1ミリリットルで細胞を供給します。大きなスフェロイド凝集体を小さなスフェロイドに分解するには、1ウェルあたり1ミリリットル以下の培地を添加し、スプフェロイドを5〜10回ピペットしてから分割します。そして、以前に調製した24ウェルプレートから過剰なラミニンフィブロネクチンを除去する。24ウェルスフェロイド培養プレートの各ウェルから、新しくコーティングされた24ウェルプレートの4つの別々のウェルの間で、プレートを1ミリリットルのスフェロイドを分割します。各井戸に新鮮な交感神経培地の250マイクロリットルを追加します。そして、細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。翌朝、各ウェルの培地を0.125ミクロモルレチノイン酸を添加した交感神経培地1ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。35日後、各ウェルの既存の培地の半分のみを新鮮な培地に慎重に置き換えることによってニューロンに餌を与える。分化の前に、ヒト多能性幹細胞コロニーは、光沢のある滑らかなエッジで丸く、ほとんど分化しない必要があります。細胞は4日目から10日目まで神経堤マーカーSox10を発現する。神経堤細胞は、6日目から見える濃い暗い尾根に現れます。これらの尾根はまたSox10を表現する。神経堤細胞の段階では、Sox10は細胞表面マーカーCD49Dと相関し、神経堤細胞をソートするために使用することができる。正のソートと未ソートの集団は、同様の方法で神経紋スフェロイドを生成しました。負の並べ替えられた細胞は適切に凝集しませんが、丸くて滑らかな健康的なスフェロイドを生成せず、3〜4日以内に死ぬ。さらに、神経紋スフェロイドを14日目に比較すると、神経堤および交感神経前駆細胞マーカーに対する定量的な逆転写酵素PCRは、並べ替え細胞と未ソート細胞との間に有意な差異を検出できない。20日目または35日目に、それぞれの最小または拡張プロトコルは、付随するスフェロイドから放射状パターンで成長する神経イドを観察することができる。ノルエピネフリンの合成と輸送に関連するマーカーは、この段階で発現され、Hox6は9つのトランク神経堤遺伝子を介して発現する。電気生理学的記録はまた20日目から神経活動を検出する。このような活性は、分化ニューロンの機能を調節する交感神経の自己受容体を標的とする薬物によって増強または抑制することができる。人間の支持者自身は、差別化のゼロ日から健康的でなければなりません。薬理学的阻害剤または活性化剤は、正常または病理学的行動を理解するためにニューロンに追加することができる。この方法は、ヒトから交感神経の生検を容易に得ることが可能になったため、交感神経生物学と病理を研究するための新しい道を開く。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...