Name: markerless gene deletion by floxed cassette allelic exchange mutagenesis in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud fra National Institute of Health, NIAID (tilskud A1065530 og Al124649), til KA Fields.

1. Design og samling af pSUmC-4.0 med Homology Arms Specific to the Gene of Interest
<ol><li>Identificer ~3 kb-regioner direkte opstrøms og nedstrøms for det gen, der er beregnet til sletning, der skal fungere som 5' og 3' homologiarme til homolog rekombination (figur 1).</li>
	<li>Design PCR primere til 1) forstærke 3 kb 5 'homology arm fra klamydial genomisk DNA og 2) indeholder en 15-30 bp udhæng er specifikke for pSUmC-4.0, når fordøjet på Sall begrænsning enzym site. Sørg for...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Incidence+and+Prevalence+of+Selected+Curable+Sexually+Transmitted+Infections:+2008:+World+Health+Organization.">Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).</li><li>Stephen, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Paradigm+of+Chlamydial+Pathogenesis.">The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis.</a> Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).</li><li>Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Frontiers+in+Type+III+Secretion+Biology:+the+Chlamydia+Perspective.">New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective.</a> Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).</li><li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+genomes+and+plasmids+within+Chlamydia+trachomatis+and+the+emergence+in+Sweden+of+a+new+variant+strain.">Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain.</a> BMC Genomics. 10, 239 (2009).</li><li>Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+obstacles+in+genetic+dissection+of+chlamydial+virulence.">Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).</li><li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+obligate+Intracellular+bacteria:+progress,+challenges+and+paradigms.">Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).</li><li>Rahnama, M., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Chlamydia:+current+approaches+and+impact+on+our+understanding+of+chlamydial+infection+biology.">Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology.</a> Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).</li><li>Kari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+targeted+Chlamydia+trachomatis+null+mutants.">Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).</li><li>LaBrie, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Mutagenesis+in+Chlmaydia+trachomatis+Identifies+CT339+as+a+ComEC+Homolog+Important+for+DNA+Uptake+and+Later+Gene+Transfer.">Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer.</a> mBio. 10 (4), 01343 (2019).</li><li>Johnson, C. M., Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+insertional+inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+using+a+group+II+intron.">Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron.</a> PLoS One. 8, 83989 (2013).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7, 01817 (2016).</li><li>Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floxed+cassette+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Enables+Markerless+Gene+Deletion+in+Chlamydia+trachomatis+and+can+Reverse+Cassette-Induced+Polar+Effects.">Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects.</a> Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).</li><li>Yarmolinsky, M., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THe+legacy+of+Nat+Sternberg:+the+genesis+of+Cre-lox+technology.">THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology.</a> Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).</li><li>McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Reveals+a+Role+for+Chlamydia+trachomatis+TmeA+in+Invasion+that+is+Independent+of+Host+AHNAK.">Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK.</a> Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+Plasmid-Encoded+Pgp4+is+a+Transcriptional+Regulator+of+Virulence-Associated+Genes.">Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes.</a> Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).</li><li>Silayeva, O., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibson+Assembly+facilitates+bacterial+allelic+exchange+mutagenesis.">Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis.</a> Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).</li><li>Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-Infected+Cells:+Directed+Trafficking+of+Golgi-Derived+Sphingolipids+to+the+Chlamydial+Inclusion.">Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li><li>Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+phenotypic+characterization+of+in+vitro-generated+Chlamydia+trachomatis+recombinants.">Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants.</a> BMC Microbiology. 13, 142 (2013).</li><li>Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin-resistant+RNA+polymerase+mutants+of+Chlamydia+trachomatis+remain+susceptible+to+the+ansamycin+rifalazil.">Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil.</a> Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).</li></ol>

Protokollen beskrevet her for generering af markørløs gensletninger i C. trachomatis af FLAEM giver mulighed for målrettet sletning af uvæsentlige gener og eliminerer kassette-induceret polareffekter. Protokollen bygger på omhyggelig udformning af 5 ' og 3 'homology arme indsat i pSUmC 4.0 selvmord vektor, effektiv transformation af C. trachomatis, og omhyggelig screening af isolerede mutant stammer. Vellykket genom teknik via denne metode resulterer i bakterier, der er nonfluorescerende og indehol...

Klamydia trachomatis er den hyppigste årsag til bakteriel seksuelt overførte sygdomme og udgør en betydelig byrde for menneskers sundhed. Over 100 millioner mennesker er smittet hvert år med C. trachomatis1. Ca. 70% af infektioner hos kvinder er asymptomatisk på trods af skadelige reproduktive sundhedsmæssige virkninger, såsom underlivsbetændelse, graviditet uden for livmoderen, og/ eller infertilitet. Sygdomsequela er direkte relateret til immunpatologi initieret af C. trachomatis infektion2. En effektiv vaccine er endnu ikke udviklet; Derfor er forståelse af funktionen af bakterielle virulens faktorer og andre bakterielle genprodukter et vigtigt og presserende forskningsspørgsmål.
Som intracellulære bakterier, vært celle invasion, intracellulære replikation, frigivelse af afkom, og unddragelse af vært immunologiske reaktioner er kritiske processer. C. trachomatis danner en parasitophorous membran bundet vacuole, kaldes en optagelse, for intracellulære udvikling. Etablering af inklusion og mange andre kritiske processer opnås ved udskillelse af effektorproteiner via et type III-sekreionssystem (T3SS)3. Det var i mange år begrænset at belyse disse udskillede effektorers funktioner på grund af C. trachomatis'genetiske uhåndterlighed. I modsætning til E. coligælder mange klassiske kloningsteknikker ikke for Klamydia. Et par store begrænsninger indebærer transformation effektivitet, mangel på kontravalg journalister såsom sacB, og plasmid vedligeholdelse. Mens E. coli plasmider generelt kan holdes på ubestemt tid med en oprindelse af replikation og passende selektivt tryk, C. trachomatis plasmids kræver yderligere otte åbne læserammer(pgp1-8) for vedligeholdelse, der findes på den indfødte pL2 plasmid i L2 serovar4.
I de seneste år har der været flere genetiske værktøjer genereret, der rummer Klamydia unikke biologi, men der er stadig begrænsninger5,6,7. Kemisk mutagenese ved ethyl metanulfonat (EMS) behandling kan indføre missense mutationer, eller (mindre hyppigt) kan resultere i nukleotid overgange indføre en for tidlig stop codon til at give en nonsens mutation8. Transposon indsættelse er effektiv til genforstyrrelser, men den nuværende teknologi i Klamydia forskning er besværlig og tidskrævende9. Både EMS behandling og transposon mutagenesis teknikker generere tilfældige mutationer og kræver strenge screening metoder til at isolere mutant stammer. En metode til at forstyrre gener ved indsættelse af gruppe II introner (f.eks TargeTron) giver mulighed for rettet mutagenesis; Denne metode er dog begrænset af effektivitet, og indsætningsstedet er ikke altid korrekt forudsagt10.
Fluorescensrapporterede allelic udveksling mutagenese (FRAEM) er en strategi, der anvendes til målrettet gensletning kombineret med indsættelse af en udvælgelse kassette giver antibiotikaresistens og en fluorescens reporter11. Men FRAEM kompliceres af potentialet i kassette-induceret polareffekter på downstream gener, især når de målretter gener inden for polycistronic operons. Floxed kassette allelic udveksling mutagenese (FLAEM) er en ny genetisk tilgang udviklet til at lindre kassette-induceret polære virkninger tidligere observeret med FRAEM udvælgelse kassette12. FLAEM udnytter Cre-loxP genom redigering for at fjerne udvælgelsen kassette og genoprette udtryk for downstream gener. Den udvælgelse kassette, der indeholder antibiotikaresistens og grønne fluorescerende protein (GFP) er reengineered med flankerende loxP sites. Disse loxP steder kan rekombinere i overværelse af Cre rekombinase og resultere i excision af kassetten fra genomet13. Denne strategi har vist sig at afhjælpe kassetteinducerede polære effekter , når tmeA målrettes med henblik på sletning12,14.
Både FRAEM og FLAEM metoder udnytte den samme selvmord vektor, pSUmC 4,0, som kan konditioneres gennem utilgængelige udtryk for pgp6. Udtryk for pgp6 har tidligere vist sig at være nødvendigt for plasmid fastholdelse og er derfor gearet til at kontrollere plasmid vedligeholdelse11,15. Når C. trachomatis dyrkes i medier suppleret med vandfri tetracyklin (aTc) for at fremkalde pgp6 udtryk, vektoren opretholdes. I mangel af aTc, er vektoren tabt. Målrettet gensletning opnås gennem allelic udveksling af genet til udvælgelsekassetten. De 3 kb regioner direkte opstrøms og nedstrøms for det målrettede gen tjene som homology arme til rekombination. Disse arme er klonet ind i pSUmC 4.0 vektor flankerende udvælgelsekassetten. Vellykket C. trachomatis transformation og rekombination begivenheder observeres gennem fluorescens rapportering. Udtryk for mCherry på vektoren rygrad og gfp i udvælgelsen kassette udbytte rød og grøn fluorescerende indeslutninger. Når aTc er fjernet fra kulturmedier, green-only indeslutninger indikerer en vellykket rekombination begivenheder med tabet af selvmord vektor og integration af udvælgelsen kassette i bakteriel genom.
FLAEM repræsenterer en forlængelse af FRAEM gennem efterfølgende omdannelse af en Cre rekombinase-udtrykkende vektor, pSU-Cre, i den nyoprettede mutant stamme. Cre rekombinase letter rekombination mellem loxP steder og excision af udvælgelsen kassette. Rekombinationshændelser er angivet via fluorescensrapportering. PSU-Cre vektor koder mCherry; Således er en vellykket transformation angivet ved tilsætning af rød fluorescens til gfp-udtrykkeindeslutninger. Dyrkning i mangel af selektivt tryk på kassetten resulterer i en sammenkættet rekombination på loxP-stederne, og tab af kassetten angives med ikke-omfattende indeslutninger. Som med pSUmC-4.0, utilgængelig udtryk for pgp6 bruges til betinget at opretholde pSU-Cre. Når aTc og antibiotika udvælgelse er fjernet, plasmid er helbredt, og den resulterende markørløs sletning stamme er nonfluorescerende. Denne metode omhandler spørgsmålet om kassette-induceret polareffekter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE Scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>233131000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7698-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dam-/dcm- Competent E. coli</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2925H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>4-X</td>
			<td>Sterile filtered cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8415-100G</td>
			<td>L-Glutamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Media #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Media #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 &#181;g/mL cycloheximide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1010S</td>
			<td>Small scale DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C3020K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Gibson Assembly Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3032-10MU</td>
			<td>Bioreagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Large scale DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0515</td>
			<td>Fragment PCR Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Containing 2mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sall-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sbfl-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3642S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection Media #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RMPI 10 % FBS, 1 &#181;g/mL cycloheximide, 500 &#181;g/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection Media #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RMPI 10 % FBS, 1 &#181;g/mL cycloheximide, 500 &#181;g/mL spectinomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection Media #3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 10 % FBS, 1 &#181;g/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 &#181;g/mL penicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td>3M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Outgrowth Medium</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B9020SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1KG</td>
			<td>Bioreagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td>Ultrapure grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td>Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

markerless gene deletion by floxed cassette allelic exchange mutagenesis in chlamydia trachomatis

Klamydia trachomatis er en forpligte intracellulær patogen, der har været historisk vanskeligt at genmanipulere. De endelige fremskridt med hensyn til at belyse de mekanismer, som C. trachomatis bruger til at skabe og opretholde en privilegeret intracellulær niche, har været begrænsede på grund af mangel på genetiske værktøjer. Heldigvis har der for nylig været flere nye fremskridt inden for genetiske manipulationteknikker. Blandt disse er udviklingen af fluorescensrapporterede allelic udveksling mutagenese (FRAEM). Denne metode giver mulighed for målrettet gensletning kombineret med indsættelse af en udvælgelsekassette kodning antibiotikaresistens og grøn fluorescerende protein (GFP). Afhængighed af denne strategi kan være kompliceret, når de målretter mod gener inden for polycistroniske operoner på grund af potentialet i polære virkninger på downstream-gener. Floxed kassette allelic udveksling mutagenese (FLAEM), protokollen for hvilken er beskrevet her, blev udviklet til at lindre kassette-induceret polareffekter. FLAEM udnytter Cre-loxP genom redigering for at fjerne udvælgelsen kassette efter målrettet sletning ved allelic udveksling. De resulterende stammer indeholder markørløse gensletninger af en eller flere kodningssekvenser. Denne teknik letter direkte vurdering af genfunktion og udvider repertoiret af værktøjer til genetisk manipulation i C. trachomatis.

Metoden til markørløs gensletning i C. trachomatis ved hjælp af FLAEM er afhængig af omhyggelig kloning og transformationteknikker. Vellykket allelic rekombination er et vigtigt første skridt og kræver identifikation og indsættelse af homology arme i pSUmC-4.0 kloning vektor (Figur 1). Et vigtigt andet skridt for markørløs gensletning er fjernelse af fluorescens reporter og antibiotika udvælgelse kassette af Cre-lox genom redigering, repræsenteret i f...

Watch this Scientific Journal Video about Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Beskrevet her er en metode til målrettet, markørløs gensletning i Klamydia trachomatis ved hjælp af floxed kassette allelic udveksling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Sletning af Floxed Kassette Allelic Exchange Mutagenesis i Klamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Floxed kassette allel udveksling mutagenese er en vigtig metode, fordi gensletning er et værdifuldt værktøj, der kan udnyttes til at forstå funktionen af genprodukter. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for målrettet gensletning uden at påføre polære virkninger på downstream gener. Identificer ca. tre kilobaseregioner direkte opstrøms og nedstrøms for det gen, der er målrettet til sletning, og som skal fungere som de fem primære og tre primære homologiarme til homolog rekombination og tildele primere som angivet i tekstprotokollen.Forstærke de tre kilobase fem prime og tre prime homologi arme fra friskudvundet klamydial genomisk DNA ved PCR i en eller to reaktioner til at give nok fragment til senere DNA samling. Efter rensning og koncentration af PCR-fragmenterne som beskrevet i tekstprotokollen skal du fordøje 500 nanogram pSUmC-4.0-vektor i en 20 mikroliterreaktion med en enhed af celle 1 og en enhed af SBF en i henhold til producentens protokol. Kombiner den fordøjede og rensede pSUmC-4.0 vektor og både de fem prime og tre prime homologi arm PCR produkter sammen i et forhold på 0,01 picomoles vektor til 0,09 picomoles af hver homologi arm.Fragmenterne samles i en DNA-enhedsreaktion i henhold til fabrikantens protokol. Transformer 50 mikroliter af elektrokompetent E.coli med en mikroliter af DNA-monteringsreaktionen. Plade den transformerede E.coli på LB agar plader, der indeholder 100 mikrogram pr milliliter spectinomycin.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag, skærm kolonier for grøn og rød fluorescens ved hjælp af en epifluorescens inverteret mikroskop. Der forventes i alt fem til 30 kolonier pr. agarplade.Efter en dag-til-dag væskekultur inkubation af de valgte kolonier skal du bekræfte indsættelsen af hver homologiarm i vektoren ved hjælp af PCR-screeningprimatorerne for at forstærke hver indsættelse. Seed McCoy celler, som er mus fibroblaster typisk anvendes til at dyrke Klamydia i to seks-brønd plader som beskrevet i tekstprotokollen. I et 1,5 milliliterrør tilsættes C.trachomatis wild-type serovar L2 elementære organer, eller EBs, ved et volumen, der er tilstrækkeligt til at inficere 12 brønde af en seks-brønd plade på en MOI af to.Pellet eBs på mere end 20, 000 gange g i 30 minutter og kassér supernatant. Initier klamydial transformation ved forsigtigt at opslænnes eBs i 600 mikroliter af calciumchlorid buffer. Derefter tilsættes 12 mikrogram pSUmC-4,0 plus homologi arme til røret og bland forsigtigt opløsningen ved at svippe.Inkuber røret ved stuetemperatur i 30 minutter svippede for at blande hvert 10. Tilsættes transformationsløsningen til 24 milliliter HBSS og blandes forsigtigt ved forsigtigt pipettering. Overfør to milliliter af inokulumet til hver brønd af sammenløbet McCoy celler i de seks-brønd plader.Inficere ved centrifugering ved 900 gange g i en time ved 20 grader Celsius. Fjern inokulum og erstatte med to milliliter pr godt RPMI vækst medier nummer to. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Efter mindst syv timer, men ikke mere end 12 timer, erstatte medierne med to milliliter pr brønd af udvælgelse medier nummer et. Fortsæt inkubationen ved 37 grader Celsius i 48 timer fra infektionstidstids gang. Høst og passage bakterierne på en frisk monolag af McCoy celler ved hjælp af en celle skraber til forsigtigt skrabe McCoy monolayer at løfte cellerne ind i medierne.Materialet overføres fra hvert brønd til et to milliliterrør. Pellet cellematerialet ved større end 20,000 gange g i en mikrocentrifuge i 30 minutter ved fire grader Celsius. Efter udsmid af supernatanten skal cellepelleten resuspenderes i en milliliter HBSS ved forsigtigt at pipettere.Pellet cellen vragrester ved 200 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til en frisk brønd af sammenløbsdemørkeceller. Tilføj en ekstra en milliliter HBSS til hver brønd for et samlet volumen på to milliliter pr brønd.Inficere ved centrifugering ved 900 gange g i en time ved 20 grader Celsius. Udskift inokulumet med markeringsmedie nummer et umiddelbart efter infektionen. Fortsæt med at overføre bakterierne til et frisk monolag af McCoy-celler hver 48.Når der registreres røde og grønne indeslutninger, skal du fortsætte med at overføre monolaget, som før du bruger markeringsmedie nummer to. Fortsætte med at overføre monolaget, indtil der registreres optagelse af grønlig optagelse 24 timer efter infektionen, hvilket indikerer tabet af pSUmC-4.0-vektoren og inkorporering af loxP-udvælgelseskassetten i genomet. Høst og fryse de grønne kun indeslutninger i SPG.Berig optagelse af grøn og grøn til en MOI på mellem 0,5 og 1,0, og høst monolagene i SPG som beskrevet i teksten. Få aliquots af 50 mikroliter i 1,5 milliliter rør og fryse ved minus 80 grader Celsius. Frø en 384-godt væv kultur plade med McCoy celler som beskrevet i tekstprotokollen.En aliquot af bakterier, der kun er af grøn, fortyndes i HBSS for at opnå ca. 50 EBs pr. 20 milliliter. Overfør det fortyndede inokulum til en beholderbakke. Fjern mediet fra 384-brøndpladen af sammenløbet McCoy-celler ved at svippe hele pladen på hovedet i en affaldsbeholder.Ved hjælp af en multikanalpipette tilsættes 50 mikroliter C.trachomatis inoculum til hver brønd. Inficere ved centrifugering ved 900 gange g i en time ved 20 grader Celsius. Fjern inokulumet ved at svippe og erstatte med 50 mikroliter pr. brønd af vækstmedie nummer to.Inkuber pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Efter inkubering af pladen i fem til 12 dage identificeres individuelle brønde med grønne fluorescerende indeslutninger ved hjælp af et epifluorescensinverteret mikroskop eller en screeningplatform med højt indhold. Høst brønde med grøn-only indeslutninger ved at skrabe monolayer med en P10 spids.Hele brøndens indhold overføres til et rør med to milliliter HBSS. Bland forsigtigt de to milliliter inokulum på et frisk sammenløb McCoy monolayer i en seks-brønd plade til infektion. Berige, fryse, og titer klonale populationer.Bekræft sletning af målrettede gener fra klonisk isolerede C.trachomatis ved hjælp af kvantitative PCR. Gentag transformationsprocessen ved hjælp af den klonalt isolerede C.trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vektor, og udvælgelse medier nummer tre. Passage monolaget indtil rød-only indeslutninger er opdaget, som indikerer tab af udvælgelsen kassette.Klonalt isolere rød-only indeslutninger ved at begrænse fortynding i en 384-brønd plade som før. Berig klonale populationer ved at passere indtil en MOI på 0,1. Når beriget, erstatte udvælgelsen medier med vækstmedier nummer to for at indlede tabet af pSU-Cre vektor.Klonisk isolere ikke-fluorescerende bakterier som før. Scan dog pladen manuelt med et Brightfield-mikroskop for at detektere indeslutninger. Berige og fryse bakterierne.Screen for den mutante stamme ved hjælp af kvantitative real-time PCR, Western blotting, og hele genom DNA sekventering som tidligere beskrevet. Repræsentative data vises, hvor tmeA er målrettet mod gensletning. C.trachomatis tmeaA sletning stamme genereres ved hjælp af FRAEM og C.trachomatis tmeA-lx stamme genereres ved hjælp af FLAEM.Relative DNA kopi numre af tmeA og downstream tmeB, gfp indeholdt på pSUmC-4.0 udvælgelse kassette, og cre indeholdt på pSU-Cre vektor er alle vist. Begge mutant stammer indeholder en sletning af tmeA locus. TmeA-lx indeholder dog ikke udvælgelseskassetten som angivet ved fraværet af gfp DNA.TmeA mutantstammen har nedsat ekspression af tmeB som vist ved mRNA- og proteinniveauer. Når FLAEM bruges til at generere tmeA-lx mutant stamme, at udtrykket af tmeB er genoprettet som detekteres af mRNA og protein niveauer. Omhyggelig konstruktion af pSUmC vektor med homologi arme er afgørende for målrettet sletning af gener.Der skal tages tid for at sikre nøjagtig vektorsamling før klamydial transformation. FLAEM har givet forskerne et værktøj til at studere specifikke gener og foretage målrettede sletninger uden at have nedsat udtryk for off target gener, som kan forvirre undersøgelser. C.trachomatis sletning mutanter genereret af FLAEM kan udnyttes til at studere en række aspekter af klamydial biologi, herunder udviklingsmæssige og patogene mekanismer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetiske tilgange i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay til Typing af stafylokokker Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Methicillin-resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserede Flowcytometri Assay til måling cytotoksisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Brug fluorescerende proteiner til at visualisere og kvantificere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vækst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifikation af nye gener forbundet med Alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Brug Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-medieret mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifikation af sjældne bakterielle patogener ved 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

En metode til at vurdere Fc-medieret effektor funktion induceret af Influenza Hemagglutinin specifikke antistoffer

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...