Name: markerless gene deletion by floxed cassette allelic exchange mutagenesis in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Public Health Service bidrag från National Institute of Health, NIAID (bidrag A1065530 och Al124649), till KA Fields.

1. Design och montering av pSUmC-4.0 med homologi vapen specifika för genen av intresse
<ol><li>Identifiera ~ 3 kb regioner direkt uppströms och nedströms av genen riktade för radering att fungera som 5 och 3 homologi armar för homolog rekombination(figur 1).</li>
	<li>Design PCR primers till 1) förstärka 3 kb 5 homology arm från klamydial genomiska DNA och 2) innehåller en 15-30 bp överhäng som är specifika för pSUmC-4.0 när smält på Sall begränsning enzym webbplats. Se t...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Incidence+and+Prevalence+of+Selected+Curable+Sexually+Transmitted+Infections:+2008:+World+Health+Organization.">Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).</li><li>Stephen, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Paradigm+of+Chlamydial+Pathogenesis.">The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis.</a> Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).</li><li>Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Frontiers+in+Type+III+Secretion+Biology:+the+Chlamydia+Perspective.">New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective.</a> Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).</li><li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+genomes+and+plasmids+within+Chlamydia+trachomatis+and+the+emergence+in+Sweden+of+a+new+variant+strain.">Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain.</a> BMC Genomics. 10, 239 (2009).</li><li>Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+obstacles+in+genetic+dissection+of+chlamydial+virulence.">Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).</li><li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+obligate+Intracellular+bacteria:+progress,+challenges+and+paradigms.">Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).</li><li>Rahnama, M., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Chlamydia:+current+approaches+and+impact+on+our+understanding+of+chlamydial+infection+biology.">Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology.</a> Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).</li><li>Kari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+targeted+Chlamydia+trachomatis+null+mutants.">Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).</li><li>LaBrie, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Mutagenesis+in+Chlmaydia+trachomatis+Identifies+CT339+as+a+ComEC+Homolog+Important+for+DNA+Uptake+and+Later+Gene+Transfer.">Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer.</a> mBio. 10 (4), 01343 (2019).</li><li>Johnson, C. M., Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+insertional+inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+using+a+group+II+intron.">Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron.</a> PLoS One. 8, 83989 (2013).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7, 01817 (2016).</li><li>Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floxed+cassette+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Enables+Markerless+Gene+Deletion+in+Chlamydia+trachomatis+and+can+Reverse+Cassette-Induced+Polar+Effects.">Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects.</a> Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).</li><li>Yarmolinsky, M., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THe+legacy+of+Nat+Sternberg:+the+genesis+of+Cre-lox+technology.">THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology.</a> Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).</li><li>McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Reveals+a+Role+for+Chlamydia+trachomatis+TmeA+in+Invasion+that+is+Independent+of+Host+AHNAK.">Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK.</a> Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+Plasmid-Encoded+Pgp4+is+a+Transcriptional+Regulator+of+Virulence-Associated+Genes.">Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes.</a> Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).</li><li>Silayeva, O., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibson+Assembly+facilitates+bacterial+allelic+exchange+mutagenesis.">Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis.</a> Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).</li><li>Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-Infected+Cells:+Directed+Trafficking+of+Golgi-Derived+Sphingolipids+to+the+Chlamydial+Inclusion.">Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li><li>Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+phenotypic+characterization+of+in+vitro-generated+Chlamydia+trachomatis+recombinants.">Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants.</a> BMC Microbiology. 13, 142 (2013).</li><li>Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin-resistant+RNA+polymerase+mutants+of+Chlamydia+trachomatis+remain+susceptible+to+the+ansamycin+rifalazil.">Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil.</a> Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).</li></ol>

Protokollet beskrivs här för generering av markörlösa genborttagningar i C. trachomatis av FLAEM möjliggör riktad borttagning av onödiga gener och eliminerar kassettinducerade polareffekter. Protokollet bygger på noggrann utformning av 5 och 3 homologi armar in i pSUmC 4.0 självmord vektor, effektiv omvandling av C. trakomat, och noggrann screening av isolerade mutantstammar. Framgångsrik genomteknik via denna metod resulterar i bakterier som är nonfluorescent och innehåller en enda loxP...

Klamydia trachomatis är den vanligaste orsaken till bakteriell sexuellt överförbara sjukdomar och utgör en betydande börda för människors hälsa. Över 100 miljoner människor är smittade varje år med C. trachomatis1. Cirka 70% av infektionerna hos kvinnor är asymtomatiska trots skadliga reproduktiva hälsoeffekter, såsom bäckeninflammation, utomkvedshavandeskap och/eller infertilitet. Disease sequela är direkt relaterade till immunpatologi initieras av C. trachomatis infektion2. Ett effektivt vaccin har ännu inte utvecklats. Därför är förståelse n hos bakteriellvirulensfaktorer och andra bakteriegenprodukter en viktig och brådskande forskningsfråga.
Som intracellulära bakterier, värdcellinvasion, intracellulär replikering, frisättning av avkomma och undanflykter av värdimmunologiska svar är kritiska processer. C. trasrör bildar ett parasitoforous membran bundet vacuole, kallas en inkludering, för intracellulär utveckling. Upprättandet av inkluderingen och många andra kritiska processer uppnås genom utsöndring av effektellerproteiner via ett sekretsystem av typ III (T3SS)3. Belysa funktionerna hos dessa utsöndrade effektorer var begränsad i många år på grund av den genetiska intractability av C. trasomat. Till skillnad från E. coliär många klassiska kloningstekniker inte tillämpliga på Klamydia. Några stora begränsningar innebär omvandling effektivitet, brist på motval reportrar såsom sacB, och plasmid underhåll. Medan E. coli plasmider i allmänhet kan upprätthållas på obestämd tid med ett ursprung i replikering och lämpligt selektivt tryck, C. traomatis plasmider kräver ytterligare åtta öppna läsramar(pgp1-8) för underhåll som finns på den ursprungliga pL2 plasmid inom L2 serovar4.
Under de senaste åren har det förekommit flera genetiska verktyg som har genererats som rymmer Chlamydia unika biologi, men det finns fortfarande begränsningar5,6,7. Kemisk mutagenes genom etylmetanulfonat (EMS) behandling kan införa missense mutationer, eller (mindre ofta) kan resultera i nukleotid övergångar införa en för tidig stopp kodon att ge en nonsens mutation8. Transposon insättning är effektiv för genstörningar, men nuvarande teknik i Klamydia forskning är mödosam och tidskrävande9. Både EMS behandling och transposon mutagenesis tekniker generera slumpmässiga mutationer och kräver rigorösa screening metoder för att isolera mutanta stammar. En metod för att störa gener genom införande av grupp II-introner (t.ex. TargeTron) möjliggör riktad mutagenes; Denna metod begränsas dock av effektivitet och insättningsplatsen är inte alltid korrekt förutspådd10.
Fluorescensrapporterade allelic utbyte mutagenes (FRAEM) är en strategi som används för riktade genborttagning i kombination med införandet av ett urval kassett som ger antibiotikaresistens och en fluorescens reporter11. Ändå kompliceras FRAEM av risken för kassettinducerade polareffekter på gener i efterföljande led, särskilt när gener inom polycistroniska operoner riktar sig. Floxed kassettallelutbyte (FLAEM) är en ny genetisk metod som utvecklats för att lindra de kassetter-inducerade polareffekter som tidigare observerats med FRAEM urvalkassetten12. FLAEM använder Cre-loxP genomredigering för att ta bort urvalkassetten och återställa uttryck för nedströms gener. Urvalskassetten som innehåller antibiotikaresistens och grönt fluorescerande protein (GFP) omkonstrueras med flankerande loxP-platser. Dessa loxP-platser kan kombineras i närvaro av Cre rekombinas och resultera i excision av kassetten frångenomet 13. Denna strategi har visat sig lindra kassettinducerade polareffekter när man riktar sig till tmeA för radering12,14.
Både FRAEM och FLAEM metoder använder samma självmord vektor, pSUmC 4.0, som kan villkorligt upprätthållas genom inducerbara uttryck för pgp6. Uttryck för pgp6 har tidigare visat sig vara nödvändigt för plasmid retention och är därför utnyttjas för att kontrollera plasmid underhåll11,15. När C. trasomat odlas i media kompletteras med vattenfri tetracyklin (aTc) för att inducera pgp6 uttryck, vektorn upprätthålls. I avsaknad av aTc, är vektorn förlorad. Riktad genborttagning uppnås genom allelic utbyte av genen för valet kassett. De 3 kb regionerna direkt uppströms och nedströms av den riktade genen fungera som homologi armar för rekombination. Dessa armar klonas in i pSUmC 4.0 vektor flankerande valet kassett. Framgångsrika C. trasrör omvandling och recombination händelser observeras genom fluorescens rapportering. Uttryck för mCherry på vektorn stamben och gfp inom valet kassett avkastning röda och gröna fluorescerande inneslutningar. När aTc tas bort från kulturmedia, grön-bara inneslutningar indikeraframgångsrika rekombination händelser med förlusten av självmord vektor och integration av valet kassett i bakteriegenomet.
FLAEM representerar en förlängning av FRAEM via efterföljande omvandling av en Cre rekombinas-uttrycka vektor, pSU-Cre, i den nyskapade mutant stam. Cre rekombinas underlättar rekombination mellan loxP-platser och excision av urvalskassetten. Rekombinationshändelser anges via fluorescensrapportering. PSU-Cre vektor kodar mCherry; således indikeras framgångsrik omvandling genom tillägg av röd fluorescens till gfp-uttryckainkluderingar. Odling i avsaknad av selektivt tryck för kassetten resulterar i kremedierad kombination på loxP-platserna, och förlust av kassetten indikeras av endast röda inkluderingar. Som med pSUmC-4.0 används inducerbart uttryck för pgp6 för att villkorligt upprätthålla pSU-Cre. När aTc och antibiotika urval tas bort, plasmid botas, och den resulterande markörlösa borttagning stam är nonfluorescerande. Den här metoden åtgärdar problemet med kassettinducerade polareffekter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE Scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>233131000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7698-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dam-/dcm- Competent E. coli</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2925H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>4-X</td>
			<td>Sterile filtered cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8415-100G</td>
			<td>L-Glutamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Media #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Media #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 &#181;g/mL cycloheximide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1010S</td>
			<td>Small scale DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C3020K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Gibson Assembly Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3032-10MU</td>
			<td>Bioreagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Large scale DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0515</td>
			<td>Fragment PCR Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Containing 2mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sall-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sbfl-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3642S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection Media #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RMPI 10 % FBS, 1 &#181;g/mL cycloheximide, 500 &#181;g/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection Media #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RMPI 10 % FBS, 1 &#181;g/mL cycloheximide, 500 &#181;g/mL spectinomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection Media #3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 10 % FBS, 1 &#181;g/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 &#181;g/mL penicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td>3M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Outgrowth Medium</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B9020SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1KG</td>
			<td>Bioreagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td>Ultrapure grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td>Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

markerless gene deletion by floxed cassette allelic exchange mutagenesis in chlamydia trachomatis

Klamydia trachomatis är en obligate intracellulär patogen som historiskt har varit svårt att genetiskt manipulera. Definitiva framsteg i att belysa de mekanismer som C. trachomatis använder för att skapa och upprätthålla en privilegierad intracellulär nisch har begränsats på grund av brist på genetiska verktyg. Lyckligtvis har det nyligen gjorts flera nya framsteg inom genetisk manipulation stekniker. Bland dessa är utvecklingen av fluorescens-rapporterade allelic utbyte mutagenes (FRAEM). Denna metod möjliggör riktad genborttagning i kombination med införandet av ett urval kassett kodning antibiotikaresistens och grönt fluorescerande protein (GFP). Beroendet av denna strategi kan vara komplicerat när man riktar gener inom polycistroniska operoner på grund av polareffekternas potential på gener i efterföljande led. Floxed kassettallelic utbyte mutagenes (FLAEM), det protokoll som beskrivs här, har utvecklats för att lindra kassett-inducerad polareffekter. FLAEM använder Cre-loxP genomredigering för att ta bort valet kassett efter riktad borttagning av allelic utbyte. De resulterande stammarna innehåller markörlösa genborttagningar av en eller flera kodningssekvenser. Denna teknik underlättar direkt bedömning av genfunktion och utökar repertoar av verktyg för genetisk manipulation i C. traomat.

Metoden för markörlös genborttagning i C. trachomatis med FLAEM är beroende av noggrann kloning och omvandling tekniker. Framgångsrik allelisk rekombination är ett viktigt första steg och kräver identifiering och införande av homologi armar i pSUmC-4.0 kloning vektor(figur 1). Ett viktigt andra steg för markörlös genborttagning är avlägsnande av fluorescens reporter och antibiotika urval kassett av Cre-lox genomredigering, representerade i figur 2<...

Watch this Scientific Journal Video about Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Beskrivs här är en metod för riktade, markörlösa genborttagning i Chlamydia trachomatis med floxed kassett allelisk utbyte mutagenes, FLAEM.

Märklös genborttagning av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Floxed kassett allelic utbyte mutagenesis är en viktig metod eftersom genen borttagning är ett värdefullt verktyg som kan utnyttjas för att förstå funktionen av genprodukter. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter riktade genradering utan att orsaka polareffekter på nedströms gener. Identifiera ungefär tre kilobase regioner direkt uppströms och nedströms av genen som är riktade för borttagning att fungera som de fem främsta och tre främsta homohomology armarna för homolog rekombination och tilldela primers som anges i textprotokollet.Förstärka de tre kilobase fem främsta och tre främsta homologi armar från nyutvunna chlamydial genomisk DNA av PCR i en eller två reaktioner för att ge tillräckligt fragment för senare DNA-montering. Efter renande och koncentrera PCR-fragmenten som beskrivs i textprotokollet, smälta 500 nanogram pSUmC-4.0 vektor i en 20 microliter reaktion med en enhet av cell ett och en enhet av SBF en enligt tillverkarens protokoll. Kombinera den smälta och renade pSUmC-4.0 vektor och både de fem främsta och tre främsta homologi arm PCR produkter tillsammans vid ett förhållande av 0,01 picomoles vektor till 0,09 picomoles av varje homology arm.Montera fragmenten i en DNA-monteringsreaktion enligt tillverkarens protokoll. Förvandla 50 mikroliter av elektrokompetent E.coli med en mikroliter av DNA-monteringsreaktionen. Platta de transformerade E.coli på LB-agarplattor som innehåller 100 mikrogram per milliliter spectinomycin.Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius över natten. Nästa dag, skärm kolonier för grön och röd fluorescens med hjälp av en epifluorescens inverterat mikroskop. Totalt fem till 30 kolonier per agarplatta förväntas.Efter en flytande odlingsinkubation över natten av de valda kolonierna, bekräfta insättning av varje homologiarm i vektorn med hjälp av PCR-screeningprimrar för att förstärka varje insättning. Frö McCoy celler som är mus fibroblaster vanligtvis används för att odla Klamydia i två sex-brunn plattor som beskrivs i textprotokollet. I en 1,5 milliliter rör, tillsätt C.trachomatis vild-typ serovar L2 elementära organ, eller EBs, på en volym som är tillräcklig för att infektera 12 brunnar av en sex-brunnsplatta vid en MOI av två.Pellet de EBs på större än 20, 000 gånger g i 30 minuter och kasta supernatanten. Initiera chlamydial omvandling genom att försiktigt resuspending de EBs i 600 mikroliter av kalciumklorid buffert. Tillsätt sedan 12 mikrogram pSUmC-4.0 plus homologi armar till röret och blanda försiktigt lösningen genom att snärta.Inkubera röret i rumstemperatur i 30 minuter snärta att blanda var 10 minuter. Tillsätt omvandlingslösningen till 24 milliliter HBSS och blanda genom att försiktigt pipettera. Överför två milliliter av inokulat till varje brunn av konfluenta McCoy-celler i sex-brunnsplattorna.Infektera genom centrifugering vid 900 gånger g i en timme vid 20 grader Celsius. Ta bort inokulat och ersätt med två milliliter per brunn RPMI tillväxt media nummer två. Inkubera plattorna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid.Efter minst sju timmar men inte mer än 12 timmar, ersätta media med två milliliter per brunn av urval media nummer ett. Fortsätt inkubationen vid 37 grader Celsius i 48 timmar från infektionssyssen. Harvest och passage bakterierna på en färsk monolayer av McCoy celler med hjälp av en cell skrapa för att försiktigt skrapa McCoy monolayer att lyfta cellerna i media.Överför materialet från varje brunn i ett två milliliterrör. Pellet cellmaterialet vid större än 20, 000 gånger g i en mikrocentrifug i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Efter att supernatanten kasserats, återbehagt cellpelletsen i en milliliter av HBSS genom att försiktigt pipettera.Pellet cellen skräp på 200 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Överför supernatanten till en färsk brunn av konfluenta McCoy-celler. Tillsätt ytterligare en milliliter HBSS till varje brunn för en total volym på två milliliter per brunn.Infektera genom centrifugering vid 900 gånger g i en timme vid 20 grader Celsius. Ersätt inokulat med urvalsmedia nummer ett omedelbart efter infektion. Fortsätt passaging bakterierna på en färsk monolayer av McCoy celler var 48 timmar tills röda och gröna inneslutningar upptäcks med hjälp av en epifluorescens inverterad mikroskop 24 timmar efter infektion.När röda och gröna inneslutningar har upptäckts fortsätter du passaging av monolayer som innan du använder urvalsmedia nummer två. Fortsätt passaging den monolayer tills grön-bara inneslutningar upptäcks 24 timmar efter infektion som indikerar förlusten av pSUmC-4.0 vektor och införlivande av loxP urval kassetten i arvsmassan. Skörda och frysa de inkluderingen med enbart grönt i SPG.Berika inkluderingen med endast grönhet till en MOI på mellan 0,5 och 1,0 och skörda monolayersna till SPG enligt beskrivningen i texten. Erhåll alikvoter på 50 mikroliter i 1,5 milliliterrör och frys vid minus 80 grader Celsius. Frö en 384-väl vävnad kultur tallrik med McCoy celler som beskrivs i textprotokollet.Späd en alikvot av bakterier med enbart grön energi i HBSS för att uppnå cirka 50 EBs per 20 milliliter. Överför det utspädda inokulatet till en reservoarbricka. Ta bort media från 384-brunnsplattan med konfluenta McCoy-celler genom att snärta hela plattan upp och ner i en avfallsbehållare.Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt 50 mikroliter av C.trachomatis inokulat till varje brunn. Infektera genom centrifugering vid 900 gånger g i en timme vid 20 grader Celsius. Ta bort inokulat genom att snärta och ersätt med 50 mikroliter per brunn av tillväxtmedia nummer två.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Efter inkuberingen av plattan i fem till 12 dagar, identifiera enskilda brunnar med gröna fluorescerande inneslutningar med hjälp av ett epifluorescens inverterat mikroskop eller en hög halt screening plattform. Skörda brunnar med inneslutningar med endast grön färg genom att skrapa enskiktet med en P10-spets.Överför hela innehållet i brunnen i ett rör som innehåller två milliliter hbss. Blanda försiktigt och applicera de två milliliter av inokulat på en färsk konfluent McCoy monolayer i en sex-väl platta för infektion. Berika, frysa, och titer klonala populationer.Bekräfta borttagning av riktade gener från clonally isolerade C.trachomatis med hjälp av kvantitativa PCR. Upprepa omvandlingsprocessen med hjälp av den klonally isolerade C.trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vektor och urval media nummer tre. Passagen monolayeren, tills röd-only inkluderingen är upptäckta vilket indikerar förlust av valet kassetten.Clonally isolera röd-bara inneslutningar genom att begränsa utspädning i en 384-well platta som tidigare. Berika kloniska populationer genom att passaging tills en MOI på 0,1. När berikat, ersätta urvalet media med tillväxt media nummer två för att inleda förlusten av pSU-Cre vektor.Clonally isolera icke-fluorescerande bakterier som tidigare. Men manuellt skanna plattan med en Brightfield mikroskop för att upptäcka inneslutningar. Berika och frysa bakterierna.Skärm för mutantstammen med hjälp av kvantitativ realtids-PCR, Western blotting och hela genomETAD sekvensering som tidigare beskrivits. Representativa data visas i vilka tmeA är riktade för genradering. C.trachomatis tmeaA borttagning stam genereras med hjälp av FRAEM och C.trachomatis tmeA-lx stammen genereras med hjälp av FLAEM.Relativa DNA-kopia nummer av tmeA och nedströms tmeB, gfp finns på pSUmC-4.0 urval kassett, och cre som finns på pSU-Cre vektorn är alla visas. Båda mutant stammar innehåller en borttagning av tmeA locus. TMEA-lx innehåller dock inte urvalskassetten som anges av frånvaron av gfp-DNA.TmeA mutantstammen har minskat uttryck för tmeB som visas av mRNA och proteinnivåer. När FLAEM används för att generera tmeA-lx mutant stam, är det uttrycket av tmeB återställs som detekteras av mRNA och proteinnivåer. Noggrann konstruktion av pSUmC vektor med homologi armar är viktigt för riktade borttagning av gener.Tid bör tas för att säkerställa korrekt vektor montering före chlamydial omvandling. FLAEM har gett forskare ett verktyg för att studera specifika gener och göra riktade borttagningar utan att ha minskat uttryck för off mål gener som kan förvirra studier. C.trachomatis borttagning mutanter som genereras av FLAEM kan utnyttjas för att studera en mängd aspekter av chlamydial biologi inklusive utvecklingsmässiga och patogena mekanismer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Transfektion och Mutagenes av mål gener i Mosquito celler genom Låst nukleinsyra-modifierade oligonukleotider

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Framåt genetiska metoder i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR-analys f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifiering av nya gener associerade med alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Med hjälp av Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon mutagenes

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifiering av sällsynta mängden sjukdomsalstrande bakterier från 16S rRNA Gene sekvensering och MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

En metod för att bedöma Fc-medierad effektor funktioner induceras av influensa Hemagglutinin specifika antikroppar

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...