7.4K Views
•
10:29 min
•
March 16th, 2020
DOI :
March 16th, 2020
•0:05
Introduction
1:28
Observation of Axon Morphology During Axon Death in the PNS (Peripheral Nervous System)
3:22
Observation of Axon and Synapse Morphology During Axon Death in the CNS (Central Nervous System)
7:56
Results: Axon Death of GFP-Labeled Sensory Neuron Axons and Axonal/Synaptic Function After Axotomy
9:40
Conclusion
5:53
Grooming Induced by Optogenetics as a Readout for Axon and Synapse Function
Transcript
Det overordnede mål med denne Drosophila skade protokol er at observere både bevarelsen af axonal og synaptisk morfologi, samt synaptisk funktion af axoner og deres synapser. Disse analyser kan også bruges til at karakterisere neuronal vedligeholdelse faktorer, undersøgelse axonal transport, eller analysere axonale organeller i intakt axoner. Den delvise vingeskade assay giver mulighed for observation af sårede axoner under degeneration side om side med uskadte kontrol axoner inden for samme nerve bundt i Drosophila fløj.
Denne skade assay kan let praktiseres på forhånd i vilde-type fluer ved at anvende et snit groft i midten af vingen med mikro-saks. Den interne skade gør det muligt at vurdere axonal morfologi og ved brug af optogenetik til at visualisere funktionel konservering af axon og deres synapser. Antennal ablation kræver stabile hænder.
Det anbefales også at øve fjernelse antennerne i vilde typer fluer på forhånd. I afhængighed, enhver tilgængelig optogenetik setup er egnet til at aktivere neuroner i flyve med hat. Ellers kan en simpel opsætning let bygges fra bunden.
Til at begynde, bruge fem jomfru hunner og fem hanner fra højre genotype til at udføre kors ved stuetemperatur. Overfør P0-generationen til nye hætteglas hver tredje til fjerde dag. Saml friske lukket voksen afkom F1 generation dagligt i nye hætteglas og alder dem i syv til 14 dage.
Efter bedøvelse, bruge mikro-saks til at skære den indvendige vinge vene omtrent i midten af vingen. Brug den ene vinge til skaden og den anden fløj som en alder matchede uskadt kontrol. Påfør en skade pr fløj og sørg for at få 15 vinger såret.
Tilbagegør fluerne i fødevarer, der indeholder hætteglas. Dernæst med en pipette, spredes 10 mikroliter halocarbon olie 27 langs en hel glasdias. En eller syv dage efter skaden, bruge mikro-saks til at afskære de sårede samt den uskadte kontrol fløj.
Brug en pincet til at få fat i vingen i midten, montere maksimale fire vinger i halocarbon olie 27 og dække dem med et dæksel dias. Billeder af GFP mærket neuroner i vingen kan let erhverves med en roterende disk. Anskaffelsestiden skal dog udføres inden for mindre end otte minutter efter montering af vingerne, fordi skålen ikke er fast.
Billede vingen straks ved hjælp af en roterende disk mikroskop. Anskaf en række optiske sektioner langs Z-aksen med 0,33 mikrometertrinstørrelse, og komprimer Z-stakke i en enkelt fil til efterfølgende analyser. Kryds fem jomfru hunner og fem hanner fra højre genotype og indsamle F1 generation som tidligere.
Efter bedøvelse, bruge pincet til at oblate højre tredje antenne segment for ensidig ablation eller både venstre og højre tredje antenner segmenter for bilateral ablation. Dette fjerner GFP mærket neuronal celle organer, mens deres axonale fremskrivninger forbliver i CNS. Afhængigt af GFP mærket neuroner, der anvendes i teknikken, er det vigtigt at vide, om de celle organer er anbragt i den tredje eller i den anden antennal segment for den efterfølgende skade assay.
Tilbagegør fluerne i fødevarer, der indeholder hætteglas. Efter bedøvelse, bruge pincet til at få fat i halsen og en anden pincet til at fastsætte brystkassen. Træk forsigtigt halsen og hovedet af brystkassen.
Ved hjælp af pincet, der er dyppet i fastgørelsesopløsningen, overføres alle hoveder til et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter, der indeholder en milliliter fastgørelsesopløsning på 4 %, paraformaldehyd og 0,1 triton X100 i PBS. Fastgør hovederne i 20 minutter med let omrøring ved stuetemperatur. Sæt derefter mikrocentrifugerøret på is og hovederne graviterer til bunden af mikrocentrifugerøret.
Fjern supernatanten med en pipette, og tilsæt en milliliter vaskebuffer, der indeholder 0,1 % triton X100 i PBS. Anvend røret på et drejehjul ved stuetemperatur for at vaske i to minutter. Vasken gentages yderligere fire gange for at fjerne restfastgørelsesopløsningen.
Efter forberedelse af hjerner, få et dæksel dias, stick lab tape på det, og skåret en T lignende form fra båndet. Brug en 20 til 200 mikroliter pipettespids, hvor tre millimeter af spidsen er blevet afskåret for at udvide åbningen af pipetten. Pipette hjernen indeholder antifade reagens på diaset og dække hjerner med et dæksel dias.
Brug ler til at forberede to små lige ruller. Sørg for, at lerrullerne ikke er højere end højden på et glasrutsjebane. Stick ler ruller på glasset dias og placere hjernen indeholder dække slide sandwich på ler ruller.
Fortsæt i henhold til manuskriptet. For at forberede fluerne til optogenetik, først smelte flyve mad i en mikrobølgeovn. Efter maden køler ned, før størkning, tilsættes 20 millimolar alle trans-Retinal i ethanol til en endelig koncentration på 200 mikromolar.
Bland godt og hæld straks maden i tomme hætteglas. Dæk hætteglassene med størknet mad med stik eller vatkugler. Wrap hætteglas med aluminiumsfolie.
Derefter opbevares maden med hætteglas i et mørkt koldt rum. Brug fem jomfru hunner og fem hanner fra højre genotype til at udføre krydser ved stuetemperatur og indsamle F1 generation som tidligere i aluminium dækket hætteglas, der indeholder 200 mikromolar alle trans-Retinal i flyve mad. Derefter indsamles fluerne ved at tappe dem fra fødevarer, der indeholder hætteglas i et tomt hætteglas uden mad.
Hætteglasset afkøles i is, der indeholder vand i ca. 30 sekunder. Fluerne falder i søvn. Nu hurtigt sætte individuelle fluer i små kamre dækket et dæksel dias til at udføre optogenetik.
I et mørkt rum udføres protokollen bestående af 30 sekunder, hvor det røde lys ikke er til stede, efterfulgt af 10 sekunders eksponering for rødt lys ved 10 Hertz. Gentag denne procedure tre gange i alt efterfulgt af yderligere 30 sekunders interval, hvor det røde lys er fraværende. Saml individuelle fluer fra hvert kammer på kuldioxid puder.
For at udsætte dem for antenner skade, ablate både venstre og højre anden antenner segmenter. Dette fjerner cellekroppe af Johnstons organneuroner, mens de aksonale projektioner forbliver i CNS. Genvind fluerne i aluminiumbeklædte hætteglas, der indeholder 200 millimolar alle trans-Retinal.
På tilsvarende tidspunkt punkter, for eksempel syv dage efter antennal ablation, underkaste fluerne til en anden grooming assay. I denne protokol blev der præsenteret tre metoder til undersøgelse af morfologien og funktionen af afhuggede axoner og deres synapser. Den første metode giver mulighed for høj opløsning observation af individuelle axoner i det perifere nervesystem.
De skematiske kors til at generere vilde-type og highwire kloner i vingen er vist her. Styringen i skadede GFP-axoner præsenteres også med pile, der angiver afhuggede axoner. Den anden tilgang til at studere axon død af GFP mærket sensoriske neuron axoner i hjernen præsenteres.
Skematiske kors til at generere vilde-type og highwire kloner i hjernen er vist her. Eksempler på kontrol i skadede GFP-axoner præsenteres med pile, der angiver afskåret axon bundter. Den tredje metode viser tilgangen til at visualisere axonal og synaptisk funktion efter axotomy.
Den skematiske kors til at generere vilde-type og dnmnat over-udtrykke Johnston's organ sensoriske neuroner er vist her. Vilde fluer er fluer, der indeholder Johnstons orgelneuroner med svækket axondød. Begge husede en potent grooming adfærd før skade.
Men, syv dage efter skade, grooming undladt at blive fremkaldt af optogenetik i vilde-type fluer, mens dyrene med svækket axon død fortsatte med at soignere. Her bruger vi tab af funktionsmutationer eller vores ekspression af gener til at observere bevarelsen af aksonal morfologi eller synaptisk funktion. Andre modificerende metoder kan anvendes, såsom at vælte RNA-interferens eller vævsspecifikke CRISPR-Cas9 medierede knock outs.
Disse metoder kan bruges i en skade uafhængig sammenhæng. De giver mulighed for observation og karakterisering af neuronal vedligeholdelse faktorer under aldring, axonal transport, og axonal organeller i intakt axoner.
Her leverer vi protokoller til at udføre tre simple skade-induceret axon degeneration (axon død) analyser i Drosophila melanogaster at evaluere morfologiske og funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved