이 Drosophila 상해 프로토콜의 전반적인 목표는 축 산 및 시 냅 스 형태의 보존뿐만 아니라 축 하 와 그들의 시 냅 스의 시 냅 스 기능을 관찰 하는 것입니다. 이러한 분석은 또한 신경 유지 보수 요인을 특성화하거나 축축산 운송을 연구하거나 축축산기의 축축아 세포기관을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 부분 날개 부상 분석은 드로소필라 날개에서 같은 신경 번들 내에서 부상 제어 축축산과 나란히 변성을 겪고 있는 부상당한 축축을 관찰할 수 있게 해줍니다.
이 부상 분석은 마이크로 가위로 날개 한가운데에 대략 컷을 적용하여 야생 형 파리에서 미리 연습 할 수 있습니다. 내부 상해는 축축한 형태학의 평가를 허용하고 축산과 그들의 시냅스의 기능적 보존을 시각화하기 위하여 광유전학의 사용에 의하여. 안테나 절제에는 안정적인 손이 필요합니다.
또한 사전에 야생 형 파리에서 안테나를 제거하는 것이 좋습니다. 중독에서, 유효한 광유전학 설치는 모자로 비행에 있는 신경세포를 활성화하기 위하여 적당합니다. 그렇지 않으면 간단한 설정을 처음부터 쉽게 만들 수 있습니다.
시작하려면, 실온에서 십자가를 수행하기 위해 오른쪽 유전자형에서 다섯 처녀 여성과 다섯 남성을 사용합니다. P0 세대를 3~4일마다 새로운 바이알로 전송합니다. 갓 동봉 된 성인 자손 F1 세대를 매일 새로운 바이알로 수집하고 7 일에서 14 일 동안 나이를 섭취하십시오.
마취 후 마이크로 가위를 사용하여 날개 한가운데에 있는 내부 날개 정맥을 대략 적으로 절단합니다. 부상에 대한 하나의 날개를 사용하고 다른 날개는 부상 제어와 일치하는 나이로 사용합니다. 날개 당 1 개의 부상을 적용하고 15 날개부상을 해야합니다.
바이알이 함유된 음식에서 파리를 회수합니다. 다음으로 파이펫을 사용하면 전체 유리 슬라이드를 따라 할로카본 오일 27의 마이크로리터 10마이크로리터를 확산시다. 부상 후 1~7일, 미세 가위를 사용하여 부상당한 부상과 부상 방지 날개를 차단합니다.
핀셋을 사용하여 중앙의 날개를 잡고, 할로카본 오일(27)에 최대 4개의 날개를 장착하고 커버 슬라이드로 덮습니다. 날개에 GFP 라벨 뉴런의 이미지는 회전 디스크와 함께 쉽게 취득 할 수 있습니다. 그러나, 수집 시간은 접시가 고정되지 않기 때문에 날개를 장착 한 후 8 분 이내에 수행되어야한다.
회전 디스크 현미경을 사용하여 날개를 즉시 이미지합니다. 0.33 마이크로미터 스텝 크기와 Z 축을 따라 일련의 광학 섹션을 획득하고 Z 스택을 후속 분석을 위한 단일 파일로 압축합니다. 오른쪽 유전자형에서 다섯 처녀 여성과 다섯 남성을 교차하고 이전과 같이 F1 세대를 수집합니다.
마취 후, 핀셋을 사용하여 양측 절제를 위해 오른쪽 세 번째 안테나 세그먼트를 제거하거나 양측 절제를 위해 좌우 세 번째 안테나 세그먼트를 모두 제거합니다. 이것은 그들의 축 소 프로젝션 CNS에 남아 있는 동안 GFP 표시 된 신경 세포 시체를 제거. 이 기술에 사용되는 GFP 표지 된 뉴런에 따라 세포 체가 후속 부상 분석에 대한 세 번째 또는 두 번째 안테나 세그먼트에 보관되어 있는지 여부를 아는 것이 중요합니다.
바이알이 함유된 음식에서 파리를 회수합니다. 마취 후 핀셋을 사용하여 목과 다른 핀셋을 잡고 흉부를 고치세요. 목을 부드럽게 당기고 흉부에서 머리를 향합니다.
고정 용액에 담근 핀셋을 사용하여 모든 헤드를 PBS에서 4%파라포름알데히드 및 0.1 트리톤 X100의 고정 용액 1밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브로 이송합니다. 실온에서 부드러운 동요로 20 분 동안 머리를 고정하십시오. 그런 다음 마이크로 센트심분리기 튜브를 얼음에 넣고 머리는 미세 원심 분리기 튜브의 바닥에 몰두합니다.
파이펫으로 상체를 제거하고 PBS에서 0.1% 트리톤 X100을 포함하는 세척 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 튜브를 실온에서 회전 바퀴에 놓고 2 분 동안 씻습니다. 잔류 고정 용액을 제거하기 위해 4 번 추가로 세척을 반복하십시오.
뇌를 준비한 후 커버 슬라이드를 얻고 실험실 테이프를 붙이고 테이프에서 T와 같은 모양을 잘라냅니다. 20~200마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 3밀리미터의 팁이 차단되어 파이펫의 개구부를 넓힙시다. 미끄럼 방지 시약을 함유한 뇌를 슬라이드에 파이펫하고 커버 슬라이드로 뇌를 덮습니다.
점토를 사용하여 두 개의 작은 짝수 롤을 준비하십시오. 점토 롤이 유리 슬라이드의 높이보다 높지 않은지 확인합니다. 점토 롤을 유리 슬라이드에 붙이고 덮개 슬라이드 샌드위치가 들어 있는 뇌를 점토 롤에 놓습니다.
원고에 따라 진행합니다. 광유전학을 위해 파리를 준비하기 위해 전자 레인지에서 먼저 음식을 녹입니다. 음식이 식힌 후, 고화화하기 전에, 200 마이크로 몰러의 최종 농도에 에탄올에 모든 트랜스 레티날 20 밀리몰라를 추가합니다.
잘 섞어서 음식을 빈 바이알에 즉시 붓습니다. 고화 식품을 포함하는 바이알을 플러그 또는 면공으로 덮습니다. 유리병을 알루미늄 호일로 감쌉니까.
그런 다음 어두운 차가운 방에 바이알이 들어있는 음식을 보관하십시오. 오른쪽 유전자형에서 5명의 처녀 암컷과 5명의 수컷을 사용하여 실온에서 십자가를 수행하고 플라이 푸드의 200 마이크로몰라를 함유한 알루미늄 으로 덮인 바이알에서 와 같이 F1 세대를 수집합니다. 다음으로, 음식없이 빈 유리병에 바이알을 포함하는 음식에서 그들을 눌러 파리를 수집합니다.
유리병을 물이 들어 있는 얼음으로 약 30초 간 식힙니다. 파리가 잠들게 됩니다. 지금, 급속하게 광유전학을 능력을 발휘하기 위하여 커버 슬라이드를 덮은 작은 방에 개별 파리를 두십시오.
어두운 방에서는 적색표시등이 없는 30초로 구성된 프로토콜을 수행하고 10 Hertz에서 10초 동안 적색광 노출을 수행합니다. 이 절차를 총 세 번 반복한 다음 빨간색 표시등이 없는 추가 30초 간격을 추가로 반복합니다. 이산화탄소 패드의 각 챔버에서 개별 파리를 수집합니다.
안테나 부상을 입히려면 왼쪽과 오른쪽 두 번째 안테나 세그먼트를 모두 분리합니다. 이것은 축축골 돌출이 CNS에 남아 있는 동안 존스턴의 기관 신경세포의 세포 바디를 제거합니다. 200 밀리몰러모든 트랜스 레티날이 들어있는 알루미늄 덮인 바이알에서 파리를 회수하십시오.
해당 시점, 예를 들어 7일 후 안테나 절제, 파리를 다른 그루밍 분석으로 가시한다. 이 프로토콜에서, 절단된 축축및 그들의 시냅스의 형태그리고 기능을 연구하기 위하여 3개의 방법이 제시되었습니다. 첫 번째 방법은 말초 신경계에서 개별 축축의 고해상도 관찰을 허용합니다.
날개에 야생 형 및 하이 와이어 클론을 생성하는 회로도 십자가여기에 표시됩니다. 부상당한 GFP 라벨 축축의 컨트롤은 또한 절단 된 축축을 나타내는 화살표로 제공됩니다. 뇌에 있는 GFP 표지된 감각 신경 축삭의 축삭 죽음을 공부하는 두 번째 접근은 제시됩니다.
뇌에서 야생 형 및 하이 와이어 클론을 생성하는 회로도 십자가는 여기에 표시됩니다. 부상당한 GFP 레이블축의 제어 예에는 절단된 축축 묶음을 나타내는 화살표가 표시됩니다. 세 번째 방법은 축 축 절제술 후 축 상 및 시 냅 스 기능을 시각화 하는 방법을 보여줍니다.
야생 형을 생성하기 위해 회로도 십자가와 존스턴의 장기 감각 뉴런을 과도하게 표현하는 dnmnat는 여기에 표시됩니다. 야생형 파리는 감쇠된 축산 죽음과 함께 존스턴의 장기 뉴런을 함유하고 있습니다. 둘 다 부상 전에 강력한 그루밍 행동을 품고 있습니다.
그러나, 7 일 후 부상, 그루밍야생 형 파리에서 광유전학에 의해 유도 되지 못했습니다., 감쇠 축 산 죽음을 가진 동물 동안 신랑 계속. 여기서 우리는 축축물 형태 또는 시냅스 기능의 보존을 관찰하기 위하여 기능 돌연변이 또는 유전자의 우리의 발현의 손실을 이용합니다. RNA 간섭 또는 조직 특이적인 CRISPR-Cas9 중재 녹아웃과 같은 다른 수정 방법을 적용할 수 있다.
이 메서드는 부상 독립적인 컨텍스트에서 사용할 수 있습니다. 그(것)들은 노화 도중 신경 유지 관리 요인의 관찰 그리고 특성화를 허용합니다, 축상 수송, 및 축산소에 있는 축소 세포기관.
