7.4K Views
•
10:29 min
•
March 16th, 2020
DOI :
March 16th, 2020
•0:05
Introduction
1:28
Observation of Axon Morphology During Axon Death in the PNS (Peripheral Nervous System)
3:22
Observation of Axon and Synapse Morphology During Axon Death in the CNS (Central Nervous System)
7:56
Results: Axon Death of GFP-Labeled Sensory Neuron Axons and Axonal/Synaptic Function After Axotomy
9:40
Conclusion
5:53
Grooming Induced by Optogenetics as a Readout for Axon and Synapse Function
Transcript
Det övergripande målet för denna Drosophila skada protokollet är att observera både bevarandet av axonal och synaptisk morfologi, samt synaptisk funktion av axoner och deras synapser. Dessa analyser kan också användas för att karakterisera neuronala underhållsfaktorer, studera axonal transport, eller analysera axonal organeller i intakta axoner. Den partiella vingen skada analysen möjliggör observation av skadade axoner som genomgår degeneration sida vid sida med oskadade kontroll axoner inom samma nerv bunt i Drosophila vingen.
Denna skada assay kan lätt praktiseras i förväg i vild-typ flugor genom att tillämpa ett snitt ungefär i mitten av vingen med mikro-sax. Den inre skadan möjliggör bedömningen av axonal morfologi och genom användning av optogenetik att visualisera funktionella bevarande av axon och deras synapser. Antennal ablation kräver stadiga händer.
Det rekommenderas också att öva borttagning av antennerna i vild-typ flugor i förväg. I missbruk, alla tillgängliga optogenetik setup är lämplig för att aktivera nervceller i flyga med hatt. Annars kan en enkel inställning lätt byggas från grunden.
Till att börja med använder du fem jungfruliga honor och fem hanar från höger genotyp för att utföra kors i rumstemperatur. Överför P0-generationen i nya injektionsflaska var tredje till var fjärde dag. Samla nystängd vuxen avkomma F1 generation dagligen i nya injektionsflaska och ålder dem för sju till 14 dagar.
Efter anestetisering, använd mikro-sax för att skära den inre vingen ven ungefär i mitten av vingen. Använd en vinge för skadan och den andra vingen som en ålder matchas oskadad kontroll. Applicera en skada per vinge och se till att få 15 vingar skadade.
Återhämta flugorna i mat som innehåller injektionsflaska. Nästa, med en pipett, sprida 10 mikroliter av halocarbon olja 27 längs en hel glas bild. En eller sju dagar efter skada, använd mikrosax för att skära av den skadade samt den oskadade kontrollvingen.
Använd pincett för att greppa vingen i mitten, montera maximala fyra vingar i halocarbonoljan 27 och täck dem med en täckrutschbana. Bilder av GFP märkta nervceller i vingen kan lätt förvärvas med en snurrande skiva. Förvärvstiden måste dock utföras inom mindre än åtta minuter efter montering av vingarna eftersom skålen inte är fast.
Bild vingen omedelbart med hjälp av en snurrande disk mikroskop. Förvärva en serie optiska sektioner längs Z-axeln med 0,33 mikrometer stegstorlek och komprimera Z-stackar till en enda fil för efterföljande analyser. Korsa fem jungfruliga honor och fem hanar från rätt genotyp och samla F1 generation som tidigare.
Efter anesthetization, använd pincett för att oblate rätt tredje antennal segmentet för ensidiga ablation eller både vänster och höger tredje antennal segment för bilaterala ablation. Detta tar bort GFP märkt neuronala cell organ medan deras axonal prognoser kvar i CNS. Beroende på GFP märkta nervceller som används i tekniken, Det är viktigt att veta om cellkropparna är inrymt i den tredje eller i den andra antennal segmentet för den efterföljande skadan analysen.
Återhämta flugorna i mat som innehåller injektionsflaska. Efter anesthetization, använd pincett för att ta tag i halsen och en annan pincett för att fixa bröstkorgen. Dra försiktigt halsen och huvudet av bröstkorgen.
Med hjälp av pincett som har doppats i fästlösningen överför du alla huvuden till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör innehållande en milliliter fixeringslösning på 4%paraformaldehyd och 0,1 triton X100 i PBS. Fixera huvudena i 20 minuter med mild agitation vid rumstemperatur. Lägg sedan mikrocentrifugröret på is och huvudena dras till botten av mikrocentrifugröret.
Ta bort supernatanten med en pipett och tillsätt en milliliter tvättbuffert innehållande 0,1%triton X100 i PBS. Placera röret på ett vändhjul i rumstemperatur för att tvätta i två minuter. Upprepa tvätten fyra extra gånger för att avlägsna restlösning.
Efter att ha förberett hjärnorna, få en cover slide, stick lab tejp på den, och skär ut en T som form från bandet. Använd en 20 till 200 mikroliterpipett där tre millimeter av spetsen har skurits av för att vidstiga pipettens öppning. Pipettera hjärnan som innehåller antifade reagens på bilden och täcka hjärnorna med en omslagsbild.
Använd lera för att förbereda två små jämna rullar. Se till att lerrullarna inte är högre än höjden på en glasrutschkana. Stick lera rullar på glaset bilden och placera hjärnan som innehåller locket glida smörgås på lera rullar.
Fortsätt enligt manuskriptet. För att förbereda flugorna för optogenetik, först smälta flyga mat i en mikrovågsugn. Efter maten svalnat, före stelning, tillsätt 20 millimol alla trans-Retinal i etanol till en slutlig koncentration av 200 mikromolar.
Blanda väl och häll maten omedelbart i tomma injektionsflaska. Täck de injektionsflaska som innehåller den stelnade maten med pluggar eller bomullstussar. Linda in injektionsflaskan med aluminiumfolie.
Sedan, förvara maten som innehåller injektionsflaska i ett mörkt kallt rum. Använd fem jungfruliga honor och fem hanar från höger genotyp för att utföra kors i rumstemperatur och samla F1 generation som tidigare i aluminium täckta injektionsflaska som innehåller 200 mikromolar alla trans-Retinal i flyga mat. Därefter samla flugorna genom att knacka dem från mat som innehåller injektionsflaska i en tom injektionsflaska utan mat.
Kyl ner injektionsflaskan i is som innehåller vatten i cirka 30 sekunder. Flugor somnar. Nu, snabbt sätta enskilda flugor i små kammare täckte ett omslagsbild för att utföra optogenetik.
I ett mörkt rum, utför protokollet som består av 30 sekunder där den röda lampan är frånvarande, följt av 10 sekunders rödljusexponering vid 10 Hertz. Upprepa denna procedur tre gånger totalt följt av ytterligare 30 sekunders intervall där den röda lampan är frånvarande. Samla enskilda flugor från varje kammare på koldioxidkuddar.
Att utsätta dem för antennal skada, ablate både vänster och höger andra antennal segment. Detta tar bort cellkropparna av Johnstons organ nervceller medan axonal prognoser kvar i CNS. Återvinna flugorna i aluminium täckta injektionsflaska som innehåller 200 millimol alla trans-Retinal.
Vid motsvarande tidpunkter, till exempel sju dagar efter antennal ablation, föremål flugorna till en annan grooming analys. I detta protokoll, tre metoder presenterades för att studera morfologi och funktion av avhuggna axons och deras synapser. Den första metoden möjliggör hög upplösning observation av enskilda axoner i det perifera nervsystemet.
De schematiska kors för att generera vild-typ och highwire kloner i vingen visas här. Kontrollen i skadade GFP märkta axoner presenteras också med pilar som indikerar avhuggna axoner. Den andra metoden för att studera axon död GFP märkt sensoriska neuron axoner i hjärnan presenteras.
Schematiska kors för att generera vild-typ och highwire kloner i hjärnan visas här. Exempel på kontroll i skadade GFP märkta axoner presenteras med pilar som indikerar avhuggna axon buntar. Den tredje metoden visar tillvägagångssättet för att visualisera axonal och synapsfunktion efter axotomy.
De schematiska kors för att generera vild-typ och dnmnat över-uttrycker Johnston organ sensoriska nervceller visas här. Vild-typ flugor är flugor som innehåller Johnstons organ nervceller med försvagad axon död. Båda hyste en potent grooming beteende innan skada.
Men sju dagar efter skada, grooming misslyckades med att framkallas av optogenetik i vild-typ flugor, medan djuren med försvagad axon död fortsatte att brudgummen. Här använder vi förlust av funktion mutationer eller vårt uttryck av gener att observera bevarandet av axonal morfologi eller synaptisk funktion. Andra modifieringsmetoder kan tillämpas, såsom knock down RNA-interferens eller vävnadsspecifik CRISPR-Cas9 medierad knock outs.
Dessa metoder kan användas i en skada oberoende sammanhang. De möjliggör observation och karakterisering av neuronala underhållsfaktorer under åldrande, axonal transport, och axonal organeller i intakta axoner.
Här tillhandahåller vi protokoll för att utföra tre enkla skadeinducerade axondegeneration (axon död) analyser i Drosophila melanogaster att utvärdera morfologiska och funktionella bevarande av avhuggna axoner och deras synapser.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved