Name: in vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-04-01T14:00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة ماريلاند وبالتيمور وNIH 1R01 GM 127595 الممنوحة لLMJ. يشكر المؤلفون الدكتور دانيال ديردج على مساعدته في تحرير المخطوطة.

<ol>
	<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+for+Epitope+Mapping.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells.">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Biological+Interactions+with+in+Vivo+Protein+Footprinting.">Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).</li><li>Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mapping+of+protein+structure+by+hydroxyl+radical+footprinting-mediated+structural+mass+spectrometry:+a+protection+factor+analysis.">Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis.</a> Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).</li><li>Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+photobiology+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+action+spectra,+absence+of+photoreactivation+and+effects+of+caffeine.">UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine.</a> Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).</li><li>Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+Folding+Kinetics+Studied+by+Time-Resolved+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Xu, G., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical-mediated+modification+of+proteins+as+probes+for+structural+proteomics.">Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics.</a> Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfate+radical+anion+as+a+new+reagent+for+fast+photochemical+oxidation+of+proteins.">Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li><li>Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+quantitation+strategy+for+hydroxyl+radical-mediated+protein+footprinting+using+Proteome+Discoverer.">An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).</li><li>Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Assay+for+the+Rate+of+Removal+of+Extracellular+Hydrogen+Peroxide+by+Cells.">An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells.</a> Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).</li><li>Gazda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+chaperone+UNC-45+is+organized+in+tandem+modules+to+support+myofilament+formation+in+C.+elegans.">The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans.</a> Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).</li><li>Willard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VADAR:+a+web+server+for+quantitative+evaluation+of+protein+structure+quality.">VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).</li><li>Broussard, J. A., Green, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Methodology+and+of+F&#246;rster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET)+Microscopy.">Research Techniques Made Simple: Methodology and of F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).</li><li>Kaur, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Structural+Biology+through+the+Lens+of+Mass+Spectrometry.">Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: Methods and Applications. , 275-286 (2006).</li><li>Rinas, A., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Coupled+to+Multidimensional+Protein+Identification+Technology+(MudPIT):+Expanding+Footprinting+Strategies+to+Complex+Systems.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).</li><li>Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-Initiated+Radical+Trifluoromethylation+of+Peptides+and+Proteins:+Application+to+Mass-Spectrometry-Based+Protein+Footprinting.">Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).</li></ol>

وقد كتب هذا المنشور في الوفاء الجزئي لشهادة دكتوراه جاي. ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

المعيار الحالي لدراسة في التفاعلات البروتين والبروتين الحي (PPI) هو نقل الطاقة بالرنين الفلورسينس (FRET). في أبسط أشكاله، هذه التقنية تدرس PPI عن طريق نقل الطاقة بين جزيئين عندما تكون على مقربة من بعضها البعض15. على عكس تقنيات MS، لا تملك FRET القرار لتوصيف التغيرات المطابقة ومواقع التفاعل على مستوى الأحماض الأمينية. وقد استخدمت تقنيات MS القائمة على نحو متزايد لدراسة PPI16. IV-FPOP هو أسلوب HRPF الذي يسمح للتحليل الهيكلي في البروتين الحي في C. elegans. من أجل تسمية C. elegans بنجاح بواسطة IV-FPOP ، من المهم تجميع نظام التدفق الميكروونيتي بشكل صحيح للحد من فقدان العينة. وقد أظهرت الشعيرات الدموية 250 ميكرون i.d. لتعظيم استرداد العينة بالمقارنة مع أصغر i.d. الشعيرات الدموية4. لم يتم اختبار الشعيرات الدموية الأكبر حجماً، غير أن نظام التدفق الميكروواني مصمم باستخدام الشعيرات الدموية بنفس الـ i.d. كنظام قياس مجرى التدفق المتاح تجارياً لفرز C. elegans. 17 حجم عينة دودة مهم أيضا، وحجم عينة أقل من ~ 10،000 لكل عينة قبل FPOP لا تسفر عن تركيزات البروتين عالية بما يكفي لتحليل LC-MS /MS. ويمكن أيضاً استخدام أحجام عينات أعلى (أكثر من 000 10 دودة) عن طريق ضبط حجم البداية الأولي (الخطوة 4.5).
التجميع السليم لنظام التدفق الميكرووتوني مهم. التسريبات في مسار العينة تؤدي إلى تدفق غير متناسق من الديدان أو H2O2. يمكن إعادة استخدام الصمامات المنظّمة من الصمامات الوريدية والنصف من تجارب IV-FPOP المتعددة إذا تم تنظيفها بشكل صحيح بعد كل تجربة. ومع ذلك، نوصي بتجميع نظام تدفق ميكرووتوني جديد لكل تكرار بيولوجي. إذا تم تجميع microfluidics بشكل صحيح ، فإن الديدان وH2O2 سيختلطان عند الخلط - T مع الحد الأدنى من ضغط الظهر. كما مراقبة الجودة (QC) من نظام التدفق microfluidic، ونحن نوصي اختبار كفاءة خلط باستخدام الأصباغ الملونة. من المهم مراقبة حركة الستيرات المغناطيسية داخل حقنة الدودة أثناء IV-FPOP ، أو خلط العينة غير السليم في حقنة الدودة أو خلط T يمكن أن يؤدي إلى ضغط الظهر مما تسبب في تسرب. وبالإضافة إلى ذلك، تؤدي ظروف الخلط السيئة إلى خسائر كبيرة في العينة، وضعف التعرض للديدان بالليزر عند نافذة الليزر، وانسدادها.
C. elegans صيانة مهم من أجل تقليل الأكسدة الخلفية. نوصي بزراعة الديدان في درجات حرارة منخفضة في ظل ظروف منخفضة الإجهاد حيث يمكن أن تؤثر درجات الحرارة المرتفعة على أكسدة الخلفية الإجمالية. ويوصى بمجموعة عينة تحكم من الديدان فقط، لا H2O2 ولا تشعيع الليزر، لجميع التجارب IV-FPOP لحساب أكسدة الخلفية بسبب الصيانة المختبرية. واحدة من القيود الحالية لهذه التقنية هو العدد الإجمالي للببتيدات المعدلة الأكسدية التي تم تحديدها والعدد الإجمالي للمخلفات المؤكسدة لكل ببتيد من أجل الحصول على معلومات هيكلية أعلى البروتين. على الرغم من عدم التوصية، يمكن تحقيق زيادة في التعديلات التأكسدية باستخدام تركيزات أعلى من بيروكسيد الهيدروجين. زيادة في بيروكسيد الهيدروجين يمكن أن يغير بشكل كبير المسارات البيولوجية الهامة وكذلك يؤدي إلى التتكشف الناجمعن الأكسدة. إذا تم زيادة تركيز بيروكسيد الهيدروجين لIV-FPOP، فمن المستحسن لاختبار قابلية دودة وأكسدة الخلفية كما تركيزات أعلى من 200 mM لم يتم اختبارها.
يمكن تحسين بروتوكول LC-MS/MS الموصوف وتعديله لتلبية MS QC من المختبرات الأخرى. وقد ثبت سابقا استخدام تقنيات الكروماتوغرافيا 2D لزيادة تحديد الببتيدات المعدلة أكسدة والبروتينات18. ومع ذلك، لا ينصح تقنيات إثراء البروتين التي تستهدف بروتين معين من الفائدة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر هطول الأمطار المضادة للأجسام أو المقالات المنسدلة. هذه التقنيات يمكن أن تنحاز إلى واحد متوافق البروتين إذا تم تعديل موقع epitope / ملزمة من البروتين أكسدة IV-FPOP. التطورات الجديدة في البصمة الكواشف الراديكالية، مثل الأنيون الراديكالي كبريتات10 أو ثلاثي فلوروميثيليشن19 يمكن أن تزيد من براعة IV-FPOP. على الرغم من أن كاشف الوسم الوحيد الذي تم اختباره في الجسم الحي حتى الآن هو بيروكسيد الهيدروجين ، إلا أنه يمكن تحسين الجذور الأخرى التي يتم تنشيطها بالليزر. وينبغي أن يثبت استخدام الجذور الأخرى لتكون متوافقة مع قابلية الدودة، نفاذية الخلية، والطول الموجي ليزر 248 نانومتر. بسبب استخدام C. elegans كنظام نموذجي للعديد من الأمراض البشرية ، فإن IV-FPOP لديه القدرة على أن يكون له تأثير قوي في دراسة دور بنية البروتين في مسببات الأمراض.

وقد استخدمت بصمة البروتين إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS) في السنوات الأخيرة لدراسة تفاعلات البروتين والتغيرات المطابقة. الهيدروكسيل البصمة البروتين الراديكالية (HRPF) طرق التحقيق في إمكانية الوصول إلى المذيبات البروتين عن طريق تعديل سلاسل الجانب من الأحماض الأمينية البروتين. وقد استخدمت طريقة HRPF، الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة من البروتينات (FPOP)1،للتحقيق في بنية البروتين في المختبر2،في الخلية (IC-FPOP)3،ومؤخرا في الجسم الحي (IV-FPOP)4. FPOP يستخدم ليزر excimer الطول الموجي 248 نانومتر من أجل توليد بسرعة الجذور هيدروكسيل عن طريق التحلل الضوئي من بيروكسيد الهيدروجين لتشكيل الجذور هيدروكسيل1. بدوره، يمكن لهذه الجذور تسمية 19 من أصل 20 الأحماض الأمينية على مقياس زمني ميكروثانية، أسرع من البروتينات يمكن أن تتكشف. على الرغم من أن تفاعل كل حمض أميني مع الجذور الهيدروكسيل يمتد 1000 أضعاف، فمن الممكن لتطبيع الأكسدة سلسلة الجانب عن طريق حساب عامل الحماية (PF)5.
منذ FPOP يمكن تعديل البروتينات أكسدة بغض النظر عن حجمها أو تسلسل الأولية، فإنه يثبت أن تكون مفيدة لدراسات البروتين في الخلية وفي الجسم الحي. IV-FPOP تحقيقات بنية البروتين في C. elegans بالمثل في المختبر ودراسات في الخلية4. C. elegans هي جزء من عائلة النيماتودا وتستخدم على نطاق واسع كنموذج لدراسة الأمراض البشرية. قدرة الدودة على الاستفادة من بيروكسيد الهيدروجين عن طريق الانتشار السلبي والنشط على حد سواء يسمح لدراسة بنية البروتين في أنظمة الجسم المختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، C. elegans هي مناسبة لIV-FPOP بسبب شفافيتها في الطول الموجي ليزر 248 نانومتر اللازمة لFPOP6. يسمح اقتران هذه الطريقة بالقياس الطيفي الكتلي لتحديد البروتينات المعدلة المتعددة باستخدام نهج البروتيوميك التقليدية من أسفل إلى أعلى.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية تنفيذ IV-FPOP لتحليل بنية البروتين في C. elegans. يتطلب البروتوكول التجريبي تجميع وإعداد نظام التدفق الميكرووسيري لIV-FPOP المقتبس من Konermann et al7. بعد IV-FPOP، يتم تجانس العينات لاستخراج البروتين. عينات البروتين هي البروتين والبروتين ويتم تحليل الببتيدات بواسطة الكروماتوغرافي السائل (LC) MS جنبا إلى جنب، تليها القياس الكمي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1299px;" width="1299">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:251px;">any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock</td>
			<td style="width:179px;">SGE Analytical Science</td>
			<td style="width:161px;">008760</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">60 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FM3279</td>
			<td>This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Acetone, HPLC Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td style="width:179px;">Waters</td>
			<td style="width:161px;">186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td style="width:179px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Delicate Task Wipers</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Dissecting Needle</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50-822-525</td>
			<td>only a couple are needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td style="width:179px;">AmericanBio</td>
			<td style="width:161px;">AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy instant mix 5 minute</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">EX350 excimer laser (248 nm wavelength)</td>
			<td style="width:179px;">GAM Laser</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">FEP Tubing 1/16&#34; OD x 0.020&#34; ID</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">1548L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">HV3-2 VALVE</td>
			<td style="width:179px;">Hamilton</td>
			<td>86728</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td style="width:179px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:161px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Legato 101 syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">P-618L</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">N,N&#8242;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td style="width:179px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:161px;">116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">NanoTight Sleeve Green 1/16&#34; ID x .0155&#34; ID x1.6&#34;&#39;</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">F-242X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">NanoTight Sleeve Yellow 1/16&#34; OD x 0.027&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">F-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td style="width:179px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:161px;">177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">7110-OP</td>
			<td>any protease inhibitor is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td style="width:179px;">Ophir Optronics</td>
			<td style="width:161px;">7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">Molex</td>
			<td style="width:161px;">1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250&#181;m, Outer Diameter 350&#181;m, TSP250350</td>
			<td style="width:179px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:161px;">1068150026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:708px;">Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450&#181;m, Outer Diameter 670&#181;m, TSP450670</td>
			<td style="width:179px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:161px;">1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:708px;">Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75&#181;m, Outer Diameter 375&#181;m, TSP075375</td>
			<td style="width:179px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:161px;">1068150019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P382-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Proteome Discover (bottom-up proteomics software)</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">OPTON-30799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Rotary Magnetic Tumble Stirrer</td>
			<td style="width:179px;">V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:161px;">VP 710D3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps</td>
			<td style="width:179px;">V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:161px;">VP 710D3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50-111-1315</td>
			<td>any scissors are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Self-Adhesive Label Tape</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15937</td>
			<td>one roll is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">05-402</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15-525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Stereo Zoom Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">03-000-014</td>
			<td>a magnifying glass is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; OD</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">P-259X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; &#38; 1/32&#34; OD</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">P-255X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick</td>
			<td style="width:179px;">V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:161px;">VP 722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Tris Base</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Universal Base Plate, 2.5&#34; x 2.5&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:161px;">UBP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">VHP MicroTight Union for 360&#181;m OD</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">UH-436</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Water, LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in caenorhabditis elegans

الأكسدة السريعة للبروتينات (FPOP) هي طريقة للهيدروكسيل للبروتين الجذري (HRPF) تستخدم لدراسة بنية البروتين ، وتفاعلات البروتين - ligand ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. FPOP يستخدم ليزر excimer KrF في 248 نانومتر لتحلل بأكسيد الهيدروجين لتوليد الجذور الهيدروكسيل التي بدورها تعديل أكسدة سلاسل الجانب الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها المذيبات. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتوسيع استخدام FPOP في التسمية التأكسدية في Caenorhabditis elegans (C. elegans)، بعنوان IV-FPOP. وقد استخدمت الديدان الخيطية الشفافة كأنظمة نموذجية للعديد من الأمراض البشرية. الدراسات الهيكلية في C. elegans بواسطة IV-FPOP ممكنة بسبب قدرة الحيوان على استيعاب بيروكسيد الهيدروجين، وشفافيتها إلى التشعيع بالليزر في 248 نانومتر، والطبيعة التي لا رجعة فيها للتعديل. يتم وصف تجميع نظام تدفق microfluidic لعلامات IV-FPOP ، ومعلمات IV-FPOP ، واستخراج البروتين ، والمعلمات المحسنة LC-MS / MS هنا.

في نظام التدفق الميكروfluidic المستخدمة لIV-FPOP، H2O2 ويتم الاحتفاظ الديدان منفصلة حتى قبل التشعيع بالليزر. هذا الفصل يلغي انهيار H2O2 بواسطة كاتالاز الذاتية وغيرها من الآليات الخلوية12. يُظهر استخدام الشعيرات الدموية 250 ميكرومتر ية الانتعاش الكلي للعينة بين 63-89% عبر اثنين من النسخ البيولوجية، في حين أن الشعيرات الدموية التي تبلغ 150 ميكرومتر تظهر فقط الانتعاش بنسبة 21-31%(الشكل 3A). يؤدي استخدام ورم ٍ لاد أكبر (250 ميكرومتر) إلى تدفق أفضل للدودة أثناء تدفق الديدان الوريدية وأحادية الدودة(الشكل 3B)بالمقارنة مع ورم ٍ شعري أصغر (150 ميكرومتر)(الشكل 3C). لا يسمح الشعيرات الدموية 150 ميكرون أحادية لتدفق دودة واحدة(الشكل 3C)وينظر إلى الديدان متعددة تتدفق معا في نافذة الليزر تشعيع مما يقلل من كمية التعرض بالليزر لكل دودة واحدة.
IV-FPOP هو تقنية وضع العلامات الكوفانت التي تحقق إمكانية الوصول المذيبات في C. elegans. ويبين الشكل 4A ممثل استخراج الكروماتوجرام اتية (EIC) من الببتيد المعدلة وغير المعدلة FPOP. التسمية الراديكالية هيدروكسيل يغير كيمياء الببتيدات المعدلة أكسدة، مما يجعل الببتيدات المعدلة FPOP أكثر قطبية. في الكروماتوغرافيا المرحلة العكسية، الببتيدات المعدلة IV-FPOP لديها أوقات الاحتفاظ في وقت سابق من الببتيدات غير المعدلة. MS / MS تجزئة الببتيدات المعزولة يسمح لتحديد المخلفات المعدلة الأكسدية(الشكل 4B).
وقد أظهرت IV-FPOP إلى تعديل أكسدة ما مجموعه 545 البروتينات عبر اثنين من النسخ البيولوجية داخل C. elegans (الشكل 5A, B). تعتمد ميزة IV-FPOP كطريقة بصمة البروتين على قدرة التقنية على تعديل البروتينات في مجموعة متنوعة من أنظمة الجسم داخل الديدان(الشكل 5C). هذه الطريقة من شأنها أن تسمح للتحقيق بنية البروتين وتفاعلات البروتين بغض النظر عن أنسجة الجسم أو الجهاز داخل الدودة. علاوة على ذلك ، يؤكد تحليل MS الترادفي ة IV-FPOP إمكانية الوصول إلى المذيبات في الجسم الحي. تم تحليل نمط أكسدة بروتين صدمة الحرارة 90 (Hsp90) في معقدة مع بروتين الشاسين الميوسين UNC-45(الشكل 6). تحليل MS/MS لHsp90 يظهر أربع مخلفات معدلة أكسدة(الشكل 6C, D),المدى العادي لتعديل FPOP (ln (PF))5 يشير إلى Hsp90 بقايا M698 لتكون أقل المذيبات يمكن الوصول إليها من المخلفات R697, E699, و E700 عندما ملزمة UNC-45(الشكل 6C). يتم التحقق من صحة هذه الاختلافات في الأكسدة من خلال حسابات مساحة سطح المذيبات الأدبية (SASA) (PDB 4I2Z13). بقايا M698 لديه قيمة SASA من 0.03 التي تعتبر بقايا مدفونة بالمقارنة مع المخلفات R697، E699، وE700 مع قيم SASA أعلى(الشكل 6C). 14
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig1.jpg"> الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة في جهاز الفيفو FPOP microfluidic تدفق نظام التخطيطي. (أ)يتم عرض الخطين المنضوين (البرتقالي) من نظام تدفق IV-FPOP داخل أنابيب FEP (الأصفر)، يتم تمثيل الموضع الملزم الصحيح لراتنج الايبوكسي من خلال الدائرة الزرقاء الفاتحة. (ب)كاملة مجمعة خلط-T شكلتها الشعيرات الدموية 3 250 ميكرومتر. يتم تمثيل الموقف الصحيح ربط الراتنج من الشعيرات الدموية منفذ إلى أنابيب FEP من قبل الدائرة الزرقاء الخفيفة. (C)نظام التدفق تجميعها كاملة في التسمية الكوفالين ة من C. elegans. قبل FPOP، يتم الاحتفاظ الديدان منفصلة من H2O2 حتى قبل وضع العلامات فقط. وتظهر نافذة تشعيع الليزر باللون الأزرق الفاتح ويتم تمثيل شعاع الليزر بواسطة الصاعقة الأرجوانية. الأرقام ليست للتحجيم. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig2.jpg"> الشكل 2 - ما إذا كانت هناك نسبة نظام ميكروونيتي خلال IV-FPOP. (أ)صورة تمثيلية لـ C. elegans داخل حقنة 5 مل. دون تحريك ، تستقر الديدان في الجزء السفلي من الحقنة (يسار). التحريك المغناطيسي وكتلة التحريك إبقاء الديدان في التعليق خلال التجارب IV-FPOP (يمين). (ب)صورة تمثيلية لمحقنة 5 مل، وغرس الشعيرات الدموية، وسحب الشعيرات الدموية المتصلة بصمام 3-2. يتم عرض مقبض صمام 3-2 في موقف الانسحاب. (C)نظام التدفق الميكروونيتي خلال IV-FPOP، كتلة التحريك المغناطيسي هو الموقف فوق حقنة الديدان 5 مل. (D)تأمين الشعيرات الدموية منفذ إلى مرحلة تشع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig3.jpg"> الشكل 3 - ما إذا كانت هناك نسبة مقارنة تدفق C. elegans والاسترداد باستخدام اثنين من الشعيرات الدموية. (أ)في المائة من الانتعاش من الديدان بعد IV-FPOP لاثنين من النسخ البيولوجية (BR) مع 250 (رمادي) و 150 (أسود) ميكرون i.d. الشعيرات الدموية. يتم حساب أشرطة الخطأ من الانحراف المعياري عبر triplicates التقنية. C. elgans تتدفق من خلال نافذة الليزر تشع من خلال 250 ميكرومتر(B)و 150 ميكرومتر(C)i.d. الشعيرات الدموية. الديدان هي أكثر إحكاما في الشعيرات الدموية الصغيرة. ويظهر الشعيرات الدموية التي تبلغ 150 ميكرومتر ًا متكتلًا من الديدان. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig4.jpg"> الشكل 4 - ما إذا كانت هناك نسبة نتائج LC-MS/MS التمثيلية التالية IV-FPOP. (أ)EIC من الببتيد المعدلFPOP (أحمر) وغير معدلة (الأزرق). الببتيد المحدد ينتمي إلى بروتين أكتين-1. (ب)MS / MS الطيف من الاكتين غير المعدلة مشحونة بشكل مضاعف-1 الببتيد 317-327. (C)MS / MS الطيف من FPOP مشحونة بشكل مضاعف الفعل المعدلة-1 الببتيد 317-327، في هذا المثال تم تعديل P323 أكسدة (ص5+ أيون، أحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig5.jpg"> الشكل 5 - ما إذا كانت هناك نسبة IV-FPOP تعديل البروتينات المؤكسدة داخل C. elegans. (A)مخطط فين من البروتينات المعدلة أكسدة في وجود 200 mM بيروكسيد الهيدروجين في 50 هرتز عبر اثنين من النسخ البيولوجية (BR)، BR1 هو باللون الأزرق وBR2 هو باللون الأصفر. (B)مخطط Venn للبروتينات المعدلة أكسدة المحددة في عينات مشعع، والسيطرة على بيروكسيد الهيدروجين، ومكافحة دودة فقط في BR2 عبر ثلاثيات التقنية. (C)مخطط دائري للبروتينات المعدلة بشكل تأكسدي داخل أنظمة الجسم C. elegans المختلفة. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig5large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig6.jpg"> الشكل 6 - ما إذا كانت هناك نسبة ربط التعديلات IV-FPOP إلى إمكانية الوصول إلى المذيبات. (أ)بروتين ميوسين هابرون UNC-45 (رمادي) (PDB ID 4I2Z13)تسليط الضوء على ببتيدين معدلين تم تحديدهما بواسطة تحليل LC/MS/MS، 669-680 و698-706 (أخضر، مدخول أيسر). ومن ضم UNC-45 إلى الجزء الببتيد Hsp90 (الأزرق). وتظهر المخلفات المعدلة أكسدية داخل هذه القطعة في العصي (الأحمر)، ويتم تقديم UNC-45 كسطح (inset الحق). (ب)أطياف MS الترافسان من الببتيد UNC-45 669-680 (أعلى) و 698-706 (أسفل) تظهر ب- و y-الأيون لفقدان CO2،وهو تعديل FPOP. (C)ln (PF) المحسوبة للمخلفات المعدلة بشكل تأكسدي Hsp90، R697، M698، E699، وE700. يتم الإشارة إلى قيم SASA المحسوبة لـ Hsp90 فوق كل بقايا. (D)أطياف MS جنباإلى دفق لR697، M698، E699، وE700 تظهر +16 FPOP التعديل. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig6large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في الأكسدة البيوكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات (IV-FPOP) هي تقنية بصمة البروتين الجذري ة الهيدروكسيل التي تسمح برسم خرائط بنية البروتين في بيئتها الأصلية. يصف هذا البروتوكول تجميع وإعداد نظام التدفق الميكرووتوني IV-FPOP.

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

في التفاعلات البروتينية البروتينية في الجسم الحي FPOP وتغيرات بنية البروتين في C-elegans. وتستخدم هذه الحيوانات على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة الأمراض البشرية. عن طريق اقتران في الجسم الحي FPOP لقياس الطيف الشامل، يمكننا التحقيق البروتين البروتين التفاعلات داخل مختلف مقصورات الخلوية والجسم في حي دون الحاجة إلى عزل بروتين واحد معين.بدء تجميع نظام التدفق، عن طريق قطع قطعة سنتيمترين من البروبيلين الإثيلين المفلورة أو أنابيب FPP. استخدام إبرة تشريح نظيفة لتوسيع القطر الداخلي في نهاية واحدة من الأنابيب، وخلق حفرة صغيرة حوالي 15 ملليمتر في الطول. لإنشاء خطوط الضخ لنظام التدفق، وقطع إلى 15 قطعة سنتيمتر من 250 ميكرومتر الداخلية قطر تنصهر السيليكا مع قطع السيراميك.وشريط الشعيرات الدموية اثنين جنبا إلى جنب مع شريط لاصق الذاتي، والتأكد من أن نهايات هي 100٪ مسح. أدخل الشعيرات الدموية في فوهة فوهة أنابيب FPP ، ودفعها إلى الحافة ذاتها. ضع نقطة صغيرة من راتنج الايبوكسي على سطح نظيف ، واخلطها مع إبرة التشريح.استخدام نفس الإبرة لوضع بسرعة قطرة صغيرة من الراتنج، في نهاية الشعيرات الدموية الضخ، حيث أنها تتصل مع أنابيب FPP، والسماح للراتنج لتجفيف الجانب منفذ لبضع دقائق. وفي الوقت نفسه، وقطع جديد 250 ميكرومتر الداخلية قطر الشعيرية التي سوف تصبح الشعيرية منفذ من نظام التدفق. مرة واحدة وقد جفت الراتنج، إدراج شعري جديد إلى منفذ أنابيب FPP نهاية.يجب أن يكون الطرفين الداخليين للشعييري المتنفس والشعيرات الشعرية المُغرِقتين دافقًا ضد بعضهما البعض، مما يخلق الشاي المُخلط. ربط إلى شعري وFPP الأنابيب مع راتنج الايبوكسي الطازجة كما هو موضح سابقا، والسماح لنظام تدفق لتجف بين عشية وضحاها. إدراج أربعة ستيررس المغناطيسي، داخل حقنة واحدة خمسة ملليلتر التي سوف تمنع الديدان من الاستقرار في هذه الحقنة خلال في في أكسدة حيوية ضوئية سريعة من البروتينات أو في FPOP vivo.ملء هذا ومحاقن إضافية خمسة ملليلتر مع M9، مع التأكد من تجنب خلق فقاعات. قم بتوصيل محول أقل بكل حقنة، مع التأكد من أنها ضيقة ومؤمنة في مكانها. ثم، تعلق كل حقنة إلى المنفذ الأوسط من صمام واحد ثلاثة-اثنين.تأمين كل حقنة إلى مضخة حقنة مزدوجة، وضبط اللون الميكانيكي لمنع الضغط الزائد من كتلة دافع. استخدام قائمة شفة فائقة لا FEP الأكمام و السوبر شفة قائمة متغير لإرفاق كل نهاية شعرية غرس من نظام microfluidic التي قدمت سابقا إلى المنفذ العلوي من كل صمام ثلاثة-اثنين. وأخيراً، نعلق 10 سنتيمتر 450 ميكرومتر الشعرية الداخلية القطر إلى المنفذ السفلي للصمام، والتي سوف تكون بمثابة الشعرية عينة سحب.بدء تدفق المضخة وفحص بصريا جميع الاتصالات للتسربات. تدفق ما لا يقل عن ثلاثة وحدات تخزين المحاقن باستخدام معدل التدفق التجريبي. يتم وضع علامة على مسار التدفق من الأسهم على مقبض الصمام ثلاثة-اثنين، ويمكن إعادة ملء كل حقنة يدويا عن طريق تحريك مقبض صمام من طرد إلى موقف الانسحاب.بعد فحص نظام تدفق microfluidic، نقله إلى مقاعد البدلاء التجريبية، وتأمين الشعرية منفذ إلى مرحلة تشع مع اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام أخف مدى طويل لحرق طلاء السيليكا تنصهر في نافذة أشعة الليزر وتنظيف الطلاء المحروق مع أنسجة الوبر والميثانول. ضع كتلة التحريك المغناطيسي فوق المحقنة مع التحريك المغناطيسي وضبط السرعة ، بحيث تدور التحريكات ببطء وباستمرار.بدوره على الكريبتون الفلورايد excimer الليزر والسماح للتروين الغدة الدرقية للاحماء. قياس طاقة الليزر على تردد 50 هيرتز لمدة لا تقل عن 100 نبضة عن طريق وضع جهاز الاستشعار البصري في نافذة خروج شعاع. سحب يدويا حوالي 10،000 الديدان في حجم 500 ميكرولتر في حقنة العينة.ثم تعبئة مع 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت M9، مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء. من المهم أن يكون حجم عينة لا يقل عن 10000 الديدان. وسوف يؤدي حجم عينة أصغر في انخفاض العائد البروتين لتحليل البروتيوم المصب.ملء الحقنة الثانية مع ثلاثة ملليلتر من 200 ميليمولار بيروكسيد الهيدروجين. في نهاية شعرية منفذ, وضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع ستة ملليلتر من 40 ملليمولار DMTU, 40 ميليمولار PBN, و 1٪ من وقت أكسيد التفاح. بدء الليزر excimer من نافذة البرنامج، والانتظار للنبض الأول وبدء تدفق العينة من حقنة مزدوجة.جمع العينة بأكملها في أنبوب 15 ملليلتر، في حين تراقب بنشاط تدفق العينة لأي تسرب البصرية. بعد في vivo FPOP، بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 805 مرات ز لمدة دقيقتين. pirate محلول التبريد وإضافة 250 ميكرولترات من المخزن المؤقت المرخصة.نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيفة، فلاش تجميده وتخزينها في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية حتى هضم العينة. تم مقارنة استرداد دودة بعد في في الجسم الحي FPOP باستخدام الشعيرات الدموية مع اثنين من أقطار داخلية مختلفة. عندما تم استخدام شعرية قطرها الداخلي 250 ميكرومتر، تم تحقيق استعادة عينة إجمالية بين 63 و 89٪عبر اثنين من النسخ المتماثلة البيولوجية.أدى استخدام 150 ميكرومتر داخلي قطر شعري في الانتعاش فقط 21 إلى 31٪. استخدام أكبر قطر داخلي شعرية، يؤدي إلى تدفق دودة أفضل خلال في FPOP في الجسم الحي، والشعيرات الدموية أصغر لا يسمح لتدفق دودة واحدة، وينظر الديدان متعددة تتدفق معا في نافذة الليزر يشع، مما يقلل من كمية التعرض بالليزر لكل دودة. الممثل استخراج الكروماتوغرافية الأيون من الببتيد FPOP المعدلة وغير المعدلة أظهرت أن الهيدروكسيل الجذرية التغييرات كيمياء الببتيدات المعدلة التأكسي مما يجعلها أكثر القطبية.في عكس المرحلة الكروماتوغرافيا، في الببتيدات المعدلة FPOP vivo يكون وقت الاحتفاظ في وقت سابق من الببتيدات غير المعدلة. تفتيت التصلب المتعدد من الببتيدات المعزولة، ويسمح لتحديد المخلفات المعدلة التأسد. في في الجسم الحي FPOP قد عدلت التأديد ما مجموعه 545 البروتينات عبر اثنين من النسخ المتماثلة البيولوجية داخل C-elegans.إحدى مزايا طريقة البصمة البروتينية هذه، هي قدرتها على تعديل البروتينات، في مجموعة متنوعة من أنظمة الجسم داخل الديدان. يؤكد تحليل MS الترادف في vivo FPOP التحقيق المذيبات في vivo. تم تحليل نمط الأكسدة من البروتين صدمة الحرارة 90 في مجمع مع البروتين المرافق myosin UNC 45، وعثر على أربع بقايا معدلة بشكل مؤكسد.استخدام C-elegans لفي فيفو FPOP، ويوفر إمكانية لدراسة دور البروتين البروتين التفاعلات وبنية البروتين في الأمراض المسببة للأمراض.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

ليزر خالية من هيدروكسيل البروتين الراديكالي البصمة لأداء أعلى ترتيب التحليل الهيكلي للبروتينات

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...