Name: in vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-04-01T14:00:00
Duration: 8 min
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这项工作得到了马里兰大学、巴尔的摩分校和NIH 1R01 GM 127595授予LMJ的启动资金的支持。作者感谢丹尼尔·德里奇博士在编辑手稿时所做的帮助。

1. C. elegans维护和文化
<ol><li>按照标准实验室程序8，将蠕虫菌群生长并同步到其第四个幼虫（L4）阶段。</li>
	<li>IV-FPOP实验当天，用M9缓冲液（0.02 M KH2PO 4、0.08 M Na2HPO4、0.08M NaCl、1 mM MgSO 4）从细菌草坪（OP50大肠杆菌）清洗L4蠕虫。4</li>
	<li>每个 IV-FPOP 样本获取 ±10，000 蠕虫的 500 μL 等位。</li>
</ol>2. 微流体流系统组件
<ol><li>切割一块 2 厘米的氟乙烯丙烯 （FEP） 管（1/16 英寸外径 （o.d.） x 0.020 英寸内径 （i.d.））启动流系统组件。</li>
	<li>使用干净的解剖针，扩大FEP管的i.d.，以便一端只形成一个小陨石坑，长度为±50毫米。陨石坑应该足够大，可以容纳两块360μmo.d.的熔融石英。 注：不要加宽相反的一端，因为此端将仅用于安装出口毛细管。</li>
	<li>使用陶瓷切割机，切割两块 15 厘米的 250 μm i.d. 熔融石英。这两块将成为流系统的注入线。</li>
	<li>使用自粘胶带，将两个 250 μm i.d. 毛细血管粘在一起，确保它们彼此平行，其末端 100% 冲洗。 注：为确保熔融的二氧化硅端在切割后不会粉碎，并且彼此直和 100% 冲洗，建议使用放大镜或立体显微镜检查它们。</li>
	<li>将两个带胶带的毛细血管插入 FEP 管的手工坑中。将毛细血管推到手工陨石坑的边缘。 注意：为了保持流系统的功效，不要推过手工制作的陨石坑（图1a）。</li>
	<li>将一小块环氧树脂放在干净的表面上，并与解剖针混合。</li>
	<li>快速，使用相同的针头，在注入毛细血管的末端放置一小滴树脂，与 FEP 管连接，让树脂干燥，将出口侧向上悬挂几分钟（图 1a）。</li>
	<li>当树脂干燥时，将 FEP 管和两个毛细管结合在一起，切出新的 250 μm i.d. 毛细管。新的毛细管将成为流动系统的出水毛细管。可以使用以下方程计算所需的毛细管长度： <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60910/60910eq1.jpg"> 如果 l 的长度以厘米为单位，t是所需的反应时间（以分钟为单位），f以 mL/min 为单位的流速，并且 i.d. 毛细管的内径（以厘米为单位）。 注：切割出出口毛细管后，检查末端，确保它们是直的，而不是粉碎的。</li>
	<li>树脂干燥后，通过 FEP 管出口端插入新的毛细管。出口毛细管的内端和两个注入毛细血管应在 FEP 管内相互冲洗，这会产生混合-T（图 1b）。</li>
	<li>按照步骤 2.6 和 2.7 中所述，将出口毛细管和 FEP 管与新鲜的环氧树脂结合。</li>
	<li>让树脂在一夜之间干燥，将流系统结合在一起。第二天设置微流体流系统（图1c）。</li>
</ol>3. 用于体内FPOP的微流体流系统
<ol><li>在一个 5 mL 注射器内插入四个磁性搅拌器。此注射器成为注射器样本。磁性搅拌器可防止蠕虫在IV-FPOP期间在注射器内沉降（图2A）。</li>
	<li>用 M9 填充两个 5 mL 注射器。确保每个注射器内没有气泡，因为它们会影响流速和混合效率。</li>
	<li>将 Luer 适配器连接到每个 5 mL 注射器，确保它们手指紧，并固定到位。</li>
	<li>将每个注射器连接到一个 3-2 阀。注射器应连接到阀门的中间端口（图2B）。</li>
	<li>将每个 5 mL 注射器固定到双注射器泵，并调整机械止动圈，以防止从推杆块向注射器施加过压。在设置止动环时，请记住添加磁性搅拌器。</li>
	<li>使用超级球形螺母、FEP 套筒和超级球杆套管将自制微流体流系统的每个注入毛细管端连接到每个 3-2 阀的顶部端口（图 2B）。</li>
	<li>到3-2阀（底部端口）的剩余打开端口，使用超级瓶螺母、FEP套筒和超级跳蚤套（图2B）连接10厘米450μm的毛细管。这些毛细血管成为提取的样品毛细血管。</li>
	<li>启动泵流量并检查微流体流系统的所有连接，有无目视泄漏。使用实验流速至少流动三个注射器体积。最终流速取决于激光照射窗口、激光频率和零排位分数体积。 注：对于此协议，从激光照射窗口 2.55 mm、250 μm i.d.熔融石英、零排除分数和 50 Hz 频率计算了最终流速 375.52 μL/min。<ol>
<li>流道由 3-2 阀手柄上的箭头标记。通过将阀手柄从排出位置移到回退位置，可以手动重新填充每个注射器。 注：3-2 阀处的泄漏可以通过重新拧入超级阀螺母或更换任何阀连接（超级跳蚤螺母、FEP 套筒或超级滚圈套）来修复。混合-T 处的泄漏需要重新组装微流体流系统（步骤 2.1 到 2.11）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将微流体流系统移到实验台，并使用 360 μm o.d. 不锈钢联合将出口毛细管固定到辐射阶段（图 2Figure 2C，D）。</li>
	<li>使用长距离打火机，在激光照射窗口燃烧熔融石英的涂层。使用无绒组织和甲醇清洁燃烧的涂层。 注：在燃烧周期和甲醇清洗周期之间交替，以避免毛细管过热，因为多余的热量会融化和/或打破毛细管。</li>
	<li>将磁性搅拌器块置于包含磁性搅拌器的 5 mL 注射器上方。调整磁搅拌器块的速度和位置，使 5 mL 注射器内的磁性搅拌器缓慢而持续地旋转。</li>
</ol>4. 体内 FPOP
<ol><li>打开 KrF 兴奋激光器，让胸腺预热。 注意：激光以248nm波长发出可见和不可见的辐射，可能损害眼睛。在打开激光并打开光束出口窗口之前，应佩戴适当的护眼。</li>
	<li>通过将光学传感器放在光束出口窗口，测量至少 100 个脉冲的频率为 50 Hz 的激光能量。 注：对于此协议，使用激光能量为 150 ± 2.32 mJ 的 2.55 mm 辐照窗口。</li>
	<li>获取大约 10，000 个蠕虫（500 μL），然后手动将样品提取到样品注射器中。</li>
	<li>将样品注射器填充 2.5 mL M9 缓冲液，最终采样体积为 3 mL。确保样品注射器中未引入气泡。</li>
	<li>将第二个注射器填充 3 mL 的 200 mM H2O2，再次确保注射器中未引入气泡。</li>
	<li>在出口毛细管的末端， 放置一个15 mL锥形管包裹在铝箔中，含有6 mL的40 mM N'-二甲基硫柳体（DMTU），40 mM N-tert-丁基-β-苯基硝基（PBN），和1%二甲基硫氧化物，分别淬火过量的H2O2，羟基，并抑制二氧化二氧化碳还原酶活性。</li>
	<li>从软件窗口启动兴奋激光器，等待第一个脉冲，然后从双注射器启动样品流。 注：样品应在3种样品条件下以生物复制品进行技术三联：H2O2（样品）激光照射，无H2O2激光照射，无H2O2（控制）激光照射，每组生物组共9个样品。</li>
	<li>在 15 mL 管中收集整个样品，同时主动监控样品流量，防止任何视觉泄漏，因为样品注射器的一些背压有时会积聚。</li>
	<li>IV-FPOP 后，颗粒蠕虫在 805 x g上离心 2 分钟。去除淬火溶液，加入 250 μL 裂解缓冲液（8 M 尿素，0.5% SDS，50 mM HEPES，50 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM 苯甲二硫化氟化物 [PMSF]）。将样品转移到干净的微离心管中，闪速冻结，并储存在-80°C，直到样品消化。</li>
</ol>5. 蛋白质提取、纯化和蛋白质解
<ol><li>解冻冰冻样品在冰上，通过声波均匀10s，然后60s冰孵育。可能需要多轮声波，通过在显微镜幻灯片上放置 2 μL 样品等值，可以在立体显微镜下观察到均质。当看到小到没有蠕虫时，样品均质化是完整的。</li>
	<li>在 4°C 下以 400 x g的离心化蠕虫 5 分钟，并将上清液收集到干净的微离心管中。</li>
	<li>使用双仁蛋白酸测定（BCA测定）使用制造商的说明确定样品蛋白浓度。 注：样品浓度可以使用任何生化蛋白浓度测定选择来确定。请记住试剂与裂化缓冲液的兼容性（8 M 尿素、0.5% SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF）。此外，可能需要稀释缓冲液。</li>
	<li>从每个样品中获取100微克蛋白质，并放置在干净的微离心管中。</li>
	<li>将二硫硫醇 （DTT） 添加到 10 mM 的最终浓度中，以减少所有样品中的二硫化物键。涡旋，向下旋转，在50°C下孵化样品45分钟。</li>
	<li>将样品冷却至室温 10 分钟。</li>
	<li>将碘酰胺 （IAA） 添加到 50 mM 的最终浓度中，以降低残留物的酸化。在室温下，在室温下，涡旋、减速和孵育样品20分钟，防止光线照射。</li>
	<li>在烷基化后，立即加入4卷100%预冷却丙酮，并在-20°C孵育过夜，从而沉淀蛋白质样品。</li>
	<li>第二天，颗粒蛋白在16，000 x g的离心沉淀下沉淀10分钟。 用90%丙酮清洗样品颗粒，去除上清液，让颗粒干燥2~3分钟。</li>
	<li>在 25 mM Tris-HCl （1 μg/μL） 中重新悬浮蛋白质颗粒。在最终蛋白酶与蛋白质比为1：50（w/w）时加入胰蛋白酶，并在37°C下消化样品过夜。</li>
	<li>第二天，通过加入5%的酸，来抑制胰蛋白酶消化反应。 注：LC-MS/MS 分析（步骤 6.1-6.5）每个样品至少需要 0.5 μg 的肽。使用定量色度肽测定（参见材料表）确定样品肽浓度，如制造商的协议所述。</li>
</ol>6. 高性能液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）
<ol><li>使用以下 LC 移动相：0.1% FA （A） 中的水，0.1% FA （B） 中的 ACN 中的水。</li>
	<li>将0.5 μg肽加载到含有C18（5 μm，100°）的陷阱柱上，用99%溶剂A和1%B清洗样品15分钟，15 μL/min流速。</li>
	<li>使用内部包装柱（0.075 毫米 i.d. = 20 mm）与 C18 反向相材料（5 μm，125°）分离肽。</li>
	<li>使用以下分析分离方法：梯度以 300 nL/min 泵送 120 分钟：0~1 分钟，3% B;2~90分钟，10~45%B;100~105分钟，100%B;106~120 分钟，3% B.</li>
	<li>使用高分辨率质谱仪在正电拉模式下对肽进行数据采集， 纳米电喷雾电电化 （nESI）。 注：对于此协议，使用了超高性能 LC （UPLC） 仪器耦合到高分辨率质谱仪。利用数据依赖获取。MS1 的 m/z 扫描范围为 3750~1500，分辨率为 60，000，动态排除为 60。不包括电荷状态为 +1 和 >6 的离子。使用 5.5e5 的自动增益控制 （AGC） 目标，最大喷射时间为 50 ms，强度阈值为 5.5e4。为 MS2 选择的离子使用 32% 的规范化碰撞能量受到高能碰撞分离 （HCD） 碎片。在光谱仪中检测到具有 15，000 分辨率和 5.0e4 AGC 目标的片段离子。</li>
</ol>7. 数据分析
<ol><li>使用自下而上的蛋白质组学分析软件搜索针对C. elegans数据库的串联 MS 文件。</li>
	<li>将蛋白质分析搜索参数设置为如下：一个胰蛋白酶缺失裂解，375~1500 m/z肽质量范围，片段质量公差0.02，前体质量公差为10 ppm。卡酰胺甲基化被设置为静态修饰，众所周知羟基基侧链修饰99，1010为动态。肽识别在 95% 置信度（中等）和残留 99% 置信度（高）处确定。错误发现率 （FDR） 设置为 1%。</li>
	<li>将数据导出到电子数据库，并使用以下11的方程汇总每个肽或残留物的氧化程度： <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60910/60910eq2.jpg"> 注：其中EIC区域修改是肽或具有氧化改性残留物的提取的电子色谱面积（EIC），而EIC区域是同一肽或残留物的总面积，有无氧化修饰。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+for+Epitope+Mapping.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. 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R., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mapping+of+protein+structure+by+hydroxyl+radical+footprinting-mediated+structural+mass+spectrometry:+a+protection+factor+analysis.">Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis.</a> Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).</li><li>Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. 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本出版物是部分完成JAE博士的。提交人声明没有利益冲突。

目前研究体内蛋白-蛋白质相互作用（PPI）的基准是荧光共振能量转移（FRET）。在最简单的形式中，这种技术研究PPI通过能量转移两个分子之间，当他们彼此接近15。与 MS 技术不同，FRET 没有在氨基酸水平上描述构象变化和相互作用位点的分辨率。基于MS的技术越来越多地用于PPI16的研究。IV-FPOP是一种HRPF方法，它允许在C.elegans中进行体内蛋白结构分析。为了通过IV-FPOP成功地标记C.elegans，正确组装微流体流系统以减少样品损失非常重要。250 μm i.d. 毛细血管表明，与较小的毛细血管4相比，可最大限度地提高样品回收率。较大的毛细血管尚未经过测试，但微流体流系统的设计使用毛细管，其设计方式与商用流细胞测量系统相同，用于分拣C.elegans。17蠕虫样本大小也很重要，在FPOP之前，每个样品的样本量小于10，000，其蛋白质浓度不足以用于LC-MS/MS分析。通过调整初始起始体积（步骤 4.5），也可以使用更高的样本大小（>10，000 蠕虫）。
正确装配微流体流系统非常重要。样品路径中的泄漏导致蠕虫或 H2O2的流量不一致。如果每次实验后正确清洁，可以从多个 IV-FPOP 实验中重复使用套管、套筒和 3-2 阀。然而，我们建议为每个生物复制组装一个新的微流体流系统。如果微流体组装得当，蠕虫和H2O2将在混合T处混合，背压最小。作为微流体流系统的质量控制 （QC），我们建议使用彩色染料测试混合效率。在 IV-FPOP 期间，监控蠕虫注射器内的磁性搅拌器的运动非常重要，在蠕虫注射器处混合不当样品或混合-T 可能会导致背压导致泄漏。此外，混合条件差会导致样品大量流失、激光窗口的蠕虫激光暴露不良以及堵塞。
C. elegans维护对于减少背景氧化非常重要。我们建议在低应力条件下在低温下生长蠕虫，因为高温会影响整体背景氧化。建议所有 IV-FPOP 实验只进行一组控制样本蠕虫，无 H2O2和激光照射，以考虑实验室维护导致的背景氧化。该技术目前的限制之一是鉴定的氧化改性肽总数和每个肽氧化的残留物总数，以获得更高的蛋白质结构信息。虽然不建议增加氧化改性，但使用高浓度过氧化氢可以实现。过氧化氢的增加可以显著改变重要的生物途径，并导致氧化引起的展开。如果IV-FPOP的过氧化氢浓度增加，建议测试蠕虫的可行性和背景氧化，因为浓度高于200 mM尚未测试。
所述LC-MS/MS协议可以进行优化和修改，以满足其他实验室的MS QC要求。使用2D色谱技术之前已被证明能增加氧化改性肽和蛋白质18的识别。尽管如此，不推荐针对特定蛋白质的蛋白质富集技术，包括但不限于抗体沉淀或下拉测定。如果蛋白质的表位/结合位点已被IV-FPOP氧化修饰，这些技术可能会偏向一个蛋白质凸虫。封装基试剂的新发展，如硫酸盐基阴10或三氟甲基化19可以增加IV-FPOP的多功能性。尽管迄今为止在体内测试的唯一标记试剂是过氧化氢，但其他激光激活基可以优化。其他基的使用应证明与蠕虫的生存能力、细胞渗透性和248nm激光波长兼容。由于使用C.elegans作为许多人类疾病的模型系统，IV-FPOP在研究蛋白质结构在疾病发病机制中的作用方面具有强大的影响。

蛋白质足迹与质谱（MS）结合近年来被用于研究蛋白质相互作用和构象变化。羟基基蛋白足迹（HRPF）方法通过修改蛋白质氨基酸侧链来探索蛋白质溶剂的可访问性。HRPF方法，蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）1，1已用于探索体外蛋白结构2，细胞内（IC-FPOP）3，最近体内3（IV-FPOP）4。4FPOP利用248nm波长的兴奋激光，通过过氧化氢的光解来快速产生羟基基，形成羟基1。反过来，这些基基可以在一微秒的时间尺度上标记20个氨基酸中的19个，比蛋白质可以展开的速度要快。虽然，每个氨基酸与羟基基的活性延伸1000倍，可以通过计算保护因子（PF）5来使侧链氧化正常化。
由于FPOP可以氧化地修饰蛋白质，无论其大小或原序如何，它证明有利于细胞内和体内蛋白质研究。IV-FPOP探测C.elegans中的蛋白质结构，类似于体外和细胞内研究4。Elegan是线虫家族的一部分，被广泛用作研究人类疾病的模型。蠕虫通过被动扩散和主动扩散来获取过氧化氢的能力，可以研究不同身体系统中的蛋白质结构。此外，C. elegans适合 IV-FPOP，因为它们在 FPOP6所需的 248 nm 激光波长时具有透明度。该方法与质谱相结合，允许使用传统的自下而上蛋白质组学方法识别多种修饰的蛋白质。
在此协议中，我们描述了如何执行IV-FPOP来分析C.elegans中的蛋白质结构。实验协议要求为从科纳曼等7号系统改编的IV-FPOP的微流体流系统的组装和设置。IV-FPOP后，样品均质化为蛋白质提取。蛋白质样品是蛋白酶解的，肽通过液体色谱（LC）串联MS进行分析，然后进行定量分析。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1299px;" width="1299">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:251px;">any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock</td>
			<td style="width:179px;">SGE Analytical Science</td>
			<td style="width:161px;">008760</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">60 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FM3279</td>
			<td>This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Acetone, HPLC Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td style="width:179px;">Waters</td>
			<td style="width:161px;">186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td style="width:179px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Delicate Task Wipers</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Dissecting Needle</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50-822-525</td>
			<td>only a couple are needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td style="width:179px;">AmericanBio</td>
			<td style="width:161px;">AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy instant mix 5 minute</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">EX350 excimer laser (248 nm wavelength)</td>
			<td style="width:179px;">GAM Laser</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">FEP Tubing 1/16&#34; OD x 0.020&#34; ID</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">1548L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">HV3-2 VALVE</td>
			<td style="width:179px;">Hamilton</td>
			<td>86728</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td style="width:179px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:161px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Legato 101 syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">P-618L</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">N,N&#8242;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td style="width:179px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:161px;">116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">NanoTight Sleeve Green 1/16&#34; ID x .0155&#34; ID x1.6&#34;&#39;</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">F-242X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">NanoTight Sleeve Yellow 1/16&#34; OD x 0.027&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">F-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td style="width:179px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:161px;">177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">7110-OP</td>
			<td>any protease inhibitor is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td style="width:179px;">Ophir Optronics</td>
			<td style="width:161px;">7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">Molex</td>
			<td style="width:161px;">1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250&#181;m, Outer Diameter 350&#181;m, TSP250350</td>
			<td style="width:179px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:161px;">1068150026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:708px;">Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450&#181;m, Outer Diameter 670&#181;m, TSP450670</td>
			<td style="width:179px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:161px;">1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:708px;">Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75&#181;m, Outer Diameter 375&#181;m, TSP075375</td>
			<td style="width:179px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:161px;">1068150019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P382-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Proteome Discover (bottom-up proteomics software)</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">OPTON-30799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Rotary Magnetic Tumble Stirrer</td>
			<td style="width:179px;">V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:161px;">VP 710D3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps</td>
			<td style="width:179px;">V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:161px;">VP 710D3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50-111-1315</td>
			<td>any scissors are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Self-Adhesive Label Tape</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15937</td>
			<td>one roll is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">05-402</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15-525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Stereo Zoom Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">03-000-014</td>
			<td>a magnifying glass is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; OD</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">P-259X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; &#38; 1/32&#34; OD</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">P-255X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick</td>
			<td style="width:179px;">V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:161px;">VP 722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Tris Base</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Universal Base Plate, 2.5&#34; x 2.5&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:161px;">UBP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">VHP MicroTight Union for 360&#181;m OD</td>
			<td style="width:179px;">IDEX Health &#38; Sciene</td>
			<td style="width:161px;">UH-436</td>
			<td>2 minimum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:708px;">Water, LC/MS Grade</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in caenorhabditis elegans

蛋白质的快速氧化（FPOP）是一种羟基基基蛋白足迹（HRPF）方法，用于研究蛋白质结构、蛋白质-配体相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用。FPOP利用248 nm的KrF兴奋激光对过氧化氢进行光解，以产生羟基基，从而氧化地改变溶剂可进入的氨基酸侧链。最近，我们扩大了FPOP在Caenorhabditis elegans（C. elegans）体内氧化标记的使用，名为IV-FPOP。透明线虫被用作许多人类疾病的模型系统。IV-FPOP在C.elegans的结构研究是可行的，因为动物能够接受过氧化氢，在248nm处激光照射的透明度，以及这种改变的不可逆性。本文介绍了用于IV-FPOP标签、IV-FPOP参数、蛋白质提取和LC-MS/MS优化参数的微流体流系统的组装。

在用于IV-FPOP的微流体流系统中，H2O2和蠕虫被分离，直到激光照射之前。这种分离消除了H2O2由内2源催化酶和其他细胞机制12的分解。使用 250 μm i.d. 毛细血管显示两个生物复制的总样品回收率在 63-89% 之间，而 150 μm i.d. 毛细血管仅显示 21-31% 的回收率（图 3A）。与较小的毛细管（150 μm）相比，使用较大的毛细管（250 μm）可改善IV-FPOP和单蠕虫流动（图3B）期间的蠕虫流动（图3B）。150 μm i.d. 毛细管不允许单蠕虫流动（图3C），在激光辐照窗口看到多个蠕虫一起流动，从而减少了每个蠕虫的激光暴露量。
IV-FPOP是一种共价标签技术，用于探测C.elegans中的溶剂可访问性。图 4A显示了 FPOP 改性和非改性肽的代表性提取的ion色谱图 （EIC）。羟基基标签改变了氧化改性肽的化学成分，从而使FPOP改性肽更加极性。在反向相色谱中，IV-FPOP改性肽的保留时间比未修饰的肽早。分离肽的MS/MS碎片允许识别氧化改性残留物（图4B）。
IV-FPOP已被证明在C.elegans内的两个生物复制体上，在氧化性上共修改了545种蛋白质（图5A，B）。IV-FPOP作为蛋白质足迹方法的优点依赖于该技术在蠕虫体内各种身体系统中修改蛋白质的能力（图5C）。这种方法将允许探索蛋白质结构和蛋白质相互作用，而不管蠕虫体内的身体组织或器官如何。此外，串联 MS 分析确认 IV-FPOP 探头在体内可访问溶剂。分析了热休克蛋白90（Hsp90）与肌苷护身蛋白UNC-45复合的氧化模式（图6）。Hsp90的MS/MS分析表明四种氧化改性残留物（图6C，D），FPOP改性（ln（PF））5的标准化范围表明Hsp90的残留物M698在与UNC-45结合时，其溶剂可利用量低于残留物R697、E699和E700（图6C）。5这些氧化差异通过文献溶剂可访问表面积（SASA）计算（PDB 4I2Z13）进行验证。残留物 M698 的 SASA 值为 0.03，与 SASA 值较高的残留物 R697、E699 和 E700 相比，该值被视为埋藏残留物（图 6C）。14
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig1.jpg"> 图 1.体内FPOP微流体流系统原理图。（A） IV-FPOP 流系统的两条注入线（橙色）显示在 FEP 管（黄色）内，环氧树脂的正确结合位置由浅蓝色圆圈表示。（B） 由三个 250 μm i.d. 毛细血管形成的完全组装混合-T。出口毛细管与 FEP 管的正确树脂结合位置由浅蓝色圆圈表示。（C） 完整的组装流系统，用于C. elegans的体内共价标记。在 FPOP 之前，蠕虫与 H2O2分离，直到标记之前;激光照射窗口以浅蓝色显示，激光束由紫色闪电表示。数字不能缩放。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig2.jpg"> 图 2.IV-FPOP 期间的微流体系统。（A） 5 mL注射器内C. elegans的代表图片。不搅拌，蠕虫会沉淀在注射器的底部（左图）。在 IV-FPOP 实验期间，磁性搅拌器和搅拌器块使蠕虫保持悬架（右）。（B） 代表图片的5 mL注射器，注入毛细管，并撤回与3-2阀相连的毛细管。3-2 阀手柄显示在退出位置。（C） IV-FPOP 期间的微流体流系统，磁搅拌块位于蠕虫的 5 mL 注射器上方。（D） 出口毛细管固定在辐射阶段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig3.jpg"> 图 3.使用两个 i.d. 毛细血管比较C. elegans流动和恢复。（A） 在 IV-FPOP 后，两种生物复制剂 （BR） 的蠕虫恢复百分比为 250 （灰色） 和 150 （黑色） μm i.d. 毛细血管。误差条根据技术三脚架的标准差计算。C. 通过激光辐照窗口通过250 μm （B） 和 150 μm （C） （ d. 毛细血管） 流动的elgan. 蠕虫在较小的毛细管中更紧密地压缩。毛细管的150μm表示蠕虫结块。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig4.jpg"> 图 4.IV-FPOP 之后具有代表性的 LC-MS/MS 结果。（A） FPOP改性肽（红色）和未修饰（蓝色）的 EIC。选定的肽属于actin-1蛋白。（B） MS/MS 光谱的双电荷未改性作用-1肽 317-327。（C） MS/MS 光谱的双倍电荷 FPOP 改性作用素 -1 肽 317-327， 在此示例中 P323 被氧化改性修改 （y5+电子， 红色）.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig5.jpg"> 图 5.IV-FPOP氧化修饰C.elegan人体内的蛋白质。（A） 在两个生物复制体 （BR） 存在 200 mM 过氧化氢 （BR） 时，氧化改性蛋白质的 Venn 图为蓝色，BR2 为黄色。（B） 在辐照样品中识别的氧化改性蛋白质的 Venn 图、过氧化氢控制和仅在 BR2 中的蠕虫控制，跨越技术三联。（C） 不同C. elegans身体系统中氧化改性蛋白质的饼图。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig6.jpg"> 图 6.将 IV-FPOP 修改与溶剂可访问性联系起来。（A） 肌辛护行蛋白 UNC-45 （灰色） （PDB ID 4I2Z13） 突出显示 LC/MS/MS 分析识别的两种改性肽， 669_680 和 698_706 （绿色， 左内位）。UNC-45 与 Hsp90 肽片段（蓝色）绑定。此片段中的氧化修饰残留物以棒（红色）显示，UNC-45 呈现为表面（右插页）。（B） UNC-45 肽 669×680（顶部）和 698×706（底部）的串联 MS 光谱显示 B 离子和 y 离子的 CO2损失，FPOP 修改。（C） Hsp90氧化改性残留物、R697、M698、E699 和 E700 的计算 ln（PF）。Hsp90 的计算 SASA 值表示在每个残渣上方。（D） R697、M698、E699 和 E700 的串联 MS 光谱显示 +16 FPOP 修改。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>

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In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

体内蛋白质快速光化学氧化（IV-FPOP）是一种羟基基基蛋白足迹技术，能够绘制其原生环境中的蛋白质结构图谱。该协议描述了 IV-FPOP 微流体流系统的组装和设置。

在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

体内FPOP蛋白-蛋白质相互作用和C-elegans的蛋白质结构变化。这些动物被广泛用作研究人类疾病的模型系统。通过将体内FPOP与质谱学耦合，我们可以探测活体动物中不同细胞和体舱内的蛋白质-蛋白质相互作用，而无需隔离一种特定的蛋白质。通过切割两厘米的氟化乙烯丙烯或 FPP 管，开始流系统组装。使用干净的解剖针来扩大管子一端的内径，形成一个长度约 15 毫米的小陨石坑。要创建流系统的注入线，请切割至 15 厘米的 250 微米内径熔融石英与陶瓷切割机。将两个毛细管与自粘胶带一起胶带，确保两端 100% 冲洗。将两个毛细管插入 FPP 油管的弹坑中，将它们推到最边缘。将一小点环氧树脂放在干净的表面上，并和解剖针混合。使用相同的针头快速放置一小滴树脂，在注入毛细管的末尾，在那里它们与 FPP 管连接，让树脂干燥出口侧向上几分钟。同时，切割新的250微米内径毛细管，这将成为流系统的出口毛细管。树脂干燥后，将新的毛细管插入 FPP 管出口端。出口毛细管的内端和两个注入毛细管应相互冲洗，形成混合茶。如前所述，用新鲜的环氧树脂与毛细管和FPP管粘合，使流动系统在一夜之间干燥。在一个五毫升注射器内插入四个磁力搅拌器，以防止蠕虫在体内快速光化学氧化蛋白质或体内的 FPOP 期间在此注射器中沉淀。用 M9 填充此和额外的五毫升注射器，确保避免产生气泡。将下部适配器连接到每个注射器，确保它们手指紧固并固定到位。然后，将每个注射器连接到单个三二阀的中间端口。将每个注射器固定到双注射器泵，并调整机械颜色，以防止来自推杆块的过压。使用超级法兰列表，而不是 FEP 套筒和超级法兰列表变量，将先前制作的微流体系统的每个注入毛细管端连接到每个三两个阀的顶部端口。最后，将一个10厘米450微米的内径毛细管连接到阀门的底部端口，作为提取样品毛细管。启动泵流量并目视检查所有连接有无泄漏。使用实验流速至少流三个注射器体积。流道由三两个阀手柄上的箭头标记，每个注射器可以通过将阀手柄从排出位置移动到退出位置手动重新填充。检查微流体流系统后，将微流体流系统移动到实验台，用不锈钢结合将出口毛细管固定到辐射阶段。使用伸长打火机在激光照射窗口燃烧熔融石英涂层，并使用绒组织及甲醇清洁燃烧的涂层。用磁搅拌器将磁搅拌器块放在注射器上方，并调整速度，使搅拌器缓慢而持续地旋转。打开 Krypton 氟化物兴奋激光器，让甲状腺 tron 预热。通过将光学传感器放置在光束出口窗口，以 50 赫兹的频率测量激光能量，至少 100 个脉冲。在500微升体积中手动提取约1万只蠕虫进入样品注射器。然后用2.5毫升的M9缓冲液填充，确保避免气泡。样本大小至少为 10，000 个蠕虫非常重要。样本量越小，下游蛋白质分析的蛋白质产量就会低。将第二个注射器中填上三毫升200毫摩尔过氧化氢。在出口毛细管的末端，放置一个15毫升的圆锥管，其中6毫升为40毫摩尔DMTU，40毫升PBN，1%的时间是苹果酱氧化物。从软件窗口启动兴奋激光器，等待第一个脉冲，然后从双注射器启动样品流。在 15 毫升管中收集整个样品，同时主动监测样品流量是否有任何视觉泄漏。在体内FPOP后，以805倍g离心对蠕虫进行两分钟的颗粒。吸灭淬火溶液，并添加250微升的许可缓冲液。将样品转移到干净的微型离心管中，将其闪光冻结并储存在负80摄氏度，直到样品消化。使用具有两个不同内径的毛细血管在体内FPOP后对蠕虫回收进行比较。当使用250微米内径毛细管时，在两个生物复制中实现了63%至89%的总样本回收率。使用 150 微米内径毛细管只能回收 21 至 31%。使用更大的内径毛细管，导致在体内FPOP期间更好的蠕虫流动，较小的毛细管不允许单蠕虫流动，并且看到多个蠕虫在激光辐射窗口一起流动，从而减少每个蠕虫的激光照射量。代表性提取的FPOP改性、未经改性肽的离子色谱表明，羟基基改变了氧化改性肽的化学成分，使其更具极性。在反相色谱中，体内FPOP改性肽的保留时间比未改性肽要早。MS分离肽的碎片，允许识别氧化改性残留物。体内FPOP在C-elegans的两个生物复制体中氧化地修改了总共545种蛋白质。这种蛋白质足迹方法的一个优点是它能够在蠕虫的各种身体系统中修改蛋白质。Tandem MS 分析确认体内 FPOP 探针溶剂在体内的可访问性。分析了热休克蛋白90与米奥辛伴经蛋白UNS45的氧化模式，发现了4种氧化修饰残留物。使用C-elegans在体内FPOP，提供了研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质结构在疾病发病机制中的作用的潜力。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

科研

生物化学

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

使用脚手架脂质体重构脂质近端蛋白质 - 蛋白质相互作用<em&gt;体外</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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化细胞穿透肽研究胞内蛋白-蛋白质相互作用

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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一种简单的高通量化学筛选方法在秀丽线虫中的应用

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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线虫线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定

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Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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基于板块的秀丽线虫规模化栽培: 糖尿病代谢变化研究的样品制备

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

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放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

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生物层干涉测量(BLI)在转录中研究蛋白质-蛋白质相互作用的应用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

无激光羟基基蛋白足迹，对蛋白质进行更高级的结构分析

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...