6.5K Views
•
08:00 min
•
April 1st, 2020
DOI :
April 1st, 2020
•0:04
Introduction
0:30
Microfluidic Flow System Assembly
2:05
Microfluidic Flow System for in vivo FPOP
4:13
In vivo FPOP
5:52
Results: IV-FPOP Oxidative Modification of Proteins within C. elegans
7:37
Conclusion
Transcript
In vivo FPOP protein-protein interaktioner og protein struktur ændringer i C-elegans. Disse dyr er meget udbredt som en model system til at studere sygdomme hos mennesker. Ved at koble in vivo FPOP til massespektrometri kan vi sonde proteinproteininteraktioner inden for forskellige celle- og kropsrum i et levende dyr uden at skulle isolere et bestemt protein.
Begynd flowsystemet forsamling, ved at skære en to centimeter stykke fluorholdige ethylen propylen eller FPP slanger. Brug en ren dissekerende nål til at udvide den indre diameter i den ene ende af slangen, hvilket skaber et lille krater omkring 15 millimeter i længden. For at skabe de infusionslinjer af flowsystemet, skåret til 15 centimeter stykker af 250 mikrometer indre diameter smeltet silica med en keramisk fræser.
Og tape de to kapillærer sammen med selvklæbende tape, og sørg for, at enderne er 100% skyllet. Sæt de to kapillærer ind i FPP-slangens krater og skub dem op til kanten. Placer en lille prik epoxy harpiks på en ren overflade, og bland det med dissekerende nål.
Brug den samme nål til hurtigt at placere en lille dråbe harpiks, i slutningen af infusion kapillærer, hvor de forbinder med FPP slanger, lad harpiksen til at tørre stikkontakt side op i et par minutter. I mellemtiden skæres en ny 250 mikrometer indre diameter kapillær, som vil blive udløb kapillær af flowsystemet. Når harpiksen er tørret, indsættes den nye kapillær i FPP-slangeudgangen.
De indvendige ender af udløbet kapillær og de to infusion kapillærer bør skylles mod hinanden, hvilket skaber blande te. Bind til kapillær og FPP slanger med frisk epoxy harpiks som tidligere beskrevet, og lad flowsystemet tørre natten over. Indsæt fire magnetiske omrørere, inde i en fem milliliter sprøjte, som vil forhindre orme fra afregning i denne sprøjte under in vivo hurtig fotokemisk oxidation af proteiner eller in vivo FPOP.
Fyld dette og en ekstra fem milliliter sprøjte med M9, og sørg for at undgå at skabe bobler. Tilslut en lavere adapter til hver sprøjte, og sørg for, at de er fingertætte og fastgjort på plads. Derefter vedhæfte hver sprøjte til den midterste port af en enkelt tre-to ventil.
Fastgør hver sprøjte til den dobbelte sprøjtepumpe, og juster den mekaniske farve for at forhindre overtryk fra skubbeblokken. Brug en super flange liste ikke FEP ærme og super flange liste variabel til at fastgøre hver infusion kapillær ende af den tidligere lavet microfluidic system til den øverste port af hver tre-to ventil. Endelig vedhæfte en 10 centimeter 450 mikrometer indre diameter kapillær til den nederste port af ventilen, som vil tjene som tilbagetrækning prøve kapillær.
Start pumpestrømmen, og undersøg alle tilslutninger visuelt for utætheder. Luft mindst tre sprøjtevolumener ved hjælp af den eksperimentelle strømningshastighed. Flowstien er markeret med pilene på tre-to ventilhåndtaget, og hver sprøjte kan genopfyldes manuelt ved at flytte ventilhåndtaget fra udvisning til tilbagetrækningsposition.
Efter inspektion af mikrofluidic flow system, flytte den til den eksperimentelle bænk, og fastgør stikkontakten kapillær til udstrålende fase med en rustfri stål union. Brug en langtidsudspærret lighter til at brænde belægningen af den sammensmeltede silica ved laserbestrålingsvinduet og rengør den brændte belægning med fnugvæv og methanol. Placer den magnetiske omrørerblok over sprøjten med de magnetiske omrør og juster hastigheden, så rørene roterer langsomt og konstant.
Tænd for Krypton fluorid excimer laser og lad skjoldbruskkirtlen tron til at varme op. Mål laserenergien med en frekvens på 50 hertz i mindst 100 impulser ved at placere den optiske sensor ved stråleudgangsvinduet. Træk manuelt ca. 10.000 orme i et 500 mikrolitervolumen ind i prøvesprøjten.
Fyld den derefter med 2,5 milliliter M9-bufferen, og sørg for at undgå luftbobler. Det er vigtigt at have en stikprøvestørrelse på mindst 10.000 orme. En mindre stikprøvestørrelse vil resultere i et lavt proteinudbytte for downstream proteomisk analyse.
Fyld den anden sprøjte med tre milliliter 200 millimolar hydrogenperoxid. Ved udgangen af udløbskapillæren anbringes et konisk rør på 15 milliliter med seks milliliter 40 millimolar DMTU, 40 millimolar PBN og 1 % æblemosoxid. Start excimer laser fra software vinduet, vente på den første puls og starte prøven flow fra den dobbelte sprøjte.
Hele prøven opsamls i 15 milliliterrøret, mens prøvestrømmen aktivt overvåges for eventuelle visuelle lækager. Efter in vivo FPOP pellets ormene ved centrifugering ved 805 gange g i to minutter. Aspirere dæmpningsopløsningen og tilsæt 250 mikroliter med en licenseret buffer.
Overfør prøven til et rent mikrocentrifugerør, flash fryse det og opbevares ved negative 80 grader Celsius, indtil prøven fordøjelse. orm opsving blev sammenlignet efter in vivo FPOP ved hjælp af kapillærer med to forskellige interne diametre. Når en 250 mikrometer indre diameter kapillær blev anvendt, en samlet prøve opsving mellem 63 og 89% blev opnået på tværs af to biologiske replikater.
Ved hjælp af en 150 mikrometer indre diameter kapillær resulterede i kun 21 til 31% opsving. Brugen af en større indre diameter kapillær, fører til bedre orm flow under in vivo FPOP, de mindre kapillær ikke giver mulighed for enkelt orm flow, og flere orme ses flyder sammen på laser udstrålende vindue, hvilket reducerer mængden af laser eksponering pr orm. Repræsentative ekstraheret ionkromatograms af et FPOP modificeret og uændret peptid viste, at hydroxyl radikal ændrer kemien i oxidativt modificerede peptider gør dem mere polære.
I omvendt fase kromatografi, in vivo FPOP modificerede peptider har tidligere retention gange end umodificerede peptider. MS fragmentering af isolerede peptider, giver mulighed for identifikation af oxidativt modificerede rester. In vivo FPOP har oxidativt modificeret i alt 545 proteiner på tværs af to biologiske replikater inden for C-elegans.
En fordel ved denne protein fodaftryk metode, er dens evne til at ændre proteiner, i en række kropssystemer i ormene. Tandem MS analyse bekræfter in vivo FPOP sonde opløsningsmiddel tilgængelighed in vivo. Oxidation mønster af varmechok protein 90 i kompleks med myosin chaperone protein UNC 45, blev analyseret og fire oxidativt modificerede rester, blev fundet.
Brugen af C-elegans til in vivo FPOP giver mulighed for at undersøge proteinproteininteraktioners rolle og proteinstruktur i sygdomspatogenese.
In vivo hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IV-FPOP) er en hydroxyl radikal protein fodspor teknik, der giver mulighed for kortlægning af proteinstruktur i deres oprindelige miljø. Denne protokol beskriver samling og opsætning af IV-FPOP mikrofluidic flow system.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved