In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

In vivo FPOP protein-protein interaksjoner og protein struktur endringer i C-elegans. Disse dyrene er mye brukt som et modellsystem for å studere menneskelig sykdom. Ved å koble in vivo FPOP til massespektrometri, kan vi undersøke protein-protein interaksjoner i forskjellige cellulære og kroppsrom i et levende dyr uten behov for å isolere ett bestemt protein.

Start strømningssystemenheten ved å kutte et to centimeter stykke fluorisert etylenpropylen eller FPP-rør. Bruk en ren dissekeringsnål for å utvide den indre diameteren i den ene enden av slangen, og lag et lite krater ca 15 millimeter i lengde. For å skape infuserende linjer i strømningssystemet, kutt til 15 centimeter stykker av 250 mikrometer indre diameter smeltet silika med en keramisk kutter.

Og tape de to kapillærene sammen med selvklebende tape, og pass på at endene er 100% spylt. Sett de to kapillærene inn i krateret på FPP-slangen, og skyv dem opp til kanten. Legg en liten prikk epoksyharpiks på en ren overflate, og bland den med den dissekerende nålen.

Bruk den samme nålen til raskt å plassere en liten dråpe harpiks, på slutten av de infuserende kapillærer, hvor de kobles til FPP-slangen, la harpiksen tørke utløpet side opp i noen minutter. I mellomtiden, kutte en ny 250 mikrometer indre diameter kapillær som vil bli utløpet kapillær av strømningssystemet. Når harpiksen har tørket, setter du den nye kapillæren inn i FPP-røruttaket.

Innsiden av utløpskapillæren og de to infuserende kapillærene skal skylles mot hverandre og skape blandete. Bind til kapillær- og FPP-slangen med fersk epoksyharpiks som tidligere beskrevet, og la strømningssystemet tørke over natten. Sett inn fire magnetiske rørere, inne i en fem milliliter sprøyte som vil hindre ormer fra å bosette seg i denne sprøyten under in vivo rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner eller in vivo FPOP.

Fyll dette og en ekstra fem milliliter sprøyte med M9, sørg for å unngå å lage bobler. Koble en lavere adapter til hver sprøyte, og pass på at de er fingertette og sikret på plass. Deretter fester du hver sprøyte til den midterste porten på en enkelt tre-to ventil.

Fest hver sprøyte til pumpen med to sprøyter, og juster den mekaniske fargen for å hindre overtrykk fra pusherblokken. Bruk en superflensliste, ikke FEP-hylse og superflenslistevariabel for å feste hver tilføyning av kapillærenden av det tidligere lagde mikrofluidiske systemet til den øverste porten på hver tre-to-ventil. Til slutt fester du en 10 centimeter 450 mikrometer indre diameter kapillær til den nederste porten på ventilen, som vil tjene som uttaksprøvekapillær.

Start pumpestrømmen og inspiser alle tilkoblinger visuelt for lekkasjer. Strøm minst tre sprøytevolumer ved hjelp av den eksperimentelle strømningshastigheten. Strømningsbanen er merket med pilene på tre-to ventilhåndtaket, og hver sprøyte kan fylles på manuelt ved å flytte ventilhåndtaket fra utvisning til uttaksposisjon.

Etter å ha inspisert det mikrofluidiske strømningssystemet, flytt det til den eksperimentelle benken og fest utløpskapillæren til utstrålende stadium med en rustfritt stålunion. Bruk en lang og lettere til å brenne belegget av smeltet silika ved laserbestrålingsvinduet og rengjør det brente belegget med lovev og metanol. Plasser den magnetiske rørerblokken over sprøyten med de magnetiske rørene og juster hastigheten, slik at rørene roterer sakte og konstant.

Slå på Krypton fluor excimer laser og la skjoldbrusktron å varme opp. Mål laserenergien med en frekvens på 50 hertz i minst 100 pulser ved å plassere den optiske sensoren ved stråleutgangsvinduet. Trekk opp ca. 10 000 ormer manuelt i et 500 mikrolitervolum i prøvesprøyten.

Fyll den deretter med 2,5 milliliter av M9-bufferen, og pass på å unngå luftbobler. Det er viktig å ha en prøvestørrelse på minst 10.000 ormer. En mindre prøvestørrelse vil resultere i et lavt proteinutbytte for nedstrøms proteomisk analyse.

Fyll den andre sprøyten med tre milliliter med 200 millimolar hydrogenperoksid. På slutten av utløpet kapillær, plassere en 15 milliliter konisk rør med seks milliliter av 40 millimolar DMTU, 40 millimolar PBN, og 1% tid eplesausoksid. Start excimer laseren fra programvarevinduet, vent på den første pulsen og start prøvestrømmen fra den doble sprøyten.

Samle hele prøven i 15 milliliter røret, mens aktivt overvåke prøveflyten for eventuelle visuelle lekkasjer. Etter in vivo FPOP, pellet ormene ved sentrifugering på 805 ganger g i to minutter. Aspirer slukkeløsningen og legg til 250 mikroliter lisensiert buffer.

Overfør prøven til et rent mikrosentrigerrør, flash fryse den og lagre på negative 80 grader Celsius til prøve fordøyelsen. worm utvinning ble sammenlignet etter in vivo FPOP ved hjelp av kapillærer med to forskjellige innvendige diametre. Når en 250 mikrometer indre diameter kapillær ble brukt, en total prøve utvinning mellom 63 og 89%ble oppnådd på tvers av to biologiske repliker.

Ved hjelp av en 150 mikrometer indre diameter kapillær resulterte i bare 21 til 31% utvinning. Bruken av en større indre diameter kapillær, fører til bedre orm flyt under in vivo FPOP, mindre kapillær tillater ikke for enkelt orm flyt, og flere ormer er sett flyter sammen på laser utstrålende vinduet, noe som reduserer mengden laser eksponering per orm. Representative ekstraherte ionkromatrammer av et FPOP modifisert og umodifisert peptid viste at hydroksylradikale endrer kjemien til oksidativt modifiserte peptider som gjør dem mer polare.

I omvendt fase kromatografi, in vivo FPOP modifisert peptider har tidligere oppbevaring ganger enn umodifiserte peptider. MS fragmentering av isolerte peptider, gjør det mulig å identifisere oksidativt modifiserte rester. In vivo FPOP har oksidativt modifisert totalt 545 proteiner på tvers av to biologiske repliker i C-elegans.

En fordel med denne proteinavtrykksmetoden, er dens evne til å modifisere proteiner, i en rekke kroppssystemer i ormene. Tandem MS analyse bekrefter in vivo FPOP sonde løsemiddel tilgjengelighet in vivo. Oksidasjonsmønsteret til varmesjokkproteinet 90 i kompleks med myosin chaperoneproteinet UNC 45, ble analysert og fire oksidativt modifiserte rester ble funnet.

Bruken av C-elegans for in vivo FPOP, gir potensial til å studere rollen protein-protein interaksjoner og proteinstruktur i sykdom patogenese.