In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Interações proteína-proteína in vivo FPOP e mudanças na estrutura proteica em C-elegans. Esses animais são amplamente utilizados como um sistema modelo para estudar doenças humanas. Ao acoplar in vivo FPOP à espectrometria de massa, podemos sondar interações proteína-proteína dentro de diferentes compartimentos celulares e corporais em um animal vivo sem a necessidade de isolar uma proteína em particular.

Inicie a montagem do sistema de fluxo, cortando um pedaço de dois centímetros de propileno de etileno fluorado ou tubo fpp. Use uma agulha de dissecação limpa para ampliar o diâmetro interno em uma extremidade do tubo, criando uma pequena cratera de cerca de 15 milímetros de comprimento. Para criar as linhas de infusão do sistema de fluxo, corte para peças de 15 centímetros de 250 micrômetros de diâmetro interno fundidos com um cortador de cerâmica.

E grave os dois capilares junto com fita adesiva, certificando-se de que as extremidades estão 100% lavadas. Insira os dois capilares na cratera da tubulação FPP, empurrando-os até a borda. Coloque um pequeno ponto de resina epóxi em uma superfície limpa e misture-a com a agulha dissecando.

Use a mesma agulha para colocar rapidamente uma pequena gota da resina, no final dos capilares infundidos, onde eles se conectam com a tubulação FPP, permitir que a resina seque lateral por alguns minutos. Enquanto isso, corte um novo capilar de 250 micrômetros de diâmetro interno que se tornará a capilarização de saída do sistema de fluxo. Uma vez que a resina tenha secado, insira o novo capilar na extremidade da tubulação FPP.

As extremidades internas do capilar de saída e os dois capilares infundidos devem ser alinhados um contra o outro, criando o chá de mistura. Ligue-se à tubulação capilar e FPP com resina epóxi fresca como descrito anteriormente, e permita que o sistema de fluxo seque durante a noite. Insira quatro agitadores magnéticos, dentro de uma seringa de cinco mililitros que impedirá que os vermes se instalem nesta seringa durante a oxidação fotoquímica rápida in vivo de proteínas ou in vivo FPOP.

Encha esta e mais cinco seringas mililitros com M9, certificando-se de evitar a criação de bolhas. Conecte um adaptador inferior a cada seringa, certificando-se de que estão com os dedos apertados e fixados no lugar. Em seguida, conecte cada seringa à porta média de uma única válvula de três a dois.

Fixar cada seringa na bomba de seringa dupla e ajustar a cor mecânica para evitar a sobrepressão do bloco de empurrador. Use uma lista de super flange não a manga FEP e a variável lista de super flange para anexar cada extremidade capilar infundiante do sistema microfluido anteriormente feito à porta superior de cada válvula de três-dois. Por fim, conecte um capilar de 10 centímetros de 450 micrômetros de diâmetro interno à porta inferior da válvula, que servirá como capilar da amostra de retirada.

Inicie o fluxo da bomba e inspecione visualmente todas as conexões em busca de vazamentos. Flua pelo menos três volumes de seringa usando a taxa de fluxo experimental. O caminho de fluxo é marcado pelas setas na alça da válvula de três dois, e cada seringa pode ser reabastecida manualmente movendo a alça da válvula de expulsão para a posição de retirada.

Depois de inspecionar o sistema de fluxo microfluido, mova-o para o banco experimental e proteja a capilaridade de saída para o estágio de irradiação com uma união de aço inoxidável. Use um isqueiro de longo alcance para queimar o revestimento da sílica fundida na janela de irradiação a laser e limpar o revestimento queimado com tecido de fiapos e metanol. Posicione o bloco do agitador magnético acima da seringa com as mexis magnéticas e ajuste a velocidade, de modo que as meximentos estejam girando lentamente e constantemente.

Ligue o laser de excimer de flúor de Krypton e deixe o tron da tireoide aquecer. Meça a energia laser em uma frequência de 50 hertz por pelo menos 100 pulsos colocando o sensor óptico na janela de saída do feixe. Retire manualmente aproximadamente 10.000 worms em um volume de 500 microliter na seringa amostral.

Em seguida, encha-o com 2,5 mililitros do tampão M9, certificando-se de evitar bolhas de ar. É importante ter um tamanho amostral de pelo menos 10.000 vermes. Um tamanho amostral menor resultará em um baixo rendimento proteico para análise proteômica a jusante.

Encha a segunda seringa com três mililitros de peróxido de hidrogênio de 200 mililitros. No final da capilarização de saída, coloque um tubo cônico de 15 mililitros com seis mililitros de 40 mililitros de DMTU, 40 mililitros PBN e 1% de óxido de molho de maçã. Inicie o laser excimer da janela do software, aguarde o primeiro pulso e inicie o fluxo amostral a partir da seringa dupla.

Colete toda a amostra no tubo de 15 mililitros, monitorando ativamente o fluxo amostral para quaisquer vazamentos visuais. Depois de in vivo FPOP, pelota os vermes por centrifugação a 805 vezes g por dois minutos. Aspire a solução de sátmite e adicione 250 microliters de buffer licenciado.

Transfira a amostra para um tubo de micro centrífuga limpo, congele-a e armazene a 80 graus Celsius negativo até a digestão da amostra. a recuperação de vermes foi comparada após in vivo FPOP usando capilares com dois diâmetros internos diferentes. Quando foi utilizada uma capilaridade de 250 micrômetros de diâmetro interno, uma recuperação total da amostra entre 63 e 89% foi alcançada em duas réplicas biológicas.

O uso de uma capilar de 150 micrômetros de diâmetro interno resultou em apenas 21 a 31% de recuperação. O uso de um capilar de diâmetro interno maior, leva a um melhor fluxo de vermes durante o In vivo FPOP, o capilar menor não permite um único fluxo de vermes, e vários vermes são vistos fluindo juntos na janela de irradiação laser, o que diminui a quantidade de exposição a laser por verme. Cromatógramas de íons extraídos representativos de um peptídeo modificado e não modificado do FPOP mostraram que o radical hidroxis muda a química dos peptídeos oxidativamente modificados tornando-os mais polares.

Na cromatografia de fase inversa, os peptídeos modificados in vivo FPOP têm tempos de retenção mais cedo do que peptídeos não modificados. A fragmentação de peptídeos isolados em MS permite a identificação de resíduos oxidativamente modificados. In vivo FPOP modificou oxidativamente um total de 545 proteínas em duas réplicas biológicas dentro de C-elegans.

Uma vantagem desse método de pegada de proteínas é sua capacidade de modificar proteínas, em uma variedade de sistemas corporais dentro dos vermes. Análise tandem MS confirma in vivo FPOP sonda solvente acessibilidade in vivo. O padrão de oxidação da proteína de choque térmico 90 em complexo com a proteína de acompanhante de minosina UNC 45, foi analisado e foram encontrados quatro resíduos oxidativamente modificados.

O uso de C-elegans para in vivo FPOP, oferece o potencial de estudar o papel das interações proteína-proteína e estrutura proteica na patogênese da doença.