Name: characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2020-03-11T15:00:00
Duration: 9 min 3 s
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这项工作得到了LMJ NSF CAREER奖（MCB1701692）的支持。

1. 设置IC-FPOP流系统
<ol><li>要开始装配流系统，请使用裂解石切割熔融石英的大小。IC-FPOP 流量系统需要 4 个 12 厘米和 17 厘米熔融石英，内径 （ID） 为 450 μm，外径 （OD） 为 670 μm，2 44 厘米，ID 为 75 μm，OD 为 360 μm，最后两个 57 厘米，ID 为 150 μm，OD 为 360 μm。 注：切割二氧化硅管时，轻轻刮掉聚酰亚胺涂层，然后弯曲以获得最干净的切口。检查以确保它是直切（这是确保没有堵塞或泄漏形式所必需的）。</li>
	<li>使用纳米紧套筒（0.0155"ID X 1/16" OD 360 μm OD 二氧化硅管和 0.027" ID X 1/16" OD 为 670 μm OD 硅硅管）设置 15 个连接，与超级跳蚤螺母 PEEK 1/4-28 平底 1/16" OD 和超级跳蚤 ferrule w/SST 环， Tefzel （ETFE），1/4-28 平底，用于 1/16" OD。根据制造商的协议构造连接（图 1）。</li>
	<li>将 6 个小圆柱形磁铁放入一个 500 μL 注射器中。将注射器与另外 500 μL 注射器和两个 5 mL 注射器一起填充缓冲液并去除空气。如图2A所示，注射器泵上的位置。 注：5 mL注射器大于500μL注射器，因此需要一个垫器来同时拧紧所有注射器到位（图2B）。</li>
	<li>拧紧注射器泵塞，使当电机熄火时，细胞注射器还剩下大约 50 μL。这将为磁力搅拌器留出空间。（图2C-D）。 注意：如果注射器泵对磁铁施加压力，它们会堵塞注射器，并可能导致注射器破裂。</li>
	<li>使用 Luer 适配器，将手动阀连接到每个注射器。组装硅管，如图3所示。 注：将线与单元格 + H2O2一直穿过十字到另一侧。然后将其插入 450 μm ID 硅管中。5 mL注射器中的护套缓冲液的流动速度将快于细胞和H2O2。两侧的护套缓冲器将水动力聚焦到一条线进行辐照。</li>
	<li>将流系统放置在激光旁边。使用打火机，烧掉 450 μm ID 管上的二氧化硅涂层，为激光照射打下一扇窗。</li>
	<li>将包含六个磁铁的细胞注射器上方放置一个磁性搅拌器。</li>
	<li>将注射器泵设置为 492.4 μL/min，最终流速为 1，083.3 μL/min。 流缓冲液通过系统三次冲洗系统并测试是否有泄漏。</li>
	<li>使用凸透镜将兴奋激光聚焦在二氧化硅管上。聚焦后，通过在二氧化硅管后面放置一小张纸来测试辐照窗口，然后打开激光。测量从辐照中烧毁的区域。使用辐照窗口和流速计算所需的激光频率，以获得零的排除分数。 注：IC-FPOP实验推荐的激光能量为±120 mJ。要获得辐射窗口为 2.58 mm 且流量为 1083.3 μL/min 的排除分数 0，频率需要为 44。下面是在已知辐照窗口、流速和排除分数时计算激光频率所需的方程。 <img src="/files/ftp_upload/60911/60911eq1.jpg"> 其中w是 nL 的体积，x 是激光光点宽度（以毫米为单位），y 是以 μm 为单位的二氧化硅管 ID，v 是总体积（以 μL 为单位），b 是排除分数，a 是流速（以 μL/min 为单位），f 是频率（以 Hz 为单位）。</li>
</ol>2. 使淬火和 H2O2
<ol><li>制造含有100 mM N-tert-丁基-α-苯丙烯硝基硝基烯（PBN）和100 mM N、N'-二甲基硫尿酸（DMTU）的淬火。每个样品的淬火量为11 mL，分为50 mL锥形管。</li>
	<li>稀释 H2O2至 200 mM。每个样品需要500μL的H2O2。 注：淬火器可在前一天进行，并储存在4°C过夜，防止光线照射。H2O2应该在实验日重新出现。</li>
</ol>3. 收集细胞
<ol><li>在T175烧瓶中生长细胞，达到约70-90%的汇合度。</li>
	<li>取出介质，用缓冲液冲洗。 注：使用的典型缓冲液是细胞培养等级Dulbecco的磷缓冲盐水（DPBS）或汉克的平衡盐溶液（HBSS）。</li>
	<li>使用胰蛋白酶-EDTA或使用刮刀分离细胞。</li>
	<li>分离后重新悬浮在 10 mL 的缓冲区中，并计算单元格。</li>
	<li>向下旋转，取出缓冲液和胰蛋白酶-EDTA，然后重新挂起以产生 2 x 106个单元/mL。</li>
	<li>每个样品的细胞的脂肪500 μL。 注：对于每种情况，至少制作3个激光样品，3个没有激光控制。</li>
</ol>4. 执行 IC-FPOP
<ol><li>将两个 5 mL 注射器与缓冲液填充，500 μL 注射器包含磁铁与细胞，最后 500 μL 注射器与 H2O2。打开磁性搅拌器。</li>
	<li>将220μL二甲基硫氧化物（DMSO）刺到一个等位淬火，轻轻混合，放在流系统后面，以收集辐照样品。DMSO的加入将抑制内源性二氧化二氮还原酶。</li>
	<li>打开激光，等待 7 s，然后打开流系统。</li>
	<li>样品完成流动后，关闭激光，轻轻将淬火与采集的样品混合。在步骤 4.5 和 4.6 中，将此放在侧面。</li>
	<li>用悬浮到细胞的缓冲液填充所有四个注射器，然后通过流动系统流动。</li>
	<li>系统完成冲洗后，重复步骤 4.1 和 4.2。无需照射即可启动流量。这是没有激光控制，以解释细胞中的背景氧化。</li>
	<li>当下一个样品运行时，以 450-800 x g向下旋转前一个样品 5 分钟，取出溶剂，然后重新悬浮在细胞裂液缓冲液（如放射免疫沉淀测定 （RIPA） 缓冲液）的 100 μL 中。</li>
	<li>将样品转移到微离心管，并在液氮中闪冻结。</li>
	<li>当所有样品都运行完后，拆解流系统进行清洁。丢弃用过的二氧化硅管，在50%水中通过1小时声波清洁所有其他连接：50%甲醇。根据制造商的说明清洁注射器。</li>
</ol>5. 文摘
<ol><li>消化整个细胞水乳。首先在95°C下解冻样品，加热10分钟。</li>
	<li>加热后，将冰上的碎水器冷却 15 分钟。</li>
	<li>加入25个单位的核酸酶来消化DNA和RNA，并在温带室孵育15分钟。</li>
	<li>在4°C下，使用16，000 x g的台式离心机旋转样品10分钟。</li>
	<li>收集上清液并将其转移到干净的微离心管。</li>
	<li>使用蛋白质测定试剂盒检查蛋白质浓度。</li>
	<li>将20-100μg样品转移到清洁的微离心管中，并带到100μL。</li>
	<li>在50°C下用20mM二硫硫醇（DTT）减少样品45分钟。</li>
	<li>在室温下冷却样品 15 分钟。</li>
	<li>在室温下，阿尔基酸盐与20mM碘酰胺（IAA）一起，20分钟，防止光线照射。</li>
	<li>以1：4比蛋白质添加预冷却丙酮：丙酮。混合样品，并放置在-20°C过夜。</li>
	<li>第二天早上，在4°C下以16，000 x g旋转样品10分钟。</li>
	<li>取出上清液，加入50 μL的90%预冷丙酮。混合样品，在4°C下以16，000 x g旋转5分钟。</li>
	<li>取出丙酮，让样品干燥，将微离心机的盖子打开，顶部可用无绒擦拭。样品干燥后，用10mM Tris缓冲pH8重新悬浮蛋白颗粒。</li>
	<li>在 40 μL 的 10 mM Tris 缓冲 pH 8 中重新悬浮 20 μg 的胰蛋白酶。加入2μg胰蛋白酶（质量：质量比为1胰蛋白酶：50个样品）。在37°C下孵化样品过夜。</li>
	<li>第二天早上，使用肽测定检查肽浓度。在去除肽测定的样品后，通过在样品中加入formic酸来淬火（最终浓度为5%的福酸）来淬火酶消化。</li>
	<li>确定最终肽浓度后，将每个样品的10μg转移到清洁的微离心管中。这可确保分析每个样本的相同数量。使用真空离心机干燥样品。一旦干燥重新悬浮与20μL的质谱等级0.1%的体酸。将样品传输到自动采样小瓶。</li>
</ol>6. 液相色谱-坦平质谱仪
<ol><li>要本地化 FPOP 修改，请使用 LC-MS/MS 分析分析消化的细胞裂化酶。</li>
	<li>在水中（A）中使用0.1%的甲酸移动相，在醋酸 （B） 中使用 0.1% 的甲酸。</li>
	<li>将 0.5 μg 样品装载到 180 μm x 20 mm C18（5 μm 和 100°）陷印柱上，用 99% （A） 和 1% （B） 清洗样品 15 分钟。</li>
	<li>使用 75 μm x 30 厘米 C18（5 μm 和 125 °） 分析柱，运行流速为 0.300 μL/min 的分析分离方法，从 3% （B） 开始一分钟，然后从 1-2 分钟升到 10%（B）。下一个斜坡从2-100分钟到45%（B），然后从100-110分钟到100%（B）。从110-115分钟按住100%（B）来清洁柱子。</li>
	<li>将 MS 采集方法设置为分辨率为 60，000，m/z 扫描范围为 375-1500。将自动增益控制 （AGC） 目标设置为 5.0 x 105，最大喷射时间为 50 ms。</li>
	<li>在 MS 采集期间，选择电荷状态为 2-6 的前体离子，通过数据依赖采集 （DDA） 进行隔离，隔离窗口为 1.2 m/z，周期时间为 4 s。 选择强度阈值为 5.0 x 104的肽进行 HCD 激活，将标准化能量设置为 32%。在采集 1 MS/MS 后，将肽排除在 60 s. 将 MS/MS 分辨率设置为 15，000，AGC 目标为 5.0 x 104，最大喷射时间为 35 ms。</li>
</ol>7. 数据处理
<ol><li>根据相关蛋白质数据库和相关消化酶，搜索可用蛋白质分析软件上的 RAW 文件。在这里，使用瑞士-Prot Homo Sapiens 数据库和胰蛋白酶。</li>
	<li>将前体质量设置为在 350 到 5，000 Da 之间搜索，质量公差为 10 ppm。最多只能有 1 个缺失的裂解部位，肽长度在 6 到 144 残留物之间。这些限制有助于数据库搜索。</li>
	<li>将碎片离子的最大质量公差设置为 0.02 Da，将卡酰胺甲基 （+57.021） 作为静态修饰，并将 17 种氨基酸的所有 FPOP 修饰作为动态修饰（图 4是用于检测 FPOP 修改的蛋白质分析工作流的一个示例）。 注：由于对羟基基反应性较低，因此搜索中不包括对丝氨酸和硫氨酸的FPOP修饰。</li>
	<li>使用虚假发现率为 1% 和 5% 的诱饵数据库进行搜索</li>
	<li>一旦文件完成搜索计算FPOP修改的范围。开放式蛋白质ome发现器2.2，出口序列，修饰位置，蛋白质加入，频谱文件，前体丰度和保留时间信息。从公式 4 计算修改范围： <img src="/files/ftp_upload/60911/60911eq2.jpg"> EIC 区域修改是具有羟基基修饰的特定肽的色谱区域。EIC 区域是该特定肽的改性和非修饰区域的总色谱面积。氧化程度在具有辐射和无辐照的样品中计算。样品省略辐照（控制）占任何背景氧化，可能存在于H2O2暴露前后的细胞中。从辐照样品中减去控件，以帮助隔离 FPOP 的特定修改。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+protein+footprinting+characterizes+the+structures+of+oligomeric+apolipoprotein+E2,+E3,+and+E4.">Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4.</a> Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+structural+resolution+hydroxyl+radical+protein+footprinting+reveals+an+extended+Robo1-heparin+binding+interface.">High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).</li><li>Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+comparing+structures+of+protein&#8722;+ligand+complexes:+the+calmodulin&#8722;+peptide+model+system.">Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein&#8722; ligand complexes: the calmodulin&#8722; peptide model system.</a> Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pH-induced+protein+structural+changes+under+equilibrium+conditions+by+pulsed+oxidative+labeling+and+mass+spectrometry.">Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cell+footprinting+coupled+with+mass+spectrometry+for+the+structural+analysis+of+proteins+in+live+cells.">In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Reorganization+of+Proteins+Revealed+by+Radiolysis+and+Mass+Spectrometry:+G-Actin+Solution+Structure+Is+Divalent+Cation+Dependent.">Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent.</a> Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).</li><li>Xu, G., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical-mediated+modification+of+proteins+as+probes+for+structural+proteomics.">Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics.</a> Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Kaur, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-Wide+Structural+Biology:+An+Emerging+Field+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+on+the+Proteomic+Scale.">Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+in+vivo+structural+dynamics+in+integral+membrane+protein+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).</li><li>Rinas, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+to+multidimensional+protein+identification+technology+(MudPIT):+expanding+footprinting+strategies+to+complex+systems.">Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).</li><li>Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+quantitation+strategy+for+hydroxyl+radical-mediated+protein+footprinting+using+Proteome+Discoverer.">An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).</li></ol>

Lisa Jones 是细胞专利流组件的发明者（出版号：20180079998）。

已经开发出几种基于质谱的技术，以全细胞或细胞水解物的蛋白质结构和蛋白质-配体复合物的方式研究蛋白质结构和蛋白质-配体复合物。这些技术包括但不限于氧化率 （SPROX）、热蛋白分析 （TPP）、化学交联 （XL-MS） 和羟基基基蛋白足迹 （HRPF） 中蛋白质的稳定性。每种技术都具有独特的局限性和优势，经过广泛审查。这些方法中的每一种都用于蛋白质广泛的结构生物学，以阐明蛋白质结构，并最终在复杂的细胞环境中发挥作用。IC-FPOP是一种HRPF技术，它利用羟基基来氧化修饰溶剂暴露的氨基酸侧链，探测蛋白质结构和在活细胞13中的蛋白质-配体相互作用。IC-FPOP是一种对活细胞中初始HRPF的改进，利用芬顿化学在分钟时间尺度14上产生基。在这项研究中，一个整体膜蛋白的结构变化，以响应降低缓冲液的pH或离子强度，成功地的特点是在整个蛋白质具有良好的氧化覆盖率。与芬顿化学相比，IC-FPOP速度更快，在微秒时间尺度上修饰蛋白质，从而能够研究原生蛋白质的构象。
IC-FPOP的一个关键测试是确认细胞在接触H2O2后的可行性。2使用40厘米的混合线，细胞在辐照前以H2O2孵育约3s。这一次可以通过改变这个硅管的长度来调整。值得注意的是，虽然使用锥蓝色测试细胞的生存能力表明细胞的完整性在H2O2孵育后持续，但细胞可能处于压力效应信号通路之下，与H2O2相互作用。幸运的是，短的孵育时间比蛋白质合成更快，从而提供不由H2O2诱导的蛋白质的信心2。
下一个重要步骤是确认流系统的正确装配。组装后，确保使用所需缓冲器冲洗系统后不存在泄漏。如果存在泄漏，请确保硅管已正确切割，并冲平在铁管上，一旦拧紧，可进行适当的密封。所有部件均手动拧紧，因此无需任何工具。在每次 IC-FPOP 实验中，确保细胞注射器中的磁性搅拌器保持运动状态。这种小搅拌限制了在注射器底部沉降的细胞数量，但不足以剪切细胞。一次运行后，注射器中还剩下大约 50 μL 的细胞。始终确保用裂隙步骤稀释掉，以限制延续到下一个实验的细胞数。如果比较了多个细胞处理，建议使用新鲜的细胞注射器。为被测试的单元选择适当的缓冲区也很重要。一些缓冲液淬火羟基基，导致蛋白质的修饰减少。徐等人已经表明，一些常用的缓冲液减少了羟基基的使用寿命11。DPBS 和 HBSS 是用于 IC-FPOP 实验的常见缓冲器。
在 IC-FPOP 之后，根据所需的参数优化消化协议。由于 FPOP 会产生不可逆的共价修改，因此有充足的时间进行彻底的消化和清理，而不会丢失标签覆盖率。始终测试和标准化蛋白质浓度，以便为串联质谱测试加载均匀的肽浓度。最后，请注意，免疫沉淀不能与IC-FPOP同时进行。如果 FPOP 修改目标为相互作用区域，抗体的亲和力将降低。为了帮助增加FPOP修饰的识别，2D-色谱分离步骤显示，被检测到的氧化肽数量是15的三倍多。
任何 FPOP 实验的一个挑战都是复杂的数据分析级别，因为可能产生的氧化产物。这在细胞内或体外都是如此，但随着分析细胞水结物的复杂性增加，情况会大大增加。随着IC-FPOP的进一步优化，越来越多的改性覆盖率较高的蛋白质产生，从而迅速使分析更加困难。从单个 IC-FPOP 实验中生成的剪切量限制了手动验证的使用，导致研究人员更加依赖软件。因此，Rinas等人使用Proteome发现器（PD）16为HRPF制定了量化策略。此方法利用 PD 上的多搜索节点工作流与电子表格中的定量平台结合使用。IC-FPOP 平台的进一步改进正在进行中，以增加经 FPOP 修改的已识别肽的数量，同时提高可重复性和定量精度。

羟基基蛋白足迹（HRPF）是一种通过羟基基产生的共价修饰来探测蛋白质溶剂可及性的方法。当蛋白质结构或蛋白质相互作用发生变化时，它将改变氨基酸的溶剂暴露，从而改变残留物的修饰程度。通过HRPF，蛋白质相互作用1,1、2、3,3和蛋白质构象变化4、5、66在体外被成功接受。4,5有几种方法可以生成HRPF实验的羟基基，其中一种是蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）。FPOP由Hambly和Gross于2005年开发，利用248纳米兴奋激光器通过过氧化氢的光解（H2O2）7产生羟基基。7
最近，埃斯皮诺等人扩展了使用FPOP来探测活细胞中的蛋白质结构，这种方法称为细胞内FPOP（IC-FPOP）8。8与体外研究不同，研究细胞中的蛋白质有助于分子拥挤以及各种可能影响结构的蛋白质相互作用。此外，它提供了提供完整蛋白体快照的优势，可能同时提供众多系统的结构信息，以执行蛋白体宽结构生物学。此外，该技术非常适合在体外难以研究的蛋白质，如膜蛋白。
IC-FPOP的初步研究成功地探索了105种蛋白质，其蛋白质丰度和细胞定位。为了改进IC-FPOP方法，Rinas等人开发了一种用于单细胞流9的微流系统。原始流系统的增强限制了细胞聚合，并增加了可用于辐照的可用 H2O2。在最初的流系统中，二氧化硅管中的细胞结块导致堵塞和不均匀的辐照。两个护套缓冲液的两个流的合并可以动态地聚焦细胞，使它们能够单独流过激光。为 H2O2单独注射注射器的加入，可实现更可控和可优化的暴露时间，从而获得更高的 H2O2浓度，而不会造成不利影响。此外，限制孵育时间限制H2O2通过内源2催化分解。通过加入这种新的流动系统，检测到的FPOP修饰的蛋白质数量增加了13倍，从而扩大了该方法探测活细胞中大量蛋白质的能力。该协议描述了一个一般的IC-FPOP实验，重点是IC-FPOP流系统的组装。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock</td>
			<td>SGE Analytical Science</td>
			<td>008760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 &#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>04A-4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Tubing 1/16&#34; OD x 0.020&#34; ID</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1548L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 210 syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788212</td>
			<td>Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-618L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoTight Sleeve Green 1/16&#34; ID x .0155&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-242X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoTight Sleeve Yellow 1/16&#34; OD x 0.027&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#34;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 &#181;m, Outer Diameter 360 &#181;m, TSP150350</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 &#181;m, Outer Diameter 670 &#181;m, TSP450670</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 &#181;m, Outer Diameter 360 &#181;m, TSP075375</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P382-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Magnetic Tumble Stirrer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 710D3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 710D3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel&#8482; (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-259X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; &#38; 1/32&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-255X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-700-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-700-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>LA4052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#38;P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VHP MicroTight Union for 360&#181;m OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>UH-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins

蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）是一种氢氧化基基蛋白足迹方法，用于表征蛋白质结构和相互作用。FPOP使用248纳米兴奋激光光解过氧化氢，产生羟基基。这些基液氧化地改变20种氨基酸中19种溶剂暴露侧链。最近，这种方法被用于活细胞（IC-FPOP）中研究其原生环境中的蛋白质相互作用。细胞中蛋白质的研究导致分子间拥挤和各种蛋白质相互作用，这些相互作用被打乱了体外研究。设计了一个自定义单细胞流动系统，以减少IC-FPOP期间的细胞聚合和堵塞。此流系统将细胞分别聚焦在兴奋激光器上，从而确保一致的照射。通过比较FPOP产生的氧化程度与从晶体结构计算出的蛋白质溶剂可访问性，IC-FPOP可以准确地探测蛋白质的溶剂可访问侧链。

IC-FPOP是一种用于查询活细胞中蛋白质相互作用的足迹方法。在IC-FPOP流系统中，H2O2暴露时间限制在约3s，保证更高的H2O2浓度，而不会对细胞造成有害影响。流系统还包含两个护套缓冲器流，流体动态地将细胞聚焦到管的中心，产生单一流动细胞，均匀辐照（图5）9。正交YZ堆叠图像的荧光成像（图5A）显示护套缓冲液（含有FITC荧光）与细胞溶液（包含TMRM荧光波）的明显分离。为了强调这种分离，图 5B和图 5C显示了护套缓冲液或单元溶液的三维平均热图，说明两种解决方案的最小混合。
使用单细胞流动系统使氧化修饰的蛋白质数量增加13倍（图6A）9。A在这种方法中，许多细胞舱中的蛋白质都标有膜蛋白、细胞质蛋白和细胞核内的蛋白质，是最常见的88、9。9为了确保蛋白质在完整细胞内被修改，在H2O2治疗和辐照（图6B）8之后，对CellROX8处理的细胞进行荧光图像。细胞在整个标签过程中的稳定性进一步证实了IC-FPOP在原生细胞环境中探测蛋白质的功效。通过使用串联质谱法，这些修饰可以本地化到蛋白质上的特定氨基酸。图 7表示在 IC-FPOP 期间进行的修改及其提取的电位色谱图。在提取的离子色谱图中观察到的偏移转化为改性肽中氧化的蛋氨酸引起的水磷化变化。
为了测试FPOP修饰是否探测细胞内的溶剂可访问性，将细胞内标记的行为素与体外足迹研究以及各种活性素晶体结构进行了比较（图8）。8图8A中显示了Guan等人10号体外研究产生的类似氧化程度（图8B），结论活性素在细胞内和体外研究中具有类似的溶剂可及性。为了进一步确认IC-FPOP正在探测行为素的溶剂可及性，FPOP修改的程度与从两个行为素晶体结构计算的标记残留物的溶剂可访问性（图8C）进行了比较。这种相关性表明，IC-FPOP能很好地探测单体蛋白的溶剂可及性。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig1.jpg"> 图1：如何正确构造体。（A） 在拧紧之前，将铁丝、硅管和套筒放在一起。（B） 将所有部件拧紧在一起。（C） 最终产品将生产套筒上已拧紧的套筒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig2.jpg"> 图2：设置IC-FPOP流系统。（A） 位于激光旁边完全组装的 IC-FPOP 流系统的图像。（B） 增加 500 μL 注射器外径以成功地将所有注射器拧紧在一起所需的垫分器示例。（C） 显示磁力搅拌器所需空间的代表图片。（D） 塞子必须使注射器泵失速，而不会打碎注射器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig3.jpg"> 图3：为IC-FPOP开发的流系统原理图。蓝线表示具有 450 μm ID 和 670 μm OD 的二氧化硅管，红线具有 150 μm ID 和 360 μm OD，橙色线具有 75 μm ID 和 360 μm OD。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig4.jpg"> 图4：用于检测 FPOP 修改的蛋白质分析软件。在每个节点中搜索相应修改的典型工作流。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig5.jpg"> 图 5：单个单元流系统以水动态方式将细胞聚焦到单个流中。（A） 正交 YZ 堆栈，用于说明细胞机解毒剂（红色、TMRM 荧光磷）的 3D 聚焦，周围是护套缓冲液（绿色、FITC 荧光波）。护套缓冲液（B） 和细胞机解毒剂 （C） 的三维平均强度热图下强度为蓝色，最高为红色（B-C）。此图已被修改从 Rinas 等人9<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig6.jpg"> 图6：IC-FPOP流动系统的利用大大增加了摄入细胞中的FPOP改性蛋白质。（A） 与流动系统识别和没有流动系统识别的氧化蛋白的比较。流系统识别了1391种FPOP改性蛋白质，而只有105种蛋白质被识别，没有流动系统，有58种改性蛋白质的重叠。在IC-FPOP显示细胞在氧化标记后9仍然完好无损后，通过Rinas等人9（B）对CellROX处理细胞的荧光成像进行了修改。细胞在665nm处使用奥林巴斯氟维佛FV1000 MPE多光子显微镜进行成像。显示的图像是单个切片。此图已被修改从埃斯皮诺等人8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig7.jpg"> 图 7：IC-FPOP 期间发生的串联 MS/MS 光谱示例。未改性肽（A）未改性肽的产品-ion （MS/MS） 光谱，以及该肽上发现残留 M8 上的氧化（B） 。（C） 未改性肽和 （D） 改性肽的代表性 EIC.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig8.jpg"> 图8：IC-FPOP能有效探测蛋白质的溶剂可及性。（A） 9种氧化改性肽的改性程度。值显示为平均值加和减标准差 （n = 3）。（B） 通过关等人10（C）的同步加速器放射性分析在体外氧化活性素肽的修饰，在紧密C（三角形、虚线趋势线）和开（圆、实趋势线）活性素状态中残留FPOP修饰与SASA相关。此图已被修改从埃斯皮诺等人8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig8large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>

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Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

在这里，我们使用称为细胞内快速光化学氧化蛋白质（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术来描述活细胞中的蛋白质结构和相互作用位点。

用细胞内快速光化学氧化蛋白质对细胞内蛋白质进行特征化

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

细胞内FPOP与质谱法相结合是一种强大的新技术，用于研究活细胞中的蛋白质相互作用和蛋白质结构变化。使用细胞内FPOP，您不需要分离感兴趣的蛋白质，而是可以在它们的原生环境中研究它们。这对膜蛋白特别有帮助。通过这种方法，您可以研究各种疾病（包括癌症和遗传性疾病）中结构和蛋白质相互作用的变化，以便更好地了解和描述它们。要开始装配流系统，请使用裂石将熔融石英管切割到适当的尺寸。接下来，将六块小圆柱形磁铁放在一个 500 微升注射器中，然后填充注射器、第二个 500 微升注射器和两个带护套缓冲液的 5 毫升注射器。除气后，将注射器放在注射器泵上，并拧紧注射器泵塞，使当电机失速时，细胞注射器还剩下大约 50 微升。使用引诱适配器，将手动阀连接到每个注射器，并如图所示组装二氧化硅管，确保将电池加上过氧化氢硅管线穿过十字架，并将其直接插入 450 ID 二氧化硅管管。连接所有管材后，将流系统放在激光器旁边，并使用打火机烧掉 450 微米内径管上的二氧化硅涂层，以制作激光照射窗口。将磁力搅拌器放在包含六块磁铁的细胞注射器上方，将注射器泵设置为每分钟 492.4 微升，最终流量为每分钟 1083.3 微升。流缓冲器通过系统三次冲洗系统，检查每个连接是否有任何泄漏。使用凸透镜将兴奋激光聚焦到二氧化硅管上。要测试辐照窗口，请将一小张纸放在硅胶管后面，然后打开激光。然后，测量从辐照中燃烧的区域，并使用辐照窗口和流速计算所需的激光频率，以获得零的排除分数。要收集手术的细胞，用适当的细胞培养等级盐溶液清洗细胞，从70%至90%的汇合T175烧瓶培养液中清洗。将细胞重新在10毫升缓冲液中，用于计数和通过离心收集细胞。对细胞进行计数以确保它们足以进行下游分析至关重要，但不会太多细胞来聚合和堵塞流系统。然后每毫升护套缓冲液浓度的2倍10至6个细胞重新填充细胞，将细胞分成每样本500微升体积。对于细胞内FPOP，用新鲜护套缓冲液填充两个五毫升注射器，用一个等分细胞填充含有磁铁的500微升注射器，用新鲜准备的200毫升过氧化氢填充最后500微升注射器。打开磁力搅拌器，将二甲基硫化物的220微升中的峰值打开，将二甲基硫化物的尖峰打开，将二甲基硫化物的尖峰变成一个昆奇的一个分量。轻轻混合后，将 Quench 放在流系统后面，收集辐照样品并打开激光。七秒钟后，打开流量系统。样品完成流动后，关闭激光，将 Quench 与采集的样品轻轻混合。接下来，用新鲜缓冲液填充所有四个注射器，并通过流系统冲洗缓冲液。系统完成冲洗后，使用新的等同细胞和溶液重复该过程，无需照射，作为无激光控制，以考虑细胞内的背景氧化。当下一个样品运行时，将第一个样品离心机，将颗粒重新在100微升的适当细胞解解缓冲液中。然后，将样品转移到微离心管中，在液氮中闪冻。当所有样品都运行完后，拆解流系统并丢弃用过的二氧化硅管。然后，在 50% 水 50% 甲醇溶液中通过声波清洁所有其他连接一小时。根据标准协议从细胞中分解和消化蛋白质后，根据标准串联LCMS协议分析消化的细胞酸盐，使全细胞的FPOP修饰蛋白本地化。然后，将数据加载到适当的蛋白质分析软件程序中，根据相关的蛋白质数据库和相关消化酶分析数据。一旦文件完成搜索，计算FPOP氧化对感兴趣的蛋白质的程度。正交YZ堆叠图像的荧光成像显示，当护套缓冲液流过激光照射窗口时，护套缓冲液与细胞溶液的分离清晰。可以生成护套缓冲液或细胞溶液的三维平均热图，以说明两种溶液的最小混合。使用单细胞流动系统可使氧化修饰蛋白的数量增加13倍。为了确认在完整细胞内感兴趣的蛋白质的修饰，荧光成像可以在过氧化氢处理和辐照后进行。使用串联质谱法，这些修饰可以进一步本地化到蛋白质上的特定氨基酸。在此提取的离子色谱中观察到的变化转化为改性肽中氧化的海氨酸引起的疏水性变化。通过体外足迹比较细胞内标记的行为素，可以发现类似的氧化水平，表明行为素在细胞内和体外研究中具有类似的溶剂可访问性。此外，比较了对兴趣蛋白快速光化学氧化程度对溶剂的可访问性进行修改，从两种作用素晶体结构中计算出的标签残留物表明，在细胞内快速光化学氧化的感兴趣的蛋白质有效地探寻了单体蛋白的溶剂可访问性。有几个额外的步骤，可以采取，以增加检测较低的丰富的FPOP修改，包括2D色谱，亚细胞分馏和蛋白质组复用技术。使用细胞内FPOP，我们现在可以进行蛋白质结构生物学，以更好地连接蛋白质结构与细胞功能。由于 FPOP 需要 248 纳米波长，请务必始终佩戴紫外线防护护目镜和合适的衣物，以避免意外暴露于反射或分散的辐射中。

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小分子结合蛋白的鉴定在天然细胞环境由活细胞光亲和标记

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