Name: characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2020-03-11T15:00:00
Duration: 9 min 3 s
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इस काम को एलएमजे के लिए एनएसएफ करियर अवार्ड (एमसीबी1701692) ने सपोर्ट किया।

<ol>
	<li>Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+protein+footprinting+characterizes+the+structures+of+oligomeric+apolipoprotein+E2,+E3,+and+E4.">Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4.</a> Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+structural+resolution+hydroxyl+radical+protein+footprinting+reveals+an+extended+Robo1-heparin+binding+interface.">High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).</li><li>Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+comparing+structures+of+protein&#8722;+ligand+complexes:+the+calmodulin&#8722;+peptide+model+system.">Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein&#8722; ligand complexes: the calmodulin&#8722; peptide model system.</a> Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pH-induced+protein+structural+changes+under+equilibrium+conditions+by+pulsed+oxidative+labeling+and+mass+spectrometry.">Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cell+footprinting+coupled+with+mass+spectrometry+for+the+structural+analysis+of+proteins+in+live+cells.">In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Reorganization+of+Proteins+Revealed+by+Radiolysis+and+Mass+Spectrometry:+G-Actin+Solution+Structure+Is+Divalent+Cation+Dependent.">Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent.</a> Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).</li><li>Xu, G., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical-mediated+modification+of+proteins+as+probes+for+structural+proteomics.">Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics.</a> Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Kaur, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-Wide+Structural+Biology:+An+Emerging+Field+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+on+the+Proteomic+Scale.">Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+in+vivo+structural+dynamics+in+integral+membrane+protein+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).</li><li>Rinas, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+to+multidimensional+protein+identification+technology+(MudPIT):+expanding+footprinting+strategies+to+complex+systems.">Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).</li><li>Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+quantitation+strategy+for+hydroxyl+radical-mediated+protein+footprinting+using+Proteome+Discoverer.">An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).</li></ol>

लिसा जोंस कोशिकाओं पेटेंट के लिए प्रवाह विधानसभा पर एक आविष्कारक है (प्रकाशन संख्या: २०१८००७९९९८) ।

प्रोटीन संरचना और प्रोटीन-लिगामेंट परिसरों को पूरी कोशिकाओं या कोशिका ओं में एक प्रोटेम-वाइड तरीके से अध्ययन करने के लिए कई बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तकनीकविकसित की गई है। इन तकनीकों में ऑक्सीकरण (एसपीरॉक्स), थर्मल प्रोटेम प्रोफाइलिंग (टीपीपी), केमिकल क्रॉस-लिंकिंग (एक्सएल-एमएस), और हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) की दर से प्रोटीन की स्थिरता तक सीमित नहीं हैं। प्रत्येक तकनीक में एक-दूसरे की तुलना में अद्वितीय सीमाएं और फायदे होते हैं, जिनकी बड़े पैमाने पर12की समीक्षा की गई है। इनमें से प्रत्येक विधियों का उपयोग प्रोटीन संरचना को स्पष्ट करने और अंततः जटिल सेलुलर वातावरण के भीतर कार्य करने के लिए प्रोटेम वाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए किया गया है। आईसी-एफपीओ एक एचआरपीएफ तकनीक है जो अमीनो एसिड की सॉल्वेंट उजागर साइड चेन को संशोधित करने के लिए हाइड्रोक्सिल कणों का उपयोग करती है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं13के भीतर प्रोटीन संरचना और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन की जांच करती है। आईसी-एफपीओ लाइव कोशिकाओं में प्रारंभिक एचआरपीएफ में सुधार है जिसने मिनट टाइमस्केल14पर कण उत्पन्न करने के लिए फेन्टन रसायन विज्ञान का उपयोग किया। इस अध्ययन में, बफर की पीएच या आयनिक ताकत को कम करने के जवाब में एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तन सफलतापूर्वक प्रोटीन भर में अच्छे ऑक्सीकरण कवरेज के साथ विशेषता थी। फेंटन रसायन विज्ञान की तुलना में, आईसी-एफपीओ बहुत तेज है, माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर प्रोटीन को संशोधित करता है, इस प्रकार देशी प्रोटीन संरचना का अध्ययन करने में सक्षम होता है।
आईसी-एफपीओ के लिए एक महत्वपूर्ण परीक्षण एच2ओ2के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि करना है। 40 सेमी मिक्सिंग लाइन का उपयोग करके, कोशिकाओं को विकिरण से पहले लगभग 3 एस के लिए एच2ओ2 में इनक्यूबेटेड किया जाता है। इस बार इस सिलिका ट्यूबिंग की लंबाई बदलकर एडजस्ट किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय है कि यद्यपि कोशिका व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग एच2ओ2 ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं की अखंडता को निरंतर बनाता है, कोशिकाओं को एच2ओ2के साथ बातचीत करने वाले सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करने वाले तनाव में होने की संभावना हो सकती है। सौभाग्य से, प्रोटीन संश्लेषण की तुलना में कम ऊष्मायन समय तेज होता है जो मौजूद प्रोटीन एच2ओ2द्वारा प्रेरित नहीं होता है।
अगला महत्वपूर्ण कदम प्रवाह प्रणाली की उचित असेंबली की पुष्टि करना है । एक बार इकट्ठे होने के बाद, सुनिश्चित करें कि वांछित बफर के साथ सिस्टम को फ्लश करने के बाद कोई लीक मौजूद नहीं है। यदि लीक मौजूद हैं, तो सुनिश्चित करें कि सिलिका ट्यूबिंग को ठीक से काटा गया था और एक बार कड़ा करने के बाद उचित मुहर लगाने के लिए फेरूल के खिलाफ फ्लश किया जाता है। सभी भागहाथ-कड़ा हैं, इसलिए कोई उपकरण आवश्यक नहीं है। प्रत्येक आईसी-एफपीओ प्रयोग के दौरान, सुनिश्चित करें कि सेल सिरिंज में चुंबकीय उभारक गति में बने रहें। यह छोटा आंदोलन उन कोशिकाओं की संख्या को सीमित करता है जो सिरिंज के नीचे बसते हैं लेकिन कोशिकाओं को कतरनी करने के लिए पर्याप्त कठोर नहीं है। एक रन के बाद, सिरिंज में लगभग 50 माइक्रोन कोशिकाएं बची हैं। अगले प्रयोग तक ले जाने वाली कोशिकाओं की संख्या को सीमित करने के लिए हमेशा इसे एक रिंसिंग स्टेप के साथ पतला करना सुनिश्चित करें। यदि कई सेल उपचारों की तुलना की जा रही है तो नए सिरे से सेल सिरिंज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। परीक्षण की जा रही कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त बफर का चयन करना भी महत्वपूर्ण है। कुछ बफ़र्स हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल को बुझाते हैं जिससे प्रोटीन पर कम संशोधन होते हैं। Xu एट अल से पता चला है कि कुछ आमतौर पर इस्तेमाल बफ़र्स हाइड्रोक्साइल कट्टरपंथी जीवनकाल11कम । डीपीबीएस और एचबीएसएस आईसी-एफपीओ प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले आम बफ़र्स हैं।
आईसी-एफपीओ के बाद, आवश्यक मापदंडों के आधार पर पाचन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करें। चूंकि एफपीओ अपरिवर्तनीय सहसंयोजक संशोधनों का उत्पादन करता है, इसलिए लेबलिंग कवरेज खोने के बिना पूरी तरह से पाचन और सफाई के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध है। हमेशा प्रोटीन एकाग्रता का परीक्षण और सामान्य करें ताकि समान पेप्टाइड सांद्रता को मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लोड किया जा सके। अंत में, ध्यान रखें कि आईसी-एफपीओ के साथ मिलकर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन नहीं किया जा सकता है। यदि कोई एफपीओ संशोधन बातचीत के क्षेत्र को लक्षित करता है तो एंटीबॉडी की आत्मीयता कम हो जाएगी। FPOP संशोधनों की पहचान बढ़ाने में मदद करने के लिए, 2डी-क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण कदमों ने15का पता लगाया ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स की संख्या को तीन गुना से अधिक दिखाया है ।
किसी भी FPOP प्रयोग की एक चुनौती संभावित ऑक्सीकरण उत्पादों के कारण डेटा विश्लेषण का जटिल स्तर है जो उत्पन्न हो सकता है। यह इन-सेल या इन विट्रो दोनों के लिए सच है लेकिन सेल लाइसेट्स का विश्लेषण करने की अतिरिक्त जटिलता के साथ काफी बढ़ जाता है। आईसी-एफपीओ के आगे अनुकूलन के साथ उच्च संशोधन कवरेज के साथ अधिक प्रोटीन उत्पन्न हो रहे हैं, इस प्रकार तेजी से विश्लेषण को और अधिक दुरूह बना रहे हैं। एक ही आईसी-एफपीओ प्रयोग से उत्पन्न डेटा की कतरनी मात्रा मैनुअल सत्यापन के उपयोग को सीमित करती है जिससे शोधकर्ताओं को सॉफ्टवेयर पर अधिक भरोसा करना पड़ता है। इसके कारण, रिनास एट अल ने प्रोटेम डिस्कवर (पीडी)16का उपयोग करके एचआरपीएफ के लिए एक क्वांटिटेशन रणनीति विकसित की। यह विधि एक स्प्रेडशीट में मात्रात्मक मंच के साथ संयुक्त पीडी पर एक बहु-खोज नोड कार्यप्रवाह का उपयोग करती है। आईसी-एफपीओ प्लेटफॉर्म पर आगे सुधार बढ़ ते हुए प्रजनन क्षमता और मात्रा सटीकता के साथ-साथ एफपीओ संशोधनों के साथ पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या बढ़ाने के लिए चल रहे हैं।

हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) एक ऐसी विधि है जो हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स से उत्पादित सहसंयोजक संशोधनों के माध्यम से प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करती है। जब प्रोटीन संरचना या प्रोटीन इंटरैक्शन बदलते हैं, तो यह अमीनो एसिड के विलायक एक्सपोजर को बदल देगा, इस प्रकार अवशेषों के संशोधन की सीमा में फेरबदल करेगा। एचआरपीएफ के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन1,2,,3 और प्रोटीन प्रसंरचना परिवर्तन,4,,5,,6 को सफलतापूर्वक विट्रो में पूछताछ की गई है । ऐसे कई तरीके हैं जो एचआरपीएफ प्रयोगों के लिए हाइड्रोक्सिल कण उत्पन्न करते हैं, एक प्रोटीन (एफपीओपी) का तेजी से फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण है। एफपीओ को 2005 में हैम्बली और ग्रॉस द्वारा विकसित किया गया था और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)7के फोटोलिसिस के माध्यम से हाइड्रोक्सिल कणों का उत्पादन करने के लिए 248 एनएम एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है।
हाल ही में, एस्पिनो एट अल ने लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए एफपीओ के उपयोग को बढ़ाया, एक विधि जिसे इन-सेल एफपीओ (आईसी-एफपीओ)8कहा जाता है। इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, विभिन्न प्रोटीन इंटरैक्शन के साथ आणविक भीड़ के लिए कोशिकाओं में प्रोटीन का अध्ययन करना जो संभावित रूप से संरचना को प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटेम वाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी करने के लिए एक बार में कई प्रणालियों की संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने वाले पूर्ण प्रोटेम का एक स्नैपशॉट प्रदान करने का लाभ प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, यह तकनीक प्रोटीन के लिए आदर्श है जो झिल्ली प्रोटीन की तरह विट्रो का अध्ययन करना मुश्किल है।
आईसी-एफपीओ के प्रारंभिक अध्ययनों ने प्रोटीन बहुतायत और सेलुलर स्थानीयकरण में शामिल 105 प्रोटीन की सफलतापूर्वक जांच की। आईसी-एफपीओ विधि में सुधार करने के लिए, रिनास एट अल ने एकल सेल प्रवाह9के लिए एक माइक्रोफ्लो सिस्टम विकसित किया। मूल प्रवाह प्रणाली की वृद्धि सेल एकत्रीकरण को सीमित करता है और विकिरण के लिए उपलब्ध उपलब्ध एच2ओ2 को बढ़ाता है। प्रारंभिक प्रवाह प्रणाली में, सिलिका ट्यूबिंग में झुरमुट कोशिकाओं के परिणामस्वरूप मोजे और असमान विकिरण हुआ। एक म्यान बफर हाइड्रोडायनामिक रूप से दो धाराओं का समावेश कोशिकाओं को केंद्रित करता है, जिससे उन्हें लेजर के पिछले व्यक्तिगत रूप से प्रवाहित करने की अनुमति मिलती है। एच2ओ2 के लिए एक अलग सिरिंज का समावेश प्रतिकूल प्रभावों के बिना उच्च एच2ओ2 सांद्रता की अनुमति देने वाले अधिक नियंत्रित और अनुकूलनीय एक्सपोजर समय को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, ऊष्मायन समय को सीमित करने से एंडोजेनस कैटालास द्वारा एच2ओ2 के टूटने की सीमा होती है। इस नए प्रवाह प्रणाली को शामिल करके, एक FPOP संशोधन के साथ प्रोटीन की पता लगाया संख्या 13 गुना वृद्धि हुई है, इस प्रकार इस विधि की क्षमताओं का विस्तार करने के लिए रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन की एक भीड़ की जांच । इस प्रोटोकॉल में आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की असेंबली पर ध्यान केंद्रित करते हुए एक सामान्य आईसी-एफपीओ प्रयोग का वर्णन किया गया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock</td>
			<td>SGE Analytical Science</td>
			<td>008760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 &#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>04A-4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Tubing 1/16&#34; OD x 0.020&#34; ID</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1548L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 210 syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788212</td>
			<td>Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-618L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoTight Sleeve Green 1/16&#34; ID x .0155&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-242X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoTight Sleeve Yellow 1/16&#34; OD x 0.027&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#34;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 &#181;m, Outer Diameter 360 &#181;m, TSP150350</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 &#181;m, Outer Diameter 670 &#181;m, TSP450670</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 &#181;m, Outer Diameter 360 &#181;m, TSP075375</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P382-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Magnetic Tumble Stirrer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 710D3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 710D3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel&#8482; (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-259X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; &#38; 1/32&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-255X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-700-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-700-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>LA4052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#38;P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VHP MicroTight Union for 360&#181;m OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>UH-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins

प्रोटीन (एफपीओपी) का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण प्रोटीन संरचना और बातचीत की विशेषता के लिए उपयोग की जाने वाली एक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन पदचिह्न विधि है। FPOP हाइड्रोक्साइल कणों का उत्पादन हाइड्रोजन पेरोक्साइड को फोटोयुक्त करने के लिए 248 एनएम एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है। ये कण 20 अमीनो एसिड में से 19 के विलायक उजागर साइड चेन को संशोधित करते हैं। हाल ही में, इस विधि का उपयोग लाइव कोशिकाओं (आईसी-एफपीओ) में उनके मूल वातावरण में प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। कोशिकाओं में प्रोटीन का अध्ययन अंतरआणविक भीड़ और विभिन्न प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए होता है जो इन विट्रो अध्ययनों के लिए बाधित होते हैं। आईसी-एफपीओ के दौरान सेल एग्रीग्रेशन और क्लोजिंग को कम करने के लिए एक कस्टम सिंगल सेल फ्लो सिस्टम डिजाइन किया गया था। यह प्रवाह प्रणाली व्यक्तिगत रूप से एक्सीमर लेजर पिछले कोशिकाओं को केंद्रित करती है, इस प्रकार लगातार विकिरण सुनिश्चित करती है। एक क्रिस्टल संरचना से गणना प्रोटीन की विलायक पहुंच के लिए FPOP से उत्पादित ऑक्सीकरण की सीमा की तुलना करके, आईसी-FPOP प्रोटीन की विलायक सुलभ साइड चेन की सटीक जांच कर सकता है।

आईसी-एफपीओ लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए एक पदचिह्न विधि है। आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली में, एच2ओ2 एक्सपोजर समय लगभग 3 एस तक सीमित है, कोशिकाओं के लिए हानिकारक परिणामों के बिना उच्च एच2ओ2 सांद्रता की आवश्यकता है। प्रवाह प्रणाली में म्यान बफर की दो धाराओं को भी शामिल किया गया है, जो कोशिकाओं को समान रूप से विकिरणित करने के9लिए कोशिकाओं के एक प्रवाह का उत्पादन करने वाले ट्यूबिंग के केंद्र में केंद्रित करता है। ऑर्थोगोनल वाईजेड की फ्लोरेसेंस इमेजिंग(चित्र5ए)सेल समाधान (एक TMRM फ्लोरोफोर युक्त) से म्यान बफर (एक फ़ेसीसी फ्लोरोफोर युक्त) का स्पष्ट अलगाव दिखाता है। इस अलगाव पर जोर देने के लिए, चित्रा 5बी और चित्रा 5सी या तो म्यान बफर समाधान या सेल समाधान के तीन आयामी औसत गर्मी नक्शे दिखाते हैं, जो दो समाधानों के न्यूनतम मिश्रण को दर्शाते हैं।
एकल कोशिका प्रवाह प्रणाली के उपयोग से ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित प्रोटीन की संख्या 13 गुना(चित्र 6ए)9तक बढ़ जाती है । इस विधि में, कई सेलुलर डिब्बों में प्रोटीन को झिल्ली प्रोटीन, साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और नाभिक के भीतर प्रोटीन सबसे प्रचलित8,,9के साथ लेबल किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटीन को बरकरार कोशिकाओं के भीतर संशोधित किया गया था, एच2ओ2 उपचार और विकिरण(चित्र 6बी)8के बाद सेलरॉक्स उपचारित कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां की गई थीं। लेबलिंग प्रक्रिया में कोशिकाओं की स्थिरता आगे आईसी-FPOP की प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए अपने मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन की जांच । टैंडेम-मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, इन संशोधनों को प्रोटीन पर विशिष्ट अमीनो एसिड के लिए स्थानीयकृत किया जा सकता है। चित्रा 7 एक संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है जो आईसी-एफपीओ के दौरान अपने निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम के साथ होता है। निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम में देखी गई पारी संशोधित पेप्टाइड में ऑक्सीडाइज्ड मेथिओनीन के कारण हाइड्रोफोबीसिटी में परिवर्तन का अनुवाद करती है।
यह परीक्षण करने के लिए कि क्या एफपीओ संशोधन कोशिकाओं के अंदर सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी की जांच करते हैं, इन-सेल लेबल वाले ऐक्टिन की तुलना इन विट्रो फुटप्रिंटिंग अध्ययन और ऐक्टिन(चित्रा 8)8की विभिन्न क्रिस्टल संरचनाओं दोनों से की गई थी। इन-सेल लेबल ऐक्टिन का प्रतिनिधित्व चित्रा 8में किया गया हैएक गुआन एट अल द्वारा इन विट्रो अध्ययन से ऑक्सीकरण की तुलनीय सीमा से पता चलता है10 (चित्रा 8बी),समापन ऐक्टिन में इन-सेल और इन विट्रो अध्ययन दोनों के लिए समान विलायक पहुंच है। आईसी-एफपीओ की पुष्टि करने के लिए ऐक्टिन की विलायक पहुंच की जांच कर रहा था, एफपीओ संशोधनों की सीमा की तुलना दो ऐक्टिन क्रिस्टल संरचनाओं(चित्रा 8सी)से गणना किए गए लेबल वाले अवशेषों की विलायक पहुंच से की गई थी । यह सहसंबंध दर्शाता है कि आईसी-एफपीओ मोनोमेरिक प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig1.jpg"> चित्रा 1: कैसे ठीक से ferules का निर्माण करने के लिए । (क)कसने से पहले फर्रूल्स, सिलिका ट्यूबिंग और आस्तीन को एक साथ रखें। (ख)सभी घटकों को एक साथ कस लें । (ग)अंतिम उत्पाद एक फेरूल का उत्पादन करेगा जिसे आस्तीन पर कड़ा कर दिया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig2.jpg"> चित्रा 2: आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की स्थापना। (ए)लेजर के बगल में स्थित पूरी तरह से इकट्ठे आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की छवि। (ख)एक स्पेसर का उदाहरण ५०० μL सिरिंज के बाहरी व्यास को बढ़ाने के लिए सफलतापूर्वक नीचे सभी सिरिंज एक साथ कस ने की जरूरत है । (ग)प्रतिनिधि चित्र चुंबकीय उभारकों के लिए आवश्यक स्थान दिखारहे हैं । (D)सिरिंज को तोड़ने के बिना सिरिंज पंप को स्टाल करने के लिए डाट आवश्यक हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig3.jpg"> चित्रा 3: आईसी-एफपीओपी के लिए विकसित प्रवाह प्रणाली की योजनाबद्ध। नीली रेखाएं 450 माइक्रोन आईडी और 670 माइक्रोन ओडी के साथ सिलिका ट्यूबिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं, लाल रेखाओं में 150 माइक्रोन आईडी और 360 माइक्रोन ओडी होती है, और नारंगी रेखाओं में 75 माइक्रोन आईडी और 360 माइक्रोन ओडी होती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig4.jpg"> चित्रा 4: प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर FPOP संशोधनों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । प्रत्येक नोड में खोजे गए संबंधित संशोधनों के साथ एक विशिष्ट कार्यप्रवाह। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig5.jpg"> चित्रा 5: एकल सेल प्रवाह प्रणाली हाइड्रोडायनामिक रूप से कोशिकाओं को एक ही धारा में केंद्रित करती है। (A)ऑर्थोगोनल वाईजेड स्टैक ने म्यान बफर (ग्रीन, फिथ फ्लोरोफोर) से घिरे सेलुलर एनालाइट (लाल, टीएमआरएम फ्लोरोफोर) के 3डी फोकसिंग को दर्शाते हुए । म्यान बफर(बी)और सेलुलर एनालाइट(सी)का त्रि-आयामी औसत तीव्रता गर्मी नक्शा। कम तीव्रता नीले और उच्चतम लाल(बी-सी)हैं । इस आंकड़े को रिनास एट अल से संशोधित किया गया है9<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig6.jpg"> चित्रा 6: आईसी-एफपीओ फ्लो सिस्टम का उपयोग सेवन कोशिकाओं में एफपीओ संशोधित प्रोटीन को काफी बढ़ाता है। (A)प्रवाह प्रणाली के साथ और बिना पहचाने गए ऑक्सीडाइज्ड प्रोटीन की तुलना। प्रवाह प्रणाली १३९१ FPOP संशोधित प्रोटीन की पहचान की, जबकि केवल १०५ प्रोटीन ५८ संशोधित प्रोटीन के ओवरलैप के साथ कोई प्रवाह प्रणाली के साथ की पहचान की गई । इस आंकड़े को रिनास एट अल से संशोधित किया गया है9 (बी)सेल्रॉक्स की फ्लोरेसेंस इमेजिंग आईसी-एफपीओपी शो के बाद कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव लेबलिंग के बाद अभी भी बरकरार हैं । कोशिकाओं को 665 एनएम पर ओलंपस फ्लूओव्यू FV1000 एमपीई मल्टीफोर्न माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। दिखाया गया छवि एक टुकड़ा है। इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल से संशोधित किया गया है।8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig6large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig7.jpg"> चित्रा 7: आईसी-एफपीओ के दौरान होने वाले टैंडेम एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा के उदाहरण । उत्पाद आयन (एमएस/एमएस) एक(ए)असंशोधित पेप्टाइड का स्पेक्ट्रा, और उस पेप्टाइड पर पाए जाने वाले अवशेषों एम8 पर पाया गया एक(बी)ऑक्सीकरण। एक प्रतिनिधि ईआईसी(सी)असंशोधित पेप्टाइड और(डी)संशोधित पेप्टाइड। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig7large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig8.jpg"> चित्रा 8: आईसी-एफपीओ प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करने में प्रभावी है। (A)ऐक्टिन से 9 ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स के लिए संशोधन की सीमा। मान औसत प्लस और माइनस मानक विचलन (एन = 3) के रूप में दिखाए जाते हैं। (ख)गुआन एट अल से सिंक्रोट्रॉन रेडियोलिसिस द्वारा विट्रो में ऑक्सीकृत ऐक्टिन पेप्टाइड्स का संशोधन10 (सी)एसएएसए के साथ अवशेष एफपीओ संशोधनों का सहसंबंध (त्रिकोण, धराशायी प्रवृत्ति रेखा) और ओपन (सर्कल, सॉलिड ट्रेंड लाइन) ऐक्टिन के राज्यों में एसएएसए के साथ अवशेष ों के संशोधन । इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल से संशोधित किया गया है।8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig8large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

यहां, हम प्रोटीन (आईसी-एफपीओपी) के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन संरचना और इंटरैक्शन साइटों की विशेषता रखते हैं।

प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण के साथ सेलुलर प्रोटीन की विशेषता

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

इन-सेल एफओपी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर एक शक्तिशाली नई तकनीक है जो प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। इन-सेल एफओपी के साथ, आपको प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट को अलग करने की आवश्यकता नहीं है, बल्कि वे अपने मूल वातावरण में अध्ययन कर सकते हैं। यह झिल्ली प्रोटीन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।इस विधि के साथ, आप कैंसर और आनुवंशिक विकारों सहित विभिन्न बीमारियों में संरचना और प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन में परिवर्तन का अध्ययन कर सकते हैं, ताकि आप उन्हें बेहतर ढंग से समझ और चित्रित कर सकें। प्रवाह प्रणाली की असेंबली शुरू करने के लिए, उचित आकार में फ्यूज्ड सिलिका ट्यूबिंग को काटने के लिए एक दरार पत्थर का उपयोग करें। इसके बाद, एक 500 माइक्रोलीटर सिरिंज में छह छोटे बेलनाकार मैग्नेट रखें और सिरिंज, एक दूसरे 500 माइक्रोलीटर सिरिंज, और म्यान बफर के साथ दो पांच मिलीलीटर सिरिंज भरें।हवा निकालने के बाद सिरिंज को सिरिंज पंप पर रखें और सिरिंज पंप डाट को कस लें ताकि मोटर के स्टॉल लगने पर सेल सिरिंज में लगभग 50 माइक्रोलीटर बचे हों। एक लालच एडाप्टर का उपयोग करके, प्रत्येक सिरिंज में एक मैनुअल वाल्व कनेक्ट करें और सचित्र के रूप में सिलिका ट्यूबिंग को इकट्ठा करें, जिससे सेल प्लस हाइड्रोजन पेरोक्साइड सिलिका लाइन को क्रॉस के माध्यम से धागा करना सुनिश्चित किया जाए और इसे सीधे 450 आईडी सिलिका लाइन में डालें। जब ट्यूबिंग के सभी जुड़ा हुआ है, एक लेजर के बगल में प्रवाह प्रणाली की स्थिति और एक लाइटर का उपयोग करने के लिए दूर ४५० माइक्रोमीटर भीतरी व्यास ट्यूबिंग पर सिलिका कोटिंग को जलाने के लिए लेजर विकिरण के लिए एक खिड़की बनाते हैं ।छह मैग्नेट युक्त कोशिका सिरिंज के ऊपर एक चुंबकीय उभारक रखें और प्रति मिनट 1083.3 माइक्रोलीटर प्रति मिनट की अंतिम प्रवाह दर के लिए सिरिंज पंप को 492.4 माइक्रोलीटर प्रति मिनट सेट करें। सिस्टम को फ्लश करने के लिए तीन बार सिस्टम के माध्यम से बफर प्रवाह करें, किसी भी लीक के लिए प्रत्येक कनेक्शन की जांच करें। सिलिका ट्यूबिंग पर एक्समर लेजर फोकस करने के लिए उत्तल लेंस का उपयोग करें।विकिरण खिड़की का परीक्षण करने के लिए, सिलिका ट्यूबिंग के पीछे कागज का एक छोटा सा टुकड़ा रखें और लेजर चालू करें। फिर, विकिरण से जला क्षेत्र को मापने और विकिरण खिड़की और प्रवाह दर का उपयोग करने के लिए आवश्यक लेजर आवृत्ति की गणना करने के लिए शूंय का एक बहिष्कार अंश प्राप्त करते हैं । प्रक्रिया के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, एक उपयुक्त सेल संस्कृति ग्रेड नमक समाधान के साथ एक 70 से 90% लंढूद T175 फ्लास्क संस्कृति से कोशिकाओं को धोएं।गिनती के लिए बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की गिनती करना महत्वपूर्ण है कि वे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन प्रवाह प्रणाली को कुल और अवतरित करने के लिए बहुत सारे नहीं हैं। फिर कोशिकाओं को दो गुना 10 पर म्यान बफर एकाग्रता के मिलीलीटर के प्रति छठी कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और कोशिकाओं को प्रति नमूना १ ५०० माइक्रोलीटर मात्रा में एलिकोट करें ।इन-सेल एफओपी के लिए, ताजा म्यान बफर के साथ दो पांच मिलीलीटर सिरिंज, कोशिकाओं के एक aliquot के साथ मैग्नेट युक्त ५०० माइक्रोलीटर सिरिंज, और हौसले से तैयार २०० मिलीमोलर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ अंतिम ५०० माइक्रोलीटर सिरिंज भरें । डिमिथाइल सल्फोक्साइड के 220 माइक्रोलीटर में चुंबकीय स्टरर और स्पाइक को क्वेंच के एक एलिकोट पर चालू करें। कोमल मिश्रण के बाद, विकिरणित नमूनों को इकट्ठा करने और लेजर चालू करने के लिए प्रवाह प्रणाली के पीछे बुझाने रखें।सात सेकंड के बाद, प्रवाह प्रणाली चालू करें। एक बार नमूना बहने खत्म हो जाने के बाद, लेजर को बंद कर दें और धीरे-धीरे एकत्र नमूने के साथ बुझाने को मिलाएं। इसके बाद, सभी चार सीरिंज को ताजा बफर से भरें और प्रवाह प्रणाली के माध्यम से बफर को फ्लश करें।सिस्टम फ्लशिंग खत्म होने के बाद, कोशिकाओं के भीतर पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण के लिए खाते में कोई लेजर नियंत्रण के रूप में विकिरण के बिना कोशिकाओं और समाधानों के एक नए aliquot के साथ प्रक्रिया को दोहराएं। जबकि अगला नमूना चल रहा है, पहले नमूने को अपकेंद्री करें और एक उपयुक्त सेल लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। फिर, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीजिंग के लिए नमूने को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।जब सभी नमूने चल रहे हैं, तो प्रवाह प्रणाली को अलग करें और उपयोग किए गए सिलिका ट्यूबिंग को त्यागें। फिर, 50% पानी 50% मेथनॉल समाधान में एक घंटे के लिए सोनिकेशन द्वारा अन्य सभी कनेक्शनों को साफ करें। मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन को सेल लिसेट से अलग और पचाने के बाद, एफओपी संशोधन प्रोटियम-वाइड को स्थानीय बनाने के लिए मानक टैंडेम एलसीपीएस प्रोटोकॉल के अनुसार पचाने वाले सेल का विश्लेषण करें।फिर, डेटा को एक उपयुक्त प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में लोड करें और प्रासंगिक प्रोटीन डेटाबेस और प्रासंगिक डाइजेस्ट एंजाइम के खिलाफ डेटा का विश्लेषण करें। एक बार जब फ़ाइलें खोज समाप्त हो जाती हैं, तो ब्याज के प्रोटीन पर एफओपी ऑक्सीकरण की सीमा की गणना करें। ऑर्थोगोनल वाईजेड स्टैक्ड छवियों की फ्लोरेसेंस इमेजिंग सेल समाधान से म्यान बफर का स्पष्ट अलगाव दिखाती है क्योंकि यह लेजर विकिरण खिड़की से पिछले बहती है।म्यान बफर या सेल समाधान के तीन आयामी औसत गर्मी नक्शे दो समाधानों के न्यूनतम मिश्रण को समझाने के लिए उत्पन्न किए जा सकते हैं। सिंगल सेल फ्लो सिस्टम के इस्तेमाल से ऑक्सीडेटिवली मॉडिफाइड प्रोटीन की संख्या 13 गुना बढ़ जाती है। बरकरार कोशिकाओं के भीतर ब्याज के प्रोटीन के संशोधन की पुष्टि करने के लिए, फ्लोरेसेंस इमेजिंग हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार और विकिरण के बाद किया जा सकता है ।मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, इन संशोधनों को प्रोटीन पर विशिष्ट अमीनो एसिड के लिए आगे स्थानीयकृत किया जा सकता है। इस निकाले गए आयन क्रोमाटोग्राम में मनाया गया बदलाव संशोधित पेप्टाइड में ऑक्सीडाइज्ड मेथियोनिन के कारण हाइड्रोफोबिकिटी में बदलाव का अनुवाद करता है। इन-विट्रो पैरप्रिंटिंग द्वारा इन-सेल लेबल किए गए ऐक्टिन की तुलना करने से ऑक्सीकरण के समान स्तर का पता चलता है, यह दर्शाता है कि ऐक्टिन में इन-सेल और इन-विट्रो अध्ययन दोनों के लिए समान विलायक पहुंच है।इसके अलावा, सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी में ब्याज संशोधनों के प्रोटीन के तेजी से फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण की सीमा की तुलना, दो ऐक्टिन क्रिस्टल संरचनाओं से गणना किए गए लेबल अवशेष यह दर्शाता है कि इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण ब्याज के प्रोटीन की कुशलतापूर्वक मोनोमेरिक प्रोटीन की सॉल्वेंट पहुंच की जांच करता है। 2D क्रोमेटोग्राफी, उपकोशिकीय अंश, और प्रोटेओमिक्स मल्टीप्लेक्सिंग तकनीकों सहित कम प्रचुर मात्रा में एफओपी संशोधनों का पता लगाने को बढ़ाने के लिए कई अतिरिक्त कदम उठाए जा सकते हैं। इन-सेल एफओपी के उपयोग के साथ, अब हम सेलुलर फ़ंक्शन के साथ प्रोटीन संरचनाओं को बेहतर तरह से जोड़ने के लिए प्रोटेओमोस्ट्रक्चरल जीव विज्ञान कर सकते हैं।FPOP के लिए आवश्यक 248 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य के कारण, हमेशा प्रतिबिंबित या बिखरे हुए विकिरण के अनपेक्षित जोखिम से बचने के लिए यूवी सुरक्षात्मक चश्मे और उचित कपड़े पहनना सुनिश्चित करें।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

लाइव सेल Photoaffinity लेबल द्वारा एक मूल निवासी सेलुलर वातावरण में छोटे अणु-बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

अलगाव की Glomeruli और Vivo में Glomerular सेल सतह प्रोटीन की लेबलिंग

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

सुमो का स्थानीयकरण-संशोधित फ्लोरोसेंट सूमो-फँसाने प्रोटीन का उपयोग कर प्रोटीन

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

एक सबसेलुलर कंपार्टमेंट-विशिष्ट रेडॉक्स-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके सेलुलर ऑक्सीकरण का आकलन

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

प्रोटीन स्थलाकृति परिवर्तन के निर्धारण के लिए प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन में वास्तविक समय मुआवजा सक्षम करना

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ पोडोसाइटिक प्रोटीन नेफ्रिन, ऐक्टिन और पोडोसिन की इमेजिंग

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

चल XY स्टेज के साथ प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर: प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने के लिए एक नया मंच

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...