Name: characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2020-03-11T15:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

Эта работа была поддержана NSF CAREER Award (MCB1701692) для LMJ.

<ol>
	<li>Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+protein+footprinting+characterizes+the+structures+of+oligomeric+apolipoprotein+E2,+E3,+and+E4.">Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4.</a> Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+structural+resolution+hydroxyl+radical+protein+footprinting+reveals+an+extended+Robo1-heparin+binding+interface.">High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).</li><li>Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+comparing+structures+of+protein&#8722;+ligand+complexes:+the+calmodulin&#8722;+peptide+model+system.">Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein&#8722; ligand complexes: the calmodulin&#8722; peptide model system.</a> Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pH-induced+protein+structural+changes+under+equilibrium+conditions+by+pulsed+oxidative+labeling+and+mass+spectrometry.">Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cell+footprinting+coupled+with+mass+spectrometry+for+the+structural+analysis+of+proteins+in+live+cells.">In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Reorganization+of+Proteins+Revealed+by+Radiolysis+and+Mass+Spectrometry:+G-Actin+Solution+Structure+Is+Divalent+Cation+Dependent.">Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent.</a> Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).</li><li>Xu, G., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical-mediated+modification+of+proteins+as+probes+for+structural+proteomics.">Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics.</a> Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Kaur, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-Wide+Structural+Biology:+An+Emerging+Field+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+on+the+Proteomic+Scale.">Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+in+vivo+structural+dynamics+in+integral+membrane+protein+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).</li><li>Rinas, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+to+multidimensional+protein+identification+technology+(MudPIT):+expanding+footprinting+strategies+to+complex+systems.">Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).</li><li>Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+quantitation+strategy+for+hydroxyl+radical-mediated+protein+footprinting+using+Proteome+Discoverer.">An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).</li></ol>

Лиза Джонс является изобретателем на сборке потока для клеток патента (номер публикации: 20180079998).

Несколько методов на основе масс-спектрометрии были разработаны для изучения структуры белка и белково-лигажных комплексов в протеоме в широком порядке в целых клетках или клеточных лисатах. Эти методы включают в себя, но не ограничиваются стабильностью белков от скорости окисления (SPROX), теплового профилирования протеома (TPP), химического перекрестного соединения (XL-MS) и гидроксильного радикального протеина (HRPF). Каждый метод имеет уникальные ограничения и преимущества по сравнению друг с другом, которые были широко рассмотрены12. Каждый из этих методов были использованы для протеома широкой структурной биологии, чтобы выяснить структуру белка и в конечном итоге функционировать в сложной клеточной среде. IC-FPOP является методhrПФ, который использует гидроксиловые радикалы окислительно модифицировать растворителя подвергаются боковые цепи аминокислот, зондирования структуры белка и белка-лиганд взаимодействия в жизнеспособных клеток13. IC-FPOP является улучшением первоначального HRPF в живых клетках, которые использовали фентон химии для создания радикалов на минутсрок14. В этом исследовании структурные изменения в интегральном белке мембраны в ответ на снижение рН или ионной силы буфера были успешно охарактеризованы с хорошим покрытием окисления по всему белку. По сравнению с химией Фентон, IC-FPOP гораздо быстрее, изменяя белки на микросекундной шкале времени, что позволяет родной конформации белка, которые будут изучены.
Ключевым испытанием для IC-FPOP является подтверждение жизнеспособности клеток после воздействия H2O2. Используя линию смешивания 40 см, клетки инкубируются в H2O2 примерно за 3 с до облучения. Это время можно отрегулировать путем изменять длину этого tubing кремнезема. Примечательно, что, хотя использование трипан синий для проверки жизнеспособности клеток показывает целостность клеток устойчивы после H2O2 инкубации, клетки могут потенциально быть под стрессом, осуществляющих сигнальные пути, которые взаимодействуют с H2O2. К счастью, короткое время инкубации быстрее, чем синтез белка, обеспечивая уверенность в том, что присутствующие белки не индуцируются H2O2.
Следующим важным шагом является подтверждение правильной сборки системы потока. После сборки убедитесь, что после промывки системы с нужным буфером нет утечек. Если утечки присутствуют, убедитесь, что кремнезем трубки был сокращен должным образом и флеш против ferrule сделать надлежащее уплотнение раз ужесточили вниз. Все детали затягиваются вручную, поэтому инструменты не требуются. Во время каждого эксперимента IC-FPOP убедитесь, что магнитные мешалки в клеточном шприцах остаются в движении. Это небольшое возбуждение ограничивает количество клеток, которые оседают в нижней части шприца, но не достаточно суровы, чтобы стрижка клеток. После одного запуска в шприче осталось примерно 50 кл. Всегда убедитесь, что разбавить это с промывки шаг, чтобы ограничить количество клеток, которые переносят на следующий эксперимент. Рекомендуется использовать свежий клеточный шприц, если сравниваются несколько клеточных процедур. Важно также выбрать подходящий буфер для тестируемых ячеек. Некоторые буферы утоляют гидроксиль-радикал, что приводит к меньшему количеству изменений в белках. Xu et al. показали, что некоторые широко используемые буферы уменьшаются гидроксиловая радикальная продолжительность жизни11. DPBS и HBSS являются общими буферами, используемыми для экспериментов IC-FPOP.
Следуя IC-FPOP, оптимизируйте протокол пищеварения на основе необходимых параметров. Поскольку FPOP производит необратимые ковалентные модификации, имеется достаточно времени для тщательного пищеварения и очистки без потери покрытия маркировки. Всегда проверяйте и нормализуйте концентрацию белка, чтобы равномерное пептидное концентрации загружалось для тандемной масс-спектрометрии. Наконец, помните, что иммунопрецит не может быть выполнена в сочетании с IC-FPOP. Если модификация FPOP нацелена на область взаимодействия, сродство антитела будет снижено. Чтобы помочь увеличить идентификацию модификаций FPOP, 2D-хроматографические шаги разделения показали более чем в три раза количество окисленных пептидов обнаружено15.
Проблема любого эксперимента FPOP является сложный уровень анализа данных из-за возможных продуктов окисления, которые могут возникнуть. Это верно как для в-клетки или in vitro, но резко увеличивается с дополнительной сложности анализа клеточных лисатов. При дальнейшей оптимизации IC-FPOP возникает больше белков с более высоким охватом модификации, что делает анализ более трудным. Объем данных, полученных в ходе одного эксперимента IC-FPOP, ограничивает использование ручной проверки, заставляя исследователей в большей степени полагаться на программное обеспечение. В связи с этим, Rinas et al. разработали стратегию количественной оценки hrPF с использованием Proteome Discoverer (PD)16. Этот метод использует рабочий процесс многопоиска на PD в сочетании с количественной платформой в электронной таблице. В настоящее время проводятся дальнейшие усовершенствования платформы IC-FPOP с целью увеличения числа выявленных пептидов с модификациями FPOP наряду с повышением воспроизводимости и точностью количественной оценки.

Гидроксилрадикальный протеин след (HRPF) является методом, который зондирует платежеспособность белка через ковалентные изменения, производимые из гидроксилевых радикалов. Когда структура белка или белковые взаимодействия меняются, это изменит воздействие растворителя аминокислот, тем самым изменяя степень модификации остатков. С HRPF, белковые взаимодействия1,,2,3 3и белковые конформационные изменения4,,5,,6 успешно были допрошены в пробирке. Есть несколько методов, которые генерируют гидроксиловые радикалы для HRPF экспериментов, один из которых быстро ежей фотохимического окисления белков (FPOP). FPOP был разработан Hambly и Gross в 2005 году и использует 248 нм эксимерный лазер для производства гидроксиловадных радикалов через фотолиз перекиси водорода (H2O2)7.
Недавно Espino et al. расширили использование FPOP для исследования структуры белка в живых клетках, метод, называемый в клетке FPOP (IC-FPOP)8. В отличие от исследований in vitro, изучение белков в клетках объясняет молекулярную скученность наряду с различными белковыми взаимодействиями, которые потенциально могут влиять на структуру. Кроме того, он представляет собой преимущество предоставления снимок полного протеома потенциально предоставления структурной информации многочисленных систем сразу для выполнения протеом атакжем широкой структурной биологии. Кроме того, этот метод идеально подходит для белков, которые трудно изучать в пробирке, как мембранные белки.
Первоначальные исследования IC-FPOP успешно исследовали 105 белков, начиная от изобилия белка и клеточной локализации. Для улучшения метода IC-FPOP компания Rinas et al. разработала систему микропотока для одноклеточного потока9. Улучшение первоначальной системы потока ограничивает агрегацию клеток и увеличивает доступный H2O2 для облучения. В начальной системе потока клетки, слипающиеся в трубах кремнезема, приводили к засолькам и неравномерному облучению. Включение двух потоков оболочки буфера гидродинамически фокусирует клетки, позволяя им течь индивидуально мимо лазера. Включение отдельного шприца для H2O2 позволяет более контролируемое и оптимизируемое время экспозиции, что позволяет более высокие концентрации H2O2 без побочных эффектов. Кроме того, ограничение времени инкубации ограничивает разбивку H2O2 эндогенной каталазой. Путем включения этой новой системы потока, обнаруженное количество белков с модификацией FPOP увеличилось в 13 раз, тем самым расширяя возможности этого метода для зондирования множества белков в живых клетках. В этом протоколе описан общий эксперимент IC-FPOP, посвященный сборке системы потока IC-FPOP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock</td>
			<td>SGE Analytical Science</td>
			<td>008760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 &#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>04A-4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Tubing 1/16&#34; OD x 0.020&#34; ID</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1548L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 210 syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788212</td>
			<td>Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-618L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoTight Sleeve Green 1/16&#34; ID x .0155&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-242X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoTight Sleeve Yellow 1/16&#34; OD x 0.027&#34; ID x 1.6&#34;</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#34;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 &#181;m, Outer Diameter 360 &#181;m, TSP150350</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 &#181;m, Outer Diameter 670 &#181;m, TSP450670</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 &#181;m, Outer Diameter 360 &#181;m, TSP075375</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P382-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Magnetic Tumble Stirrer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 710D3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 710D3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel&#8482; (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-259X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16&#34; &#38; 1/32&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-255X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-700-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-700-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>LA4052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#38;P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VHP MicroTight Union for 360&#181;m OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>UH-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins

Быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) является гидроксиловрадикальным протеиновым методом, используемым для характеристики структуры белка и взаимодействий. FPOP использует 248 нм эксимерный лазер для фотолизуации перекиси водорода, производящего гидроксиловые радикалы. Эти радикалы окисляют растворительные открытые боковые цепи 19 из 20 аминокислот. В последнее время этот метод был использован в живых клетках (IC-FPOP) для изучения белковых взаимодействий в их родной среде. Изучение белков в клетках объясняет межмолекулярную скученность и различные взаимодействия белков, которые нарушаются для исследований in vitro. Пользовательская система потока одной ячейки была разработана для уменьшения агрегации и засорения клеток во время IC-FPOP. Эта система потока фокусирует клетки мимо эксимерного лазера индивидуально, обеспечивая таким образом последовательное облучение. Сравнивая степень окисления, производимого из FPOP, с доступностью растворителя белка, рассчитанной из кристаллической структуры, IC-FPOP может точно исследовать растворитель доступных боковых цепей белков.

IC-FPOP является методом следовдля взаимодействия белков в живых клетках. В системе потока IC-FPOP время воздействия H2O2 ограничено примерно 3 с, что требует более высоких концентраций H2O2 без пагубных последствий для клеток. Система потока также включает в себя два потока оболочки буфера, который гидродинамически фокусирует клетки в центре труб, производя один поток клеток, которые будут равномерно облучены (Рисунок 5)9. Флуоресценция изображения ортогоналированных Y ' сложенные изображения(Рисунок 5A) показывают четкое отделение буфера оболочки (содержащий фторфор FITC) от клеточного раствора (содержащего фторофор TMRM). Чтобы подчеркнуть это разделение, Рисунок 5B и Рисунок 5C показывают трехмерные средние карты тепла либо решения буфера оболочки или клеточного решения, иллюстрирующие минимальное смешивание двух решений.
Использование одноклеточной системы потока увеличивает количество окислительно модифицированных белков в 13 раз(рисунок 6А)9. В этом методе, белки во многих клеточных отсеках помечены мембранных белков, цитоплазматических белков и белков в ядре является наиболее распространенным8,9. Для обеспечения белки были изменены в нетронутых клеток, флуоресцентные изображения CellROX обработанных клеток были выполнены после H2O2 лечения и облучения(Рисунок 6B)8. Стабильность клеток на протяжении всего процесса маркировки еще больше подтверждает эффективность IC-FPOP для зондирования белков в их родной клеточной среде. Используя тандемно-масс-спектрометрию, эти модификации могут быть локализованы в конкретных аминокислотах на белке. Рисунок 7 представляет собой модификацию, которая происходит во время IC-FPOP вместе с извлеченной ионной хроматограммой. Сдвиг, наблюдаемый в извлеченной ионной хроматограмме, приводит к изменению гидрофобоксичности, вызванному окисленным метионином в модифицированном пептидном.
Чтобы проверить, если FPOP модификации зонда платежеспособной доступности внутри клеток, в клетке помечены актин был по сравнению как в пробирке следисследования исследования и различных кристаллических структур актина (Рисунок 8)8. В ячейке помечены актин представлен на рисунке 8показывает сопоставимые степени окисления из исследования in vitro Гуань и др.10 (Рисунок 8B), заключение актина имеет аналогичную платежеспособную доступность как для в-клеток и в пробирке исследований. Для дальнейшего подтверждения IC-FPOP зондирования платежеспособной доступности актина, степень модификаций FPOP были сопоставлены с платежеспособной доступности помеченных остатков, рассчитанных из двух кристаллических структур актина(рисунок 8C). Эта корреляция показывает, что IC-FPOP зондирует платежеспособность мономерного белка хорошо.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig1.jpg"> Рисунок 1: Как правильно построить ферули. (A) Место ferrules, кремнезем абонемента, и рукав вместе до затягивания. (B) Затяните все компоненты вместе. (C) Конечный продукт будет производить ferule, который был затянут вниз на рукаве. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig2.jpg"> Рисунок 2: Настройка системы потока IC-FPOP. (A) Изображение полностью собранной системы потока IC-FPOP, расположенной рядом с лазером. (B) Пример прокладки, необходимых для увеличения внешнего диаметра 500 шприцев, чтобы успешно затянуть все шприцы вниз вместе. (C) Представитель фотографии, показывающие пространство, необходимое для магнитных мешалки. (D) Пробки необходимы, чтобы затормозить шприц насос, не нарушая шприцы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig3.jpg"> Рисунок 3: Схема системы потока, разработанная для IC-FPOP. Синие линии представляют силика труб с 450 мкм ID и 670 мкм OD, красные линии имеют 150 мкм ID и 360 мкм OD, и оранжевые линии имеют 75 мкм ID и 360 мкм OD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig4.jpg"> Рисунок 4: Программное обеспечение для анализа белка, используемое для обнаружения модификаций FPOP. Типичный рабочий процесс с соответствующими изменениями, исискалемый в каждом узлах. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig5.jpg"> Рисунок 5: Система потока одной ячейки гидродинамически фокусирует клетки в один поток. (A) Orthogonal Y' стек иллюстрирующие 3D фокусировки клеточного аналита (красный, TMRM фторофора) в окружении оболочки буфера (зеленый, FITC фторофора). Трехмерная средняя тепловая карта тепловой оболочки буфера(B)и клеточного аналита(C). Более низкие интенсивности синие и самые высокие красные(B-C). Эта цифра была изменена от Rinas et al.9<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig6.jpg"> Рисунок 6: Использование системы потока IC-FPOP резко увеличивает модифицированные белки FPOP в клетках вхобовы. (A) Сравнение окисленных белков, отождествляемых с системой потока и без нее. Система потока идентифицировала 1391 FPOP модифицированных белков, в то время как только 105 белков были идентифицированы без системы потока с перекрытием 58 модифицированных белков. Эта цифра была изменена от Rinas et al.9 (B) Флуоресценция изображения клеток CellROX после IC-FPOP показать клетки по-прежнему нетронутыми после окислительной маркировки. Клетки были изображены с помощью мультифотонного микроскопа Olympus Fluoview FV1000 MPE на 665 нм. Показано изображение представляет собой один срез. Эта цифра была изменена с Espino и др.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig7.jpg"> Рисунок 7: Примеры тандемных спектров MS/MS, которые происходят во время IC-FPOP. Продукт-ион (MS/MS) спектра (A) неизмененный пептид, и (B) окисление обнаружено на остатках M8 найдены на том пептид. Представитель EIC (C) неизмененный пептид и (D) модифицированный пептид. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig8.jpg"> Рисунок 8: IC-FPOP эффективен в зондирования платежеспособности белков. (A) Масштабмодификация модификации для 9 окислительно модифицированных пептидов из актина. Значения отображаются как средние плюс и минус стандартные отклонения (n No 3). (B) Модификация актина пептиды окисляется в пробирке синхротронного радиолизотеного от Гуань и др.10 (C) Корреляция остатков FPOP модификаций с SASA в жесткой (треугольники, пунктирной линии тренда) и открытые (круги, твердая линия тренда) состояния актина. Эта цифра была изменена с Espino и др.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Здесь мы характеризуем структуру белка и места взаимодействия в живых клетках с помощью метода протеин-следа, называемого в клетке быстрым фотохимическим окислением белков (IC-FPOP).

Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Внутриклеточный FPOP в сочетании с масс-спектрометрией является мощным новым методом, используемым для изучения белковых белковых взаимодействий и структурных изменений белка в живых клетках. С в-клеток FPOP, вам не нужно изолировать белки, представляющие интерес, но может скорее изучить их в их родной среде. Это особенно полезно для мембранных белков.С помощью этого метода, вы можете изучить изменения в структуре и белковых взаимодействий в различных заболеваний, в том числе рака и генетических расстройств, так что вы можете лучше понять и охарактеризовать их. Чтобы начать сборку системы потока, используйте камень расщепления, чтобы сократить сплавленные трубы кремнезема до соответствующих размеров. Затем поместите шесть небольших цилиндрических магнитов в один 500 микролитровый шприц и заполните шприц, второй 500 микролитровый шприц и два пятими миллилитровых шприца с буфером оболочки.После удаления воздуха, поместите шприцы на шприц насоса и затянуть пробку насоса шприца так, что сотовый шприц имеет примерно 50 микролитров осталось, когда двигатель киосков. Используя адаптер приманки, подключите ручной клапан к каждому шприцу и соберите трубы кремнезема, как показано на иллюстрации, убедившись, что нить клетки плюс перекись водорода кремнезема линии через крест и вставить его непосредственно в 450 ID кремнезема линии. Когда все трубки были подключены, положение системы потока рядом с лазером и использовать зажигалку, чтобы сжечь кремнезема покрытие на 450 микрометров внутреннего диаметра трубки, чтобы сделать окно для лазерного облучения.Поместите магнитный мешалку над клеточным шприцем, содержащим шесть магнитов, и установите шприц-насос до 492,4 микролитров в минуту для окончательной скорости потока 1083,3 микролитров в минуту. Поток буфера через систему три раза, чтобы промыть систему, проверяя каждое соединение на любые утечки. Используйте выпуклые линзы, чтобы сосредоточить excimer лазера на кремнезема труб.Чтобы проверить окно облучения, поместите небольшой лист бумаги за трубами кремнезема и включите лазер. Затем измерьте область, сгоревшую от облучения, и используйте окно облучения и скорость потока для расчета необходимой частоты лазера, чтобы получить фракцию исключения нуля. Чтобы собрать клетки для процедуры, мыть клетки от 70 до 90%confluent T175 колбы культуры с соответствующим содержанием соли культуры клеток класса.Переусердствов клетки в 10 миллилитров буфера для подсчета и сбора клеток центрифугации. Очень важно подсчитать ячейки, чтобы убедиться, что они достаточно для анализа вниз по течению, но не слишком много, чтобы заставить их агрегировать и засорить систему потока. Затем повторное увеличение клеток в два раза от 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации буфера оболочки и aliquot клетки в один 500 микролитр объем на образец.Для в-клеток FPOP, заполнить два пятими миллилитровых шприцев со свежей оболочки буфера, 500 микролитр шприц, содержащий магниты с одной алицита клеток, и окончательный 500 микролитр шприц со свежеприготовленным 200 миллимолярной перекиси водорода. Включите магнитный мешалка и всплеск в 220 микролитров диметилового сульфоксида до одной алициты куанч. После нежного смешивания поместите утолить за системой потока, чтобы собрать облученные образцы и включить лазер.Через семь секунд включите систему потока. Как только образец закончит течь, выключите лазер и аккуратно смешайте утолить с собранным образцом. Затем заполните все четыре шприца свежим буфером и промыть буфер через систему потока.После того, как система закончит промывку, повторите процедуру с новой алицита клеток и растворов без облучения, как нет лазерного контроля для учета фонового окисления в клетках. В то время как следующий образец работает, центрифуза первый образец и повторно гранулы в 100 микролитров соответствующего буфера лиза клетки. Затем перенесите образец в микроцентрифугную трубку для флэш-замораживания в жидком азоте.Когда все образцы закончили работать, разобрать систему потока и отказаться от использованных труб кремнезема. Затем очистите все остальные соединения с помощью sonication в течение одного часа в 50%water 50%метанол раствор. После изоляции и переваривания белков из клетки лисат в соответствии со стандартными протоколами, анализировать переваренные клетки лисат в соответствии со стандартным тандемом LCMS протоколов для локализации модификации FPOP протиум-широкий.Затем загрузите данные в соответствующую программу анализа белка и проанализируйте данные с соответствующей базой данных белков и соответствующим ферментом дайджеста. Как только файлы будут закончены поиск, рассчитать степень Окисления FPOP на белок интереса. Флуоресценция изображения ортогональных изображений, сложенных Y, показывает четкое отделение буфера оболочки от клеточного раствора, когда он проходит мимо окна лазерного облучения.Трехмерные средние тепловые карты буфера оболочки или клеточного раствора могут быть созданы, чтобы проиллюстрировать минимальное смешивание этих двух решений. Использование одноклеточной системы потока увеличивает количество окислительно модифицированных белков в 13 раз. Для подтверждения модификации белков, представляющих интерес в нетронутых клетках, флуоресценция изображения могут быть выполнены после лечения перекиси водорода и облучения.Используя тандемную масс-спектрометрию, эти модификации могут быть дополнительно локализованы на специфические аминокислоты на белке. Сдвиг, наблюдаемый в этой извлеченной ионные хроматограммы переводится как изменение гидрофобности, вызванное окисленного метамфетамина в модифицированном пептиде. Сравнение в клетке помечены актин в пробирке след показывает аналогичные уровни окисления, что свидетельствует о том, что актин имеет аналогичную доступность растворителя для внутриклеточных и в пробирке исследований.Далее, сравнение степени быстрого фотохимического окисления белка процентных модификаций с доступностью растворителя, помеченные остатки, рассчитанные из двух актиных кристаллических структур, показывает, что в-клеточном быстром фотохимическом окислению белка интереса эффективно зондирует растворительную доступность мономерного белка. Есть несколько дополнительных шагов, которые можно предпринять, чтобы увеличить обнаружение более низких обильных модификаций FPOP, включая 2D хроматографию, субклеточную фракциацию и методы мультиплексирования протеомика. С использованием в-клеток FPOP, теперь мы можем выполнять протеомиоструктурной биологии, чтобы лучше соединить структуры белка с клеточной функцией.Из-за 248 нанометров длины волны, необходимых для FPOP, не забудьте всегда носить УФ защитные очки и правильную одежду, чтобы избежать непреднамеренного воздействия отраженного или рассеянного излучения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Оценка клеточного окисления с помощью подклеточного сулярного редокса-чувствительного зеленого флуоресцентного белка

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Включение компенсации в режиме реального времени в быстрых фотохимических окислениях белков для определения изменений топографии белка

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Платформа инкубатора с Movable XY этап: Новая платформа для реализации в ячейке быстрой фотохимической окисления белков

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...