Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

ونود أن نشكر الدكتورة سوشانا سفيندسن على التحرير النقدي. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية منحة 1621/18، ووزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST)، إسرائيل 3-15647، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي منحة ID DISC1-08800، ومؤسسة عائلة شيرمان، ومنحة NIH-NINDS 1UG3NS105703، ومنحة جمعية ALS 18-SI-389. تم تمويل AH من قبل مؤسسة والنبرغ (رقم المنحة 2015.0178).

1- توليد خلايا السلف العصبي المستمدة من المركز الدولي للحماية من الحماية (iNPCs)
<ol><li>إنتاج EZ-المجالات من مستعمرات iPSC كما هو موضح أدناه وكما نشرت سابقا20،21،22.<ol>
<li>المستعمرات iPSC الثقافة إلى التقاء على غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة 6 لوحات ...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

مزيج من تكنولوجيا الجهاز على رقاقة والخلايا المستمدة من iPSC في NVU يحمل وعدا لنمذجة دقيقة من BBB الإنسان. هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا للتطبيق البسيط والقوي لرقاقة BBB16التي تم نشرها مؤخرًا في iPSC. يتم عرض نظرة عامة وتوقيت نموذج البذر في الشكل 3. للحصول على وظائف الحاج...

BBB هو حاجز انتقائي للغاية يفصل الجهاز العصبي المركزي عن الدم المتداول. فهو يحمي وظائف الدماغ الحرجة من المواد والعوامل والمواد المدمرة المحتملة ، مع السماح أيضًا بتدفق العناصر الغذائية والأيض الأخرى المطلوبة للحفاظ على التوازن الدماغي1. وBBB هو NVU متعددة الخلايا التي pericytes، الخلايا الفلكية endfeet، والعمليات العصبية الاتصال مباشرة الدماغ الخلايا الفيوائية الدقيقة (BMECs). تسمح هذه التفاعلات لـ BMECs بتشكيل خصائص حاجز متخصصة مدعومة بتقاطعات ضيقة والتقيدية2و3. يحدد تشكيل هذا الحاجز مرور الجزيئات دون الخلايا ، ولكنه يحتوي على ناقلات مستقطبة لنقل الجزيئات بنشاط إلى الجهاز العصبي المركزي أو العودة إلى الدم1. بسبب هذه الخصائص الحاجز فريدة من نوعها، وBBB يشكل عقبة رئيسية أمام تسليم المستحضرات الصيدلانية الحيوية في الدماغ، ويقدر أن أقل من 5٪ من الجزيئات الصغيرة المعتمدة من ادارة الاغذية والعقاقير يمكن أن تصل إلى CNS4.
وقد استخدمت على نطاق واسع نماذج الحيوانات لدراسة BBB penetrance والآليات الجزيئية المشاركة في تطوير BBB5. في حين أن النماذج الحيوانية تمثل بأمانة الخلايا المتعددة المعقدة في بيئة الجسم الحي ، فإن الاختلافات في التعبير والنشاط من ناقلات BBB وكذلك خصوصية الركيزة عبر الأنواع غالبًا ما تحول دون الاستقراء الدقيق للبيانات الحيوانية للبشر6. وبالتالي، فإن النماذج القائمة على الإنسان حاسمة لدراسة BBB البشري وللاستخدام في تطوير الأدوية المصممة لاستهداف الجهاز العصبي المركزي. وتزداد هذه الحاجة وضوحا مع تزايد هيمنة العقاقير البيولوجية الخاصة بالإنسان في مجال التطوير الصيدلاني. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن BBB للخطر يرتبط بعدد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي الحادة ، بما في ذلك أورام الدماغ والأمراض العصبية7،8،9. النماذج البشرية التي تعكس بأمانة هذه الأمراض لديها القدرة على حد سواء 1) تحديد مسارات جديدة التي يمكن أن تستهدف لتطوير المخدرات و 2) التنبؤ CNS penetrance، وبالتالي تقليل الوقت والموارد في الدراسات قبل السريرية وربما خفض معدل الفشل في التجارب السريرية.
وقد تم تنفيذ نماذج في المختبر على نطاق واسع لدراسة التفاعلات بين BMECs والخلايا الأخرى من NVU وإجراء شاشات للأدوية المحتملة BBB نفاذة10. لإعادة الجوانب الرئيسية للBBB الإنسان، يجب أن تظهر النماذج المختبرية في الخصائص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (أي نفاذية شبه خلوية منخفضة والمقاومة الكهربائية العابرة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية [TEER] عبر الطبقة الأحادية البطانية). وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتضمن التوصيف الجزيئي لنظام في المختبر التعبير عن نظم نقل وظيفية تمثيلية. عادة، تتكون النماذج المختبرية من الخلايا البطانية التي تشارك في الاستزراع على غشاء شبه نفاذ مع مجموعات من خلايا NVU الأخرى لتعزيز خصائص BBB11. يسمح هذا النهج بتقييم بسيط وسريع نسبيًا لوظائف العوائق ونفاذية الجزيء. ويمكن إنشاء نماذج BBB هذه القائمة على الخلايا مع مصادر الخلايا الحيوانية أو البشرية، بما في ذلك الخلايا المعزولة عن الختان الجراحي أو خطوط BMEC الخالدة.
في الآونة الأخيرة ، تم إدخال بروتوكولات للتمييز بين الخلايا البشرية متعددة القدرات في BMECs كمصدر جذاب لنماذج BBB البشرية في المختبر12،13. الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من BMECs (iBMECs) قابلة للتطوير بشكل كبير ، وتظهر الخصائص المورفولوجية والوظيفية الحاسمة لـ BBB البشري ، وتحمل علم الوراثة للمريض. في الثقافة ، تشكل iBMECs طبقة أحادية تعبر عن علامات التقاطع الضيقة وشاشات العرض في مجمعات التقاطع الضيقة الشبيهة بالجسم الحي. هذه الخلايا أيضا التعبير عن علامات BBB، بما في ذلك ناقل الجلوكوز BBB، نقل الجلوكوز 1 (GLUT1). الأهم من ذلك ، وعلى عكس مصادر الخلايا البديلة الأخرى لBMECs الإنسان ، iBMECs الحصول على خصائص الحاجز مع قيم عالية مثل تلك التي تقاس في الجسم الحي14، الاستقطاب على طول المحور البافولياني ، ومضخات efflux وظيفية صريحة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام iPSCs من مختلف المواضيع على حد سواء 1) يرحب بفرصة لاختبار جوانب BBB بطريقة الطب الشخصي و 2) يوفر مصدرا مرنا لتوليد أنواع إضافية من الخلايا NVU. توليد هذه الخلايا من مصدر خلية isogenic لإنشاء رقائق BBB شخصية من شأنه أن يساعد أيضا في فهم الاختلافات بين الأفراد في استجابات المخدرات، وهو سبب رئيسي للمقاومة أو الاستجابة للخطر للعلاج لوحظ في الدراسات السريرية.
استخدام iBMECs كأحادية في طبق أو على إدراج transwell شبه نفاذية يمثل نهجًا قويًا لنمذجة BBB. وتميل هذه النظم إلى أن تكون قوية وقابلة للاستنساخ وفعالة من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحليلات الوظيفية مثل TEER ونفاذية بسيطة نسبيا ً. ومع ذلك ، تفشل الأنظمة ثنائية الأبعاد (2D) في تلخيص الطبيعة ثلاثية الأبعاد في الأنسجة العضوية ، وتفتقر إلى قوى إجهاد القص الفسيولوجية التي توفرها الدم المتداولو وخلايا الدم. وهذا يحد من قدرة بطانة الأوعية الدموية في هذه النماذج لتطوير والحفاظ على خصائص BBB الجوهرية والوظائف.
وقد تم تنفيذ أنظمة دقيقة تصطف من قبل الخلايا الحية لنموذج وظائف الجهاز المختلفة في مفهوم يسمى الجهاز على رقائق. من خلال إعادة إنشاء في الهندسة المعمارية متعددة الخلايا مثل الجسم الحي ، واجهات الأنسجة والأنسجة ، والبيئات الدقيقة الفيزيائية الكيميائية ، والتسريب الوعائي ، تولد هذه المنصات المجهرية مستويات من وظائف الأنسجة والأعضاء غير ممكن مع أنظمة الثقافة 2D التقليدية. كما أنها تمكن عالية الدقة، والتصوير في الوقت الحقيقي، وتحليل الملامح البيوكيميائية والوراثية والأيضية مماثلة للخلايا الحية في الأنسجة العضوية وسياق الجهاز. ومع ذلك ، فإن التحدي الخاص للجهاز على رقاقة هو أن تصميم وتصنيع وتطبيق هذه الرقائق الدقيقة يتطلب خبرة هندسية متخصصة تفتقر عادة إلى المختبرات الأكاديمية الموجهة بيولوجيا.
لقد قمنا مؤخرا الجمع بين iPSC والتكنولوجيات الجهاز على رقاقة لتوليد شخصية BBB رقاقة نموذج15،16. من أجل التغلب على التحديات التكنولوجية الموصوفة ، يتم استخدام Chip-S1 المتاحة تجاريًا مع وحدة الثقافة ، وهي أداة مصممة لأتمتة صيانة الرقائق بطريقة بسيطة وقوية (Emulate Inc.). تعيد رقاقة BBB التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الانبوبيلية وتحقق قيم TEER ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والتي تقاس برقائق الأعضاء المصنوعة خصيصًا مع أقطاب ذهبية متكاملة17. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض رقاقة BBB نفاذية منخفضة دون خلوية ، وتستجيب للإشارات الالتهابية على مستوى الأعضاء ، وتعبر عن مضخات efflux نشطة ، وتعرض النقل التنبؤي للعلامات الحيوية القابلة للذوبان والمستحضرات الصيدلانية الحيوية. وتجدر الإشارة إلى أن رقائق BBB المتولدة من عدة أفراد تلتقط الاختلافات الوظيفية المتوقعة بين الأفراد الأصحاء والمرضى الذين يعانون من أمراض عصبية15.
يصف البروتوكول المفصل أدناه طريقة موثوقة وفعالة وقابلة للاستنساخ لتوليد رقائق BBB البشرية المستندة إلى iPSC في ظل ظروف التدفق الديناميكي. وتقدم إرشادات بشأن نوع التحاليل وتحاليل نقاط النهاية التي يمكن إجراؤها مباشرة في رقاقة BBB أو من النفايات السائلة لأخذ العينات. وهكذا، يبين البروتوكول مجموعة التقنيات التي يمكن تطبيقها لتقييم الخصائص والاستجابات البيولوجية والوظيفية في نموذج ذي صلة بالإنسان.
يتم تقديم وصف موجز لشريحة BBB المستندة إلى iPSC هنا. يتم تمييز iPSCs الإنسان في البداية ونشرها في قوارير زراعة الأنسجة كمجاميع عائمة حرة من السلف العصبية ، ويسمى EZ- المجالات. القناة العليا من رقاقة-S116,18,19 هو المصنف مع المنفصلة EZ-المجالات التي تشكل "الجانب الدماغي" من رقاقة, كما الخلايا التفريق على مدى 7 أيام في ثقافة مختلطة من الخلايا السلف العصبية (iNPCs), iAstrocytes, وiNeurons. كما يتم تمييز iPSCs الإنسان في لوحات زراعة الأنسجة في iBMECs. يتم بذر القناة السفلية للرقاقة مع iBMECs لتشكيل "جانب الدم" لأنها تتطور لتشكيل أنبوب الفيوثيوليلي(الشكل 1). يسمح الغشاء المطلي بالمصفوفة خارج الخلية المسامية (ECM) الذي يفصل بين القنوات العلوية والسفلية 1) بتكوين تفاعلات بين الخلية وبين القنوات و2) يسمح للمستخدم بتشغيل المقالات الدقيقة وخلايا الصور في أي من القناة باستخدام مجهر الضوء التقليدي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

يتشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) من وحدات الأعصاب الوعائية (NVUs) التي تحمي الجهاز العصبي المركزي (CNS) من مجموعة من العوامل الموجودة في الدم التي يمكن أن تعطل وظيفة الدماغ الحساسة. على هذا النحو ، فإن BBB هو عقبة رئيسية أمام تقديم العلاجات إلى الجهاز العصبي المركزي. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن BBB يلعب دورًا رئيسيًا في ظهور وتطور الأمراض العصبية. وبالتالي، هناك حاجة هائلة لنموذج BBB التي يمكن التنبؤ بتغلغل الأدوية التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي وكذلك توضيح دور BBB في الصحة والمرض.
لقد قمنا مؤخرًا بدمج تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC) لتوليد شريحة BBB مخصصة تمامًا للبشر. تعرض هذه المنصة الجديدة الخصائص الخلوية والجزيئية والفسيولوجية المناسبة للتنبؤ بنقل الأدوية والجزيئات عبر BBB البشري. وعلاوة على ذلك، وباستخدام رقائق BBB الخاصة بالمريض، قمنا بتوليد نماذج من الأمراض العصبية وأظهرنا إمكانية تطبيقات الطب التنبؤي الشخصية. ويرد هنا بروتوكول مفصل يوضح كيفية توليد رقائق BBB المشتقة من iPSC، بدءا ً من تمايز الخلايا البوائية الدقيقة الوعائية المشتقة من iPSC في الدماغ (iBMECs) وينتج عنه ثقافات عصبية مختلطة تحتوي على السلف العصبية، الخلايا العصبية المتباينة، والخلايا الفلكية. كما وصف إجراء لزرع الخلايا في رقاقة الجهاز وزراعة رقائق BBB تحت تدفق laminar التي تسيطر عليها. وأخيراً، يتم تقديم أوصاف تفصيلية لتحليلات رقاقة BBB، بما في ذلك الاختبارات التفصيلية شبه الخلوية لتقييم نفاذية الدواء والجزيء وكذلك الطرق المناعية الكيميائية لتحديد تكوين أنواع الخلايا داخل الشريحة.

الشكل 6A, B, C يمثل رقاقة BBB المصنفة مع EZ-spheres على القناة العلوية "الجانب الدماغي" وiBMECs على القناة السفلية "جانب الدم". تم بذر iBMECs أولاً وسمح لها بالتعلق بين عشية وضحاها ، وبعد ذلك تم بذر مجالات EZ. ثم تم استزراع الرقائق في ظل ظروف ثابتة مع استبدال الوسائط اليومية لمدة سبع?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو وحدة متعددة الخلايا العصبية الوعائية تنظم بإحكام التوازن الدماغي. من خلال الجمع بين iPSCs الإنسان والتكنولوجيات الجهاز على رقاقة، قمنا بتوليد رقاقة BBB شخصية، ومناسبة لنمذجة المرض وCNS التنبؤات اختراق المخدرات. يتم وصف بروتوكول مفصل لتوليد وتشغيل رقاقة BBB.

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

هذا البروتوكول سوف تظهر كيف يمكن أن تكون البذور متمايزة مستحثة الخلايا الجذعية متعددة القدرات على جهاز على رقاقة لتوليد الإنسان تماما، شخصية، حاجز الدم في الدماغ microfluidic، والتي يمكن استخدامها للتنبؤ نفاذية المخدرات الجهاز العصبي المركزي ودراسة الاضطرابات العصبية. باستخدام الجهاز على رقاقة المتاحة تجاريا، وسوف نبين كيف يمكن لأي مختبر الموجه بيولوجيا استخدام هذه التكنولوجيا لتوليد شخصية، microfluidic حاجز الدم في الدماغ على رقاقة. وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن BBB يلعب دورا في الأمراض العصبية من خلال توليد رقائق BBB الشخصية المستمدة من iPSCs من الأفراد الذين يعانون من مرض عصبي وراثي.وسيكون من الممكن دراسة دور BBB في الصحة والمرض. ويمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة أيضا لشركات الأدوية، التي يمكن أن تستخدم هذه منصة BBB الإنسان لفحص لpenetrability من الأدوية العصبية مرشح في الدماغ البشري. إن تطبيق التكنولوجيات الخاصة بالأعضاء على الشريحة يتطلب عادة مهارات هندسية متخصصة.باستخدام منصات متاحة تجاريا تمكن تطبيق هذه التكنولوجيا في أي مختبر الموجهة بيولوجيا. للبدء، جلب الطبق الذي يحتوي على رقائق أعدت لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. باستخدام ماصة P200، وغسل بلطف كلا القناتين عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من التمايز العصبي المتوسطة في مدخل وسحب السائل من منفذ.تجنب الاتصال مع الموانئ، وpirpirate بعناية قطرات وسائل الإعلام الزائدة من سطح الشريحة. يهيج بلطف تعليق الخلية لضمان تعليق الخلية متجانسة. لزرع الخلايا السلف العصبي المشتقة من iPSC في القناة العليا لتوليد جانب الدماغ ، أضف نصيحة P200 تحتوي على 30 إلى 100 ميكرولترات من تعليق الخلايا بتركيز مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر إلى مدخل القناة العلوي ، والإفراج بلطف عن الطرف من الماصة.خذ ماصة P200 فارغة، والاكتئاب المكبس، وإدراج في منفذ القناة العلوي، وسحب بعناية تعليق خلية واحدة من خلال طرف. نقل رقاقة إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر والتوزيع المتجانس للخلايا داخل القناة العليا. بعد التأكد من كثافة الخلية في تغطية 20٪، على الفور وضع رقائق في الحاضنة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.بعد ذلك، وغسل الخلايا التي لا نعلق بإضافة تمايز عصبي جديد المتوسطة في مدخل وسحب السائل عن طريق ماصة من مأخذ. إبقاء الخلايا في ظل ظروف ثابتة في 37 درجة مئوية مع استبدال متوسط التمايز العصبي اليومي. بعد أن تعلق INPCs أو في يوم لاحق بعد البذر ، أحضر الطبق الذي يحتوي على رقائق جاهزة إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية.غسل بلطف القناة السفلية مع 200 ميكرولترات من وسط الخلية البطانية. تجنب الاتصال مع الموانئ، قطرات التعرق بعناية من فائض متوسط الخلية ال endothelial من سطح الشريحة، مع التأكد من ترك المتوسطة في كلتا القناتين. يهيج بلطف تعليق الخلية لضمان تعليق الخلية متجانسة.باستخدام ماصة P200، رسم ما يصل 30 إلى 100 ميكرولترات من الدماغ المشتقة من iPSC تعليق الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية بتركيز 14 إلى 20 مرة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر، ووضع الطرف في القناة السفلية مدخل. الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق خصائص الحاجز الوظيفي هو بذر خلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. من الأهمية بمكان أن الخلايا البذور في الكثافة المناسبة لتجنب تشكيل فقاعة للتحقق من التوزيع متجانسة داخل رقاقة الجهاز.اِكْدُ المكبس على ماصة P200 مع طرف فارغ، إدراج في منفذ القناة السفلي، والإفراج ببطء المكبس ماصة لسحب بعناية تعليق خلية واحدة من خلال القناة السفلي. استلهمي تعليق الخلايا الزائدة من سطح الرقاقة. تجنب الاتصال المباشر مع منافذ المدخل والمنفذ لضمان عدم ستنشق أي تعليق الخلية من القنوات.نقل رقاقة إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر. يتم ملء القناة السفلية مع الخلايا مع عدم وجود فجوات ملحوظة في ما بين. بعد التأكد من كثافة الخلايا الصحيحة، بذور الخلايا في رقائق المتبقية.لإرفاق الخلايا على الغشاء المسامي، الذي يقع على قمة القناة السفلية، عكس كل رقاقة، والسماح لهم بقية في مهد رقاقة. ضع خزانًا صغيرًا يحتوي على DPBS معقمة داخل الطبق 150 ملليمترًا لتوفير الرطوبة للخلايا. احتضان الرقائق في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا أو حتى الخلايا في القناة السفلية قد تعلق.مرة واحدة في الدماغ المشتقة من iPSC الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية قد تعلق، الوجه رقائق العودة إلى وضع مستقيم للسماح مرفق الخلية إلى الجزء السفلي من القناة السفلية. 48 ساعة بعد البذر من الخلايا البطانية الدقيقة الدماغ المشتقة من iPSC، توازن درجة حرارة وسط الخلية البطانية عن طريق الاحترار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، degas المتوسطة عن طريق الحضانة تحت نظام الترشيح التي يحركها فراغ لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك، قم بتعقيم السطح الخارجي للتعبئة والتغليف و الصواني المحمولة مع 70٪ من الإيثانول، مسح، ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية. افتح العبوة، وضع الوحدات النمطية في الدرج توجهها مع الخزانات باتجاه الجزء الخلفي من الدرج. Pipette ثلاثة ملليلتر من ما قبل التوازن، وسائل الإعلام الدافئة إلى كل خزان مدخل.إضافة ثقافة الخلية البطانية المتوسطة إلى خزان مدخل القناة السفلية والتمايز العصبي المتوسطة إلى خزان مدخل القناة العليا من القناة العليا. ثم، ماصة 300 ميكرولترات من وسائل الإعلام قبل التوازن، دافئة إلى كل خزان منفذ، مباشرة على كل منفذ منفذ. ضع ما يصل إلى ست وحدات محمولة على كل صينية.جلب الصواني إلى الحاضنة، والانزلاق تماما في وحدة الثقافة مع مقبض علبة تواجه الخارج. حدد وتشغيل دورة رئيس الوزراء على وحدة الثقافة. أغلق باب الحاضنة، واسمح للوحدة النمطية للثقافة بـ Prime الوحدات المحمولة لمدة دقيقة واحدة.يتم إكمال دورة فتيلة عندما يقرأ شريط المعلومات جاهزة. قم بإزالة الدرج من وحدة الثقافة، واحضره إلى خزانة السلامة الحيوية. فحص الجانب السفلي من كل وحدة محمولة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية للتحقق من أن الوحدات المحمولة تم بنجاح.ابحث عن وجود قطرات صغيرة في جميع المنافذ الأربعة. إذا لم تظهر أي وحدة محمولة قطرات، أعد تشغيل دورة رئيس الوزراء على تلك الوحدات النمطية. إذا كان أي وسائط يقطر على الدرج، والذي يحدث في كثير من الأحيان من منافذ منفذ، تنظيف علبة مع 70٪ الإيثانول.بعد ذلك، قم بغسل كل قناتي كل شريحة بوسيلة ثقافة دافئة ومُتَحدَّدة لل الخلايا لإزالة أي فقاعات محتملة في القناة، ووضع قطرات صغيرة من الوسائط على الجزء العلوي من كل مدخل ومنفذ منفذ. أدخل الرقائق مع حاملات في الوحدات المحمولة، ووضع ما يصل إلى ستة على كل صينية. أدخل الصواني في الوحدة النمطية للثقافة.قم ببرمجة شروط ثقافة شريحة الجهاز المناسبة، مثل معدل التدفق والتمدد، على وحدة الثقافة. بمجرد اكتمال دورة التنظيم ، والتي تستغرق حوالي ساعتين ، تبدأ الشروط المبرمجة. بعد ذلك، وحدة ثقافة يبدأ تدفق في شروط ثقافة رقاقة الجهاز مسبقا.الكيمياء المناعية على رقاقة حاجز الدم في الدماغ المستندة إلى iPSC سبعة أيام بعد البذر يظهر مجالات EZ متفاوتة في مجموعة خلايا عصبية مختلطة في القناة الجانبية للدماغ العلوي، بما في ذلك S100 بيتا إيجابية الفلكية، نستين إيجابية الخلايا السلف العصبية، فضلا عن GFAP-الخلايا الفلكية الإيجابية، وبيتا الثالث tubulin-الخلايا العصبية الإيجابية. IPSC المستمدة من خلايا البطاخلية البطانية الدقيقة الأوعية الدموية المشتقة من IPSC المصنفة في قناة الجانب الدم السفلي أعرب GLUT-1 وPECAM-1. تقييم نفاذية حاجز حاجز الدم في الدماغ يوضح أن رقاقة الجهاز بذر مع الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية الدقيقة الدماغ المشتقة من iPSC ومجالات EZ كان لها حاجز ضيق مقارنة مع رقائق الجهاز بذر مع الخلايا البطانية البطانية الأوعية الدموية الدقيقة المشتقة من iPSC وحدها.لم تظهر رقائق الأعضاء المصنفة مع مجالات EZ وحدها أي خصائص الحاجز. من المعالجة السطحية الأولية للقناة إلى التبديل المتوسط كل يوم ، تجنب تشكيل الفقاعة في القناة. في جميع مراحل الخطوة في البروتوكول الذي يجب إدخال مُشفر التنشيط السطحي أو المصفوفة خارج الخلية أو الوسيطة المحتوية على الخلايا عبر القنوات، من المهم للغاية التحقق من عدم وجود فقاعة بعناية.يمكن إجراء فحص نفاذية لتقييم penetrability الدماغ البشري من الأدوية المرشحة. ويمكن أن يفيد هذا النهج في اختبار العلاجات المحتملة. تطبيق رقاقة BBB المستندة إلى iPSC يسمح بدراسة دور BBB في الأمراض العصبية المختلفة.في المستقبل، قد تكون هذه المنصة مفيدة لتطبيقات الطب التنبؤية والشخصية.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

جيل من الخلايا الجذعية الدهنية لجسم الإنسان من خلال فقد التمايز من الناضجة الخلايا الشحمية في الثقافات السقف

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من سرطان الجلد البشري الخلايا اللمفاوية-التسلل الورم

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

محددة وقابلة للتطوير الجيل من الخلايا تشبه الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...