Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

We willen Dr. Soshana Svendsen bedanken voor de kritische montage. Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation subsidie 1621/18, het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST), Israël 3-15647, het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde subsidie ID DISC1-08800, de Sherman Family Foundation, NIH-NINDS subsidie 1UG3NS105703, en De ALS Association subsidie 18-SI-389. AH werd gefinancierd door Stichting Wallenberg (subsidienummer 2015.0178).

1. Generatie van iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen (iNPC's)
<ol><li>Produceer EZ-bollen uit iPSC-kolonies zoals hieronder beschreven en zoals eerder gepubliceerd20,21,22.<ol>
<li>Cultuur iPSC kolonies aan samenvloeiing op keldermembraan matrijs 6 goedplaten (0.5 mg/plaat) in mTESR1 of andere commerciële media (zie Lijst van Materialen).</li>
		<li>IPSC-medium verwijderen en vervangen door 2 mL EZ-bolmedi...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

De combinatie van organ-on-chip technologie en iPSC-afgeleide cellen in de NVU belooft een nauwkeurige modellering van de menselijke BBB. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige en robuuste toepassing van de onlangs gepubliceerde iPSC-gebaseerde BBB-chip16. Een overzicht en timing van het zaaiparadigma is te zien in figuur 3. Het verkrijgen en behouden van barrièrefuncties die geschikt zijn voor BBB-modellering, het genereren van een homogene iBMEC-...

De BBB is een zeer selectieve barrière die het CNS scheidt van het circulerende bloed. Het beschermt kritieke hersenfuncties tegen potentieel storende stoffen, factoren en xenobiotica, terwijl ook de instroom van voedingsstoffen en andere metabolieten die nodig zijn om de hersenen homeostase te behouden1. De BBB is een meercellige NVU waarin pericytes, astrocyte endfeet en neuronale processen rechtstreeks contact opnemen met hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMECs). Deze interacties stellen BMECs in staat om gespecialiseerde barrière-eigenschappen te vormen die worden ondersteund door strakke en aanhangende knooppunten2,3. De vorming van deze barrière beperkt de paracellulaire passage van moleculen, maar het bevat gepolariseerde transporters om actief moleculen in het CNS of terug in het bloed te transporteren1. Als gevolg van deze unieke barrière eigenschappen, de BBB vormt een groot obstakel voor de levering van biofarmaceutica in de hersenen, en er wordt geschat dat minder dan 5% van de FDA-goedgekeurde kleine moleculen kan de CNS4te bereiken.
Diermodellen zijn op grote schaal gebruikt om BBB penetrance en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij BBB ontwikkeling5te bestuderen. Terwijl diermodellen getrouw de complexe meercellige in vivo omgeving vertegenwoordigen, sluiten verschillen in expressie en activiteit van BBB-transporters en substraatspecificiteit tussen soorten vaak een nauwkeurige extrapolatie van dierlijke gegevens naar de mens uit6. Zo zijn op mensen gebaseerde modellen van cruciaal belang om de menselijke BBB te bestuderen en voor gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen die zijn ontworpen om het CNS te targeten. Deze behoefte wordt nog duidelijker met de toenemende dominantie van biologische, mensspecifieke geneesmiddelen op het gebied van farmaceutische ontwikkeling. Accumulerend bewijs suggereert dat een gecompromitteerde BBB wordt geassocieerd met een aantal ernstige CNS-aandoeningen, waaronder hersentumoren en neurologische aandoeningen7,8,9. Menselijke modellen getrouw als gevolg van deze ziekten hebben het potentieel om zowel 1) nieuwe trajecten die kunnen worden gericht voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te identificeren en 2) voorspellen CNS penetrantie, waardoor de tijd en middelen in preklinische studies en eventueel afnemende percentage mislukkingen in klinische studies.
In vitro modellen zijn op grote schaal geïmplementeerd om interacties tussen BMECs en andere cellen van de NVU te bestuderen en schermen uit te voeren voor potentiële BBB-doorlatende geneesmiddelen10. Om belangrijke aspecten van de menselijke BBB na te bootsen, moeten in vitro modellen fysiologisch relevante eigenschappen (d.w.z. lage paracellulaire permeabiliteit en fysiologisch relevante transendotheliale elektrische weerstand [TEER] over de endothelialmonolayer) weergeven. Bovendien moet het moleculaire profiel van een in vitro systeem de expressie van representatieve functionele transportsystemen omvatten. Typisch, in vitro modellen zijn samengesteld uit endotheliale cellen die co-gekweekt op een semipermeabel membraan met combinaties van andere NVU cellen om BBB eigenschappen te verbeteren11. Deze aanpak maakt een eenvoudige en relatief snelle beoordeling van barrièrefunctionaliteit en molecuuldoorlaatbaarheid mogelijk. Dergelijke op cellen gebaseerde BBB-modellen kunnen worden vastgesteld met dierlijke of menselijke celbronnen, waaronder cellen geïsoleerd van chirurgische excisions of vereeuwigde BMEC-lijnen.
Onlangs werden protocollen om menselijke pluripotente cellen te onderscheiden in BMECs geïntroduceerd als een aantrekkelijke bron voor in vitro menselijke BBB-modellen12,13. Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide BMECs (iBMECs) zijn zeer schaalbaar, tonen cruciale morfologische en functionele kenmerken van de menselijke BBB aan en dragen de genetica van de patiënt. In de cultuur vormen iBMECs een monolayer die strakke verbindingsmarkeringen en displays uitdrukt in vivo-achtige strakke knooppuntcomplexen. Deze cellen drukken ook BBB-markers uit, waaronder de BBB glucosetransporter, glucosetransporter 1 (GLUT1). Belangrijk is, en in tegenstelling tot andere alternatieve celbronnen voor menselijke BMECs, iBMECs verwerven barrière eigenschappen met waarden zo hoog als die gemeten in vivo14, polariseren langs de basolaterale as, en uitdrukken functionele efflux pompen. Bovendien is het gebruik van iPSCs van verschillende onderwerpen beide 1) verwelkomt de mogelijkheid om aspecten van de BBB te testen in een gepersonaliseerde geneeskunde manier en 2) biedt een flexibele bron voor het genereren van extra celtypes van de NVU. Het genereren van deze cellen uit een isogene celbron om gepersonaliseerde BBB-chips te maken, zou ook helpen bij het begrijpen van inter individuele verschillen in medicijnreacties, wat een belangrijke oorzaak is voor resistentie of gecompromitteerde respons op behandeling die in klinische studies wordt waargenomen.
Het gebruik van iBMECs als monolagen in een schaal of op een semi doorlaatbare transwell insert is een krachtige aanpak voor BBB modellering. Deze systemen zijn meestal robuust, reproduceerbaar en kosteneffectief. Daarnaast zijn functionele analyses zoals TEER en doorlaatbaarheid relatief eenvoudig uit te voeren. Echter, tweedimensionale (2D) systemen niet aan de 3D-aard van in vivo weefsel recapituleren, en ze missen de fysiologische afschuif stress krachten die door circulerende bloed en bloedcellen. Dit beperkt het vermogen van het vasculaire endotheel in deze modellen om intrinsieke BBB-eigenschappen en -functies te ontwikkelen en te behouden.
Micro-engineered systemen bekleed door levende cellen zijn geïmplementeerd om verschillende orgaanfunctionaliteiten te modelleren in een concept genaamd organ-on-chips. Door in vivo-achtige meercellige architectuur, weefsel-weefselinterfaces, fysischchemische microomgevingen en vasculaire perfusie opnieuw te creëren, genereren deze micro-engineered platforms niveaus van weefsel- en orgaanfunctionaliteit die niet mogelijk zijn met conventionele 2D-kweeksystemen. Ze maken ook hoge resolutie, real-time beeldvorming en analyse van biochemische, genetische en metabole profielen mogelijk die vergelijkbaar zijn met levende cellen in de in vivo weefsel- en orgaancontext. Echter, een bijzondere uitdaging van de organ-on-chip is dat het ontwerp, fabricage, en de toepassing van deze micro-engineered chips vereist gespecialiseerde technische expertise die meestal ontbreekt in biologisch georiënteerde academische laboratoria.
We hebben onlangs iPSC en organ-on-chip technologieën gecombineerd om een gepersonaliseerd BBB chip model15,16te genereren. Om de beschreven technologische uitdagingen het hoofd te bieden, wordt de commercieel beschikbare Chip-S1 gebruikt samen met de cultuurmodule, een instrument dat is ontworpen om het onderhoud van de chips op een eenvoudige en robuuste manier te automatiseren (Emulate Inc.). De BBB-chip reconstrueert interacties tussen neurale en endotheelcellen en bereikt fysiologisch relevante TEER-waarden, die worden gemeten door op maat gemaakte orgaanchips met geïntegreerde gouden elektroden17. Bovendien vertoont de BBB-chip een lage paracellulaire permeabiliteit, reageert hij op ontstekingssignalen op orgaanniveau, drukt actieve efflux-pompen uit en vertoont het voorspellend transport van oplosbare biomarkers en biofarmaceutica. Met name BBB-chips gegenereerd van verschillende individuen vangt de verwachte functionele verschillen tussen gezonde individuen en patiënten met neurologische aandoeningen15.
Het onderstaande protocol beschrijft een betrouwbare, efficiënte en reproduceerbare methode voor de generatie van menselijke iPSC-gebaseerde BBB-chips onder dynamische stroomomstandigheden. Er wordt richtlijnen gegeven over het type tests en eindpuntanalyses die direct in de BBB-chip of van bemonsteringseffluent kunnen worden uitgevoerd. Zo toont het protocol het spectrum van technieken die kunnen worden toegepast voor de evaluatie van biologische en functionele eigenschappen en reacties in een voor de mens relevant model.
Een korte beschrijving van de iPSC-gebaseerde BBB chip is hier aanwezig. Menselijke iPSCs worden in eerste instantie gedifferentieerd en gepropageerd in weefselkweekkolven als vrij zwevende aggregaten van neurale voorlopers, ez-bollen genoemd. Het bovenste kanaal van de Chip-S116,18,19 is gezaaid met gescheiden EZ-bollen die de "hersenkant" van de chip vormen, omdat cellen zich onderscheiden over 7 dagen in een gemengde cultuur van neurale voorlopercellen (iNPC's), iAstrocyten en iNeurons. Menselijke iPSC's worden ook gedifferentieerd in weefselkweekplaten in iBMECs. Het onderste kanaal van de chip is gezaaid met iBMECs om de "bloedzijde" te vormen als ze zich ontwikkelen tot een endotheelbuis(figuur 1). De poreuze extracellulaire matrix (ECM)-gecoate membraan dat de boven-en onderkant kanalen scheidt 1) maakt de vorming van cel-cel-cel interacties tussen kanalen en 2) kan de gebruiker permeability testen en beeldcellen draaien in beide kanalen met behulp van een conventionele lichtmicroscoop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

De bloedhersenbarrière (BBB) wordt gevormd door neurovasculaire eenheden (ASO's) die het centrale zenuwstelsel (CNS) beschermen tegen een reeks factoren in het bloed die de delicate hersenfunctie kunnen verstoren. Als zodanig vormt de BBB een groot obstakel voor de levering van therapeutica aan het CNS. Accumulerend bewijs suggereert dat de BBB een belangrijke rol speelt bij het ontstaan en de progressie van neurologische ziekten. Zo is er een enorme behoefte aan een BBB-model dat de penetratie van CNS-gerichte geneesmiddelen kan voorspellen en de rol van de BBB in gezondheid en ziekte kan verduidelijken.
We hebben onlangs organ-on-chip en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologieën gecombineerd om een BBB-chip te genereren die volledig gepersonaliseerd is voor mensen. Dit nieuwe platform toont cellulaire, moleculaire en fysiologische eigenschappen die geschikt zijn voor de voorspelling van drugs- en molecuultransport over de menselijke BBB. Bovendien hebben we met behulp van patiëntspecifieke BBB-chips modellen van neurologische ziekte gegenereerd en het potentieel voor gepersonaliseerde voorspellende geneeskundetoepassingen aangetoond. Hier is een gedetailleerd protocol dat aantoont hoe iPSC-afgeleide BBB-chips kunnen worden gegenereerd, te beginnen met differentiatie van iPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen (iBC's) en resulterend in gemengde neurale culturen die neurale voorlopers bevatten, gedifferentieerde neuronen en astrocyten. Ook beschreven is een procedure voor het zaaien van cellen in de orgaanchip en het kweken van de BBB-chips onder gecontroleerde laminaire stroom. Ten slotte worden gedetailleerde beschrijvingen van BBB-chipanalyses verstrekt, waaronder paracellulaire doorlaatbaarheidstesten voor de beoordeling van de doorlaatbaarheid van geneesmiddelen en moleculen en immunocytochemische methoden voor het bepalen van de samenstelling van celtypen binnen de chip.

Figuur 6A, B,C vertegenwoordigt een BBB-chip die is ingezaaid met EZ-bollen op het "brain side" bovenkanaal en iBMECs op het onderste kanaal "bloedzijde". iBc's werden eerst gezaaid en mochten 's nachts worden bevestigd, waarna EZ-bollen werden gezaaid. Chips werden vervolgens gekweekt onder statische omstandigheden met dagelijkse media vervanging voor zeven dagen. De BBB chip werd vervolgens vastgesteld met behulp van 4% PFA op RT voor 10 min en gewassen 3x met DPBS. Immuno...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een meercellige neurovasculaire eenheid die hersenhomeostase strak regugugaat. Door menselijke iPSCs en organ-on-chip technologieën te combineren, hebben we een gepersonaliseerde BBB-chip gegenereerd, geschikt voor ziektemodellering en CNS-voorspellingen voor medicijndoordring. Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de productie en werking van de BBB-chip.

Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Dit protocol zal aantonen hoe gedifferentieerde geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen worden gezaaid op een orgaan-on-chip om een volledig menselijke, gepersonaliseerde, microfluïde bloed-hersenbarrière te genereren, die kan worden gebruikt om de doorlaatbaarheid van het centrale zenuwstelsel te voorspellen en neurologische aandoeningen te bestuderen. Met behulp van een commercieel verkrijgbaar orgaan-op-chip, zullen we laten zien hoe elk biologisch georiënteerd lab deze technologie kan gebruiken om een gepersonaliseerde, microfluïde bloed-hersenbarrière-on-chip te genereren. Het verzamelen van bewijsmateriaal stelt voor dat BBB een rol in neurologische ziekte door het produceren van gepersonaliseerde BBB spaanders die uit iPSCs van individuen met een genetische neurologische ziekte worden afgeleid.Het zal mogelijk zijn om de rol van de BBB in gezondheid en ziekte te bestuderen. Deze methode kan ook nuttig zijn voor farmaceutische bedrijven, die dit menselijke BBB-platform kunnen gebruiken om te screenen op de doordringbaarheid van kandidaat-neurologische geneesmiddelen in het menselijk brein. De toepassing van organ-on-chip technologieën vereist meestal gespecialiseerde technische vaardigheden.Het gebruik van commercieel beschikbare platforms maakt de toepassing van deze technologie in elk biologisch georiënteerd lab mogelijk. Om te beginnen, breng de schotel met de bereide chips naar de biosafety kast. Met behulp van een P200 pipet, voorzichtig wassen beide kanalen door het toevoegen van 200 microliters van neurale differentiatie medium in de inlaat en het trekken van de vloeistof uit de uitlaat.Vermijd contact met de poorten, voorzichtig aanzuigen overtollige media druppels van het oppervlak van de chip. Roer de celsuspensie voorzichtig aan om een homogene celsuspensie te garanderen. Om de iPSC-afgeleide neurale voorloper cellen zaad in het bovenste kanaal om de hersenen kant te genereren, voeg een P200 tip met 30 tot 100 microliters van celsuspensie met de concentratie van een keer 10 tot de zes cellen per milliliter aan de bovenste kanaal inlaat, en voorzichtig laat de tip van de pipet.Neem een lege P200 pipet, druk de zuiger, steek in het bovenste kanaal uitlaat, en voorzichtig trek de eencellige suspensie door de tip. Breng de chip over naar de microscoop om de zaaidichtheid en homogene verdeling van cellen binnen het bovenste kanaal te controleren. Na bevestiging van de celdichtheid bij 20% dekking, plaats de chips onmiddellijk twee uur in de couveuse bij 37 graden Celsius.Daarna, wegwassen van de cellen die niet hechten door het toevoegen van verse neurale differentiatie medium in de inlaat en het trekken van de vloeistof via pipet uit de uitlaat. Houd de cellen onder statische omstandigheden op 37 graden Celsius met een dagelijkse neurale differentiatie medium vervanging. Nadat de INPC's zijn aangesloten of op een volgende dag na het zaaien, breng het gerecht met de bereide chips naar de bioveiligheidskast.Was het onderste kanaal voorzichtig met 200 microliters endotheelcelmedium. Vermijd contact met de poorten, zame druppel druppels overtollig endotheelcelmedium van het oppervlak van de chip, zorg ervoor dat ze medium in beide kanalen achterlaten. Roer de celsuspensie voorzichtig aan om een homogene celsuspensie te garanderen.Met behulp van een P200 pipet, opstellen 30 tot 100 microliter van de iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire cel suspensie bij de concentratie van 14 tot 20 keer 10 tot de zes cellen per milliliter, en plaats de tip in het onderste kanaal inlaat. De meest kritieke stap om functionele barrière-eigenschappen te bereiken is het zaaien van microvasculaire endotheelcellen in de hersenen. Het is van cruciaal belang om cellen met de juiste dichtheid te zaaien om bellenvorming te voorkomen om homogene verdeling binnen de orgaanchip te verifiëren.Druk de zuiger op een P200 pipet met een lege punt, steek in het onderste kanaal uitlaat, en langzaam laat de pipet zuiger om voorzichtig trek de single-cell schorsing door het onderste kanaal. De overtollige celsuspensie van het oppervlak van de chip aanzuigen. Vermijd direct contact met de inlaat- en uitlaatpoorten om ervoor te zorgen dat er geen celsuspensie uit de kanalen wordt aangezogen.Breng de chip naar de microscoop om de zaaidichtheid te controleren. Het onderste kanaal is gevuld met cellen zonder waarneembare gaten ertussen. Na bevestiging van de juiste celdichtheid, zaad de cellen in de resterende chips.Om de cellen op het poreuze membraan te bevestigen, dat zich op het onderste kanaal bevindt, omkeren van elke chip en laat ze rusten in een spaanwitje. Plaats een klein reservoir met steriele DPBS in de 150-millimeter schotel om vochtigheid te bieden voor de cellen. Incubeer de chips op 37 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur of totdat cellen in het onderste kanaal zijn bevestigd.Zodra de iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire endotheelcellen hebben aangesloten, flip de chips terug naar een rechte positie om cel bevestiging aan het onderste gedeelte van het onderste kanaal mogelijk te maken. 48 uur na het zaaien van de iPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen, equilibrate de temperatuur van de endotheelcel medium door opwarming in een 37-graden Celsius waterbad gedurende een uur. Ontgassen het medium vervolgens gedurende 15 minuten onder een vacuümgestuurd filtratiesysteem.Ontsmet vervolgens de buitenkant van de draagbare moduleverpakking en trays met 70% ethanol, veeg ze af en breng ze over naar de bioveiligheidskast. Open het pakket en plaats de modules in de lade Oriënteer ze met de reservoirs naar de achterkant van de lade. Pipette drie milliliter van de vooraf geëquilibreerde, warme media aan elk inlaatreservoir.Voeg endotheelcelcultuurmedium toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal en het neurale differentiatiemedium aan het bovenste kanaalinlaatreservoir van het bovenste kanaal. Vervolgens pipette 300 microliters van de vooraf geëquilibreerde, warme media naar elk uitlaatreservoir, direct over elke uitlaatpoort. Plaats maximaal zes draagbare modules op elke lade.Breng trays naar de couveuse en schuif volledig in de cultuurmodule met de ladehandgreep naar buiten gericht. Selecteer en voer de hoofdcyclus uit op de cultuurmodule. Sluit de incubatordeur en laat de kweekmodule de draagbare modules ongeveer een minuut primen.De primingcyclus is voltooid wanneer de statusbalk klaar staat. Haal de lade uit de kweekmodule en breng deze naar de bioveiligheidskast. Inspecteer de onderkant van elke draagbare module in de bioveiligheidskast om te controleren of de draagbare modules met succes zijn voorbereid.Kijk voor de aanwezigheid van kleine druppels op alle vier de havens. Als een draagbare module geen druppels weer te geven, opnieuw de prime cyclus op deze modules. Als er media op de lade droopen, wat vaker gebeurt door de uitlaatpoorten, reinigt u de lade met 70% ethanol.Vervolgens, voorzichtig wassen beide kanalen van elke chip met warme, geëquilibreerde cel-specifieke cultuur medium om eventuele bubbels in het kanaal te verwijderen, en plaats kleine druppeltjes media op de top van elke inlaat en uitlaat poort. Steek de chips met dragers in de draagbare modules en plaats maximaal zes op elke lade. Plaats de trays in de kweekmodule.Programmeer de juiste organchipcultuurvoorwaarden, zoals stroomsnelheid en stretch, op de cultuurmodule. Zodra de regulerende cyclus is voltooid, wat ongeveer twee uur duurt, beginnen de geprogrammeerde omstandigheden. Daarna begint de cultuurmodule te stromen bij de vooraf ingestelde orgaanchipcultuur.Immunocytochemie op de iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip zeven dagen na het zaaien toont de EZ bollen gedifferentieerd in een gemengde neurale cel populatie in de top hersenen zijkanaal, met inbegrip van S100 beta-positieve astrocyten, Nestin-positieve neurale voorloper cellen, evenals GFAP-positieve astrocyten, en beta III tubuubuline-positieve neuronen. IPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen gezaaid in de onderste bloedzijde kanaal uitgedrukt GLUT-1 en PECAM-1. Evaluatie van de bloed-hersenbarrière chip doorlaatbaarheid toont aan dat de orgaanchip gezaaid met iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire endotheelcellen en EZ bollen had een strakke barrière in vergelijking met orgaanchips gezaaid met iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire endotheelcellen alleen.Orgaanchips die met EZ-bollen alleen zijn gezaaid, vertoonden geen barrière-eigenschappen. Van de eerste oppervlaktebehandeling van het kanaal tot het medium dat elke dag wordt verwisseld, vermijd bellenvorming in het kanaal. Gedurende de stap in het protocol waarin het reagens van oppervlakteactivering, extracellulaire matrix of celhoudend medium via de kanalen moet worden ingevoegd, is het uiterst belangrijk om zorgvuldig te controleren of er geen bel wordt gevonden.De permeabiliteitstest kan worden uitgevoerd om de menselijke hersenen penetrability van kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen. Deze aanpak kan dienen voor het testen van potentiële therapieën. De toepassing van de op iPSC gebaseerde BBB-chip maakt het mogelijk om de rol van de BBB bij verschillende neurologische ziekten te bestuderen.In de toekomst kan een dergelijk platform nuttig zijn voor voorspellende, gepersonaliseerde geneeskunde toepassingen.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...