Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Nous tenons à remercier le Dr Soshana Svendsen pour l’édition critique. Ce travail a été soutenu par la subvention 1621/18 de la Fondation des sciences israéliennes, le Ministère des sciences et de la technologie (MOST), Israel 3-15647, le California Institute for Regenerative Medicine Grant ID DISC1-08800, la Sherman Family Foundation, la subvention NIH-NINDS 1UG3NS105703 et la subvention de l’Association de la SLA 18-SI-389. AH a été financé par la Fondation Wallenberg (numéro de subvention 2015.0178).

1. Génération de cellules progénitrices neurales dérivées de l’iPSC (iNPC)
<ol><li>Produire des EZ-sphères à partir de colonies iPSC comme décrit ci-dessous et comme précédemment publié20,21,22.<ol>
<li>Culture iPSC colonies à la confluence sur la membrane du sous-sol matrice enduite 6 plaques de puits (0,5 mg/plaque) dans mTESR1 ou d’autres médias commerciaux (voir Tableau des matériaux).</l...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

La combinaison de la technologie d’organe sur puce et des cellules iPSC-dérivées dans le NVU est prometteuse pour la modélisation précise du BBB humain. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’application simple et robuste de la puce BBB récemment publiée iPSC16. Une vue d’ensemble et le moment du paradigme d’ensemencement sont présentés à la figure 3. Il est essentiel d’obtenir et de maintenir des fonctions de barrière adaptées à la...

Le BBB est une barrière très sélective qui sépare le SNC du sang circulant. Il protège les fonctions critiques du cerveau contre les substances potentiellement perturbatrices, les facteurs et les xénobiotiques tout en permettant l’afflux de nutriments et d’autres métabolites nécessaires pour maintenir l’homéostasie du cerveau1. Le BBB est un NVU multicellulaire dans lequel les péricytes, les pieds d’extrémité d’astrocyte, et les processus neuronaux contactent directement les cellules endothéliales microvasculaires de cerveau (BMECs). Ces interactions permettent aux BMEC de former des propriétés de barrière spécialisées qui sont soutenues par des jonctions serrées et adhérentes2,3. La formation de cette barrière limite le passage paracellulaire des molécules, mais elle contient des transporteurs polarisés pour transporter activement des molécules dans le SNC ou dans le sang1. En raison de ces propriétés de barrière uniques, le BBB constitue un obstacle majeur à la livraison de produits biopharmaceutiques dans le cerveau, et on estime que moins de 5% des petites molécules approuvées par la FDA peuvent atteindre le SNC4.
Les modèles animaux ont été largement utilisés pour étudier la pénétration de BBB et les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de BBB5. Alors que les modèles animaux représentent fidèlement l’environnement in vivo multicellulaire complexe, les différences d’expression et d’activité des transporteurs BBB ainsi que la spécificité du substrat entre les espèces empêchent souvent l’extrapolation précise des données animales aux humains6. Ainsi, les modèles à base humaine sont essentiels pour étudier le BBB humain et pour une utilisation dans le développement de médicaments conçus pour cibler le SNC. Ce besoin devient encore plus évident avec la prédominance croissante des médicaments biologiques spécifiques à l’homme dans le domaine du développement pharmaceutique. L’accumulation de preuves suggère qu’un BBB compromis est associé à un certain nombre de troubles graves du SNC, y compris les tumeurs cérébrales et les maladies neurologiques7,8,9. Les modèles humains reflétant fidèlement ces maladies ont le potentiel d’identifier à la fois 1) de nouvelles voies qui pourraient être ciblées pour le développement de médicaments et 2) de prédire la pénétration du SNC, réduisant ainsi le temps et les ressources dans les études précliniques et peut-être la diminution du taux d’échec dans les essais cliniques.
Des modèles in vitro ont été largement mis en œuvre pour étudier les interactions entre les BMEC et d’autres cellules de la NVU et effectuer des écrans pour les médicaments bBB-perméables potentiels10. Pour recréer les aspects clés du BBB humain, les modèles in vitro doivent présenter des propriétés physiologiquement pertinentes (c.-à-d. faible perméabilité paracellulaire et résistance électrique transendothéliale physiologiquement pertinente [TEER] à travers la monocouche endothéliale). En outre, le profil moléculaire d’un système in vitro doit inclure l’expression de systèmes de transport fonctionnels représentatifs. Typiquement, les modèles in vitro sont composés de cellules endothéliales qui sont co-cultivées sur une membrane semi-perméable avec des combinaisons d’autres cellules NVU pour améliorer les propriétés BBB11. Cette approche permet une évaluation simple et relativement rapide de la fonctionnalité de la barrière et de la perméabilité des molécules. De tels modèles de BBB à base de cellules peuvent être établis avec des sources de cellules animales ou humaines, y compris des cellules isolées des excisions chirurgicales ou des lignées de BMEC immortalisées.
Récemment, des protocoles visant à différencier les cellules pluripotentes humaines en BMEC ont été introduits comme une source attrayante pour les modèles bBB humains in vitro12,13. Les BMECs (iBMECs) dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont très évolutifs, démontrent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles cruciales du BBB humain, et portent la génétique du patient. En culture, les iBMEC forment une monocouche qui exprime des marqueurs de jonction serrés et affiche des complexes de jonction serrés semblables à des vivo. Ces cellules expriment également des marqueurs de BBB, y compris le transporteur de glucose de BBB, le transporteur de glucose 1 (GLUT1). Fait important, et contrairement à d’autres sources cellulaires alternatives pour les BMEC humains, les iBMECs acquièrent des propriétés de barrière avec des valeurs aussi élevées que celles mesurées in vivo14,polarisent le long de l’axe basolatéral, et expriment les pompes fonctionnelles d’efflux. En outre, l’utilisation d’iPSC de divers sujets à la fois 1) se félicite de la possibilité de tester les aspects de la BBB d’une manière de médecine personnalisée et 2) fournit une source flexible pour générer des types de cellules supplémentaires de la NVU. Générer ces cellules à partir d’une source de cellules isogéniques pour créer des puces BBB personnalisées aiderait également à comprendre les différences interindividuelles dans les réponses aux médicaments, ce qui est une cause majeure de résistance ou de réponse compromise au traitement observé dans les études cliniques.
L’utilisation d’iBMECs comme monocouches dans un plat ou sur un insert transwell semi perméable représente une approche puissante pour la modélisation BBB. Ces systèmes ont tendance à être robustes, reproductibles et rentables. En outre, les analyses fonctionnelles telles que TEER et perméabilité sont relativement simples à effectuer. Cependant, les systèmes bidimensionnels (2D) ne récapitulent pas la nature 3D du tissu in vivo, et ils n’ont pas les forces physiologiques de stress de cisaillement fournies par le sang et les cellules sanguines circulants. Cela limite la capacité de l’endothélium vasculaire dans ces modèles de développer et de maintenir les propriétés et les fonctions intrinsèques bBB.
Des systèmes micro-ingénieurs bordés de cellules vivantes ont été mis en place pour modéliser diverses fonctionnalités d’organes dans un concept appelé organ-on-chips. En recréant l’architecture multicellulaire in vivo-like, les interfaces tissu-tissu, les microenvironnements physicochimiques, et la perfusion vasculaire, ces plates-formes microengineered génèrent des niveaux de la fonctionnalité de tissu et d’organe pas possible avec systèmes de culture 2D conventionnels. Ils permettent également la haute résolution, l’imagerie en temps réel, et l’analyse des profils biochimiques, génétiques, et métaboliques semblables aux cellules vivantes dans le tissu in vivo et le contexte d’organe. Cependant, un défi particulier de l’orgue sur la puce est que la conception, la fabrication et l’application de ces puces micro-ingénierie nécessite une expertise en ingénierie spécialisée qui fait généralement défaut dans les laboratoires universitaires orientés biologiquement.
Nous avons récemment combiné les technologies iPSC et organ-on-chip pour générer un modèle personnalisé de puce BBB15,16. Afin de surmonter les défis technologiques décrits, le Chip-S1 disponible dans le commerce est utilisé avec le module de culture, un instrument conçu pour automatiser l’entretien des puces d’une manière simple et robuste (Emulate Inc.). La puce BBB recrée les interactions entre les cellules neurales et endothéliales et atteint des valeurs TEER physiologiquement pertinentes, qui sont mesurées par des puces d’organes faites sur mesure avec des électrodes aurifères intégrées17. En outre, la puce BBB affiche une faible perméabilité paracellulaire, répond aux signaux inflammatoires au niveau des organes, exprime des pompes à efflux actives et présente un transport prédictif de biomarqueurs solubles et de produits biopharmaceutiques. Notamment, les puces BBB générées par plusieurs individus capturent les différences fonctionnelles attendues entre les personnes en bonne santé et les patients atteints de maladies neurologiques15.
Le protocole détaillé ci-dessous décrit une méthode fiable, efficace et reproductible pour la génération de puces BBB à base d’iPSC dans des conditions de flux dynamiques. Des directives sont fournies sur le type d’analyses et d’analyses de points de terminaison qui peuvent être effectuées directement dans la puce BBB ou à partir d’effluents d’échantillonnage. Ainsi, le protocole démontre le spectre des techniques qui peuvent être appliquées pour évaluer les propriétés et les réponses biologiques et fonctionnelles dans un modèle humain-pertinent.
Une brève description de la puce BBB basée sur iPSC est fournie ici. Les iPSC humains sont initialement différenciés et propagés dans les flacons de culture tissulaire sous forme d’agrégats flottants d’ancêtres neuronaux, appelés ez-sphères. Le canal supérieur de la Chip-S116,18,19 est enseveavec avec dissociéEZ EZ-sphères qui forment le «côté cerveau» de la puce, que les cellules se différencient sur 7 jours dans une culture mixte de cellules progénitrices neuronales (iNPc), iAstrocytes, et iNeurons. Les iPSC humains sont également différenciés dans les plaques de culture tissulaire en iBMECs. Le canal inférieur de la puce est ensevement d’iBMECs pour former le « côté sang » au fur et à mesure qu’ils se développent pour former un tube endothélial (Figure 1). La membrane enduite de matrice extracellulaire poreuse (ECM) qui sépare les canaux supérieurs et inférieurs 1) permet la formation d’interactions cellule-cellule entre les canaux et 2) permet à l’utilisateur d’exécuter des essais de perméabilité et des cellules d’image dans l’un ou l’autre canal à l’aide d’un microscope à lumière classique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est formée par des unités neurovasculaires (NSU) qui protègent le système nerveux central (SNC) d’une série de facteurs trouvés dans le sang qui peuvent perturber la fonction cérébrale délicate. En tant que tel, le BBB est un obstacle majeur à la livraison de produits thérapeutiques au SNC. L’accumulation des preuves suggère que le BBB joue un rôle clé dans l’début et la progression des maladies neurologiques. Ainsi, il y a un besoin énorme pour un modèle de BBB qui peut prévoir la pénétration des drogues cNS-visées aussi bien qu’élucider le rôle du BBB dans la santé et la maladie.
Nous avons récemment combiné des technologies d’organe sur puce et de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour générer une puce BBB entièrement personnalisée aux humains. Cette nouvelle plate-forme affiche les propriétés cellulaires, moléculaires et physiologiques qui conviennent à la prédiction du transport de médicaments et de molécules à travers le BBB humain. En outre, en utilisant des puces BBB spécifiques au patient, nous avons généré des modèles de maladies neurologiques et démontré le potentiel d’applications de médicaments prédictifs personnalisés. Fourni ici est un protocole détaillé démontrant comment générer des puces BBB dérivées de l’iPSC, en commençant par la différenciation des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau dérivées de l’iPSC (iBMECs) et résultant en cultures neuronales mixtes contenant des progéniteurs neuronaux, neurones différenciés et astrocytes. On décrit également une procédure pour l’ensemencement des cellules dans la puce d’organe et la culture des puces de BBB sous le flux laminaire contrôlé. Enfin, des descriptions détaillées des analyses de puces BBB sont fournies, y compris des tests de perméabilité paracellulaire pour évaluer la perméabilité des médicaments et des molécules ainsi que des méthodes immunocytochimiques pour déterminer la composition des types de cellules à l’intérieur de la puce.

Figure 6A,B,C représente une puce BBB enseisée avec des sphères EZ sur le canal supérieur du « côté cerveau » et des iBMECs sur le canal inférieur du « côté sang ». IBMECs ont été ensedus d’abord et autorisés à attacher pendant la nuit, après quoi EZ-sphères ont été ensedus. Les copeaux ont ensuite été cultivés dans des conditions statiques avec le remplacement quotidien des médias pendant sept jours. La puce BBB a ensuite été fixée à l’aide ...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une unité neurovasculaire multicellulaire régulant étroitement l’homéostasie cérébrale. En combinant les iPSC humains et les technologies d’organes sur puce, nous avons généré une puce BBB personnalisée, adaptée à la modélisation des maladies et aux prédictions de pénétrabilité des médicaments du SNC. Un protocole détaillé est décrit pour la génération et l’exploitation de la puce BBB.

Génération d’une puce de barrière de sang-brain basée sur iPSC

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Ce protocole démontrera comment les cellules souches pluripotentes induites différenciées peuvent être ensemencées sur un organe sur puce pour générer une barrière céphalo-cérébrale entièrement humaine, personnalisée et microfluidique, qui peut être utilisée pour prédire la perméabilité des médicaments du système nerveux central et étudier les troubles neurologiques. À l’aide d’un organe sur puce disponible dans le commerce, nous démontrerons comment n’importe quel laboratoire biologiquement orienté peut utiliser cette technologie pour générer une barrière céphalo-cérébrale personnalisée et microfluidique sur puce. L’accumulation de preuves suggère que BBB joue un rôle dans la maladie neurologique en générant des puces BBB personnalisées dérivées d’iPSCs de personnes atteintes d’une maladie neurologique génétique.Il sera possible d’étudier le rôle du BBB dans la santé et la maladie. Cette méthode peut également être utile pour les sociétés pharmaceutiques, qui peuvent utiliser cette plate-forme BBB humaine pour dépister la pénétrabilité des médicaments neurologiques candidats dans le cerveau humain. L’application des technologies d’orgue sur puce exige habituellement des qualifications spécialisées d’ingénierie.L’utilisation de plates-formes disponibles dans le commerce permet l’application de cette technologie dans n’importe quel laboratoire biologiquement orienté. Pour commencer, apportez le plat contenant les croustilles préparées à l’armoire de biosécurité. À l’aide d’une pipette P200, lavez doucement les deux canaux en ajoutant 200 microlitres de milieu de différenciation neuronale dans l’entrée et en tirant le liquide de la sortie.En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes de médias excédentaires de la surface de la puce. Agiter doucement la suspension cellulaire pour assurer une suspension cellulaire homogène. Pour ensemencer les cellules progénitrices neurales dérivées de l’iPSC dans le canal supérieur pour générer le côté cérébral, ajoutez une pointe P200 contenant 30 à 100 microlitres de suspension cellulaire à la concentration d’une fois 10 à six cellules par millilitre à l’entrée supérieure du canal, et relâchez doucement la pointe de la pipette.Prenez une pipette P200 vide, déprimez le piston, insérez dans la sortie du canal supérieur et tirez soigneusement la suspension à cellule unique à travers la pointe. Transférez la puce au microscope pour vérifier la densité d’ensemencement et la distribution homogène des cellules dans le canal supérieur. Après avoir confirmé la densité cellulaire à 20% de couverture, placez immédiatement les copeaux dans l’incubateur pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Après cela, laver les cellules qui ne se fixent pas en ajoutant un milieu de différenciation neurale fraîche dans l’entrée et en tirant le liquide via pipette de la sortie. Gardez les cellules dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius avec un remplacement moyen de différenciation neuronale quotidienne. Une fois que les INPC ont attaché ou un jour suivant l’ensemencement, apportez le plat contenant les croustilles préparées à l’armoire de biosécurité.Laver délicatement le canal inférieur avec 200 microlitres de milieu cellulaire endothélial. En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes d’excès de milieu cellulaire endothélial à partir de la surface de la puce, en vous assurant de laisser le milieu dans les deux canaux. Agiter doucement la suspension cellulaire pour assurer une suspension cellulaire homogène.À l’aide d’une pipette P200, dessiner de 30 à 100 microlitres de la suspension cellulaire endothéliale microvasculaire cérébrale dérivée de l’iPSC à la concentration de 14 à 20 fois 10 à six cellules par millilitre, et placer la pointe dans l’entrée du canal inférieur. L’étape la plus critique pour atteindre les propriétés fonctionnelles de barrière est l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau. Il est crucial de semer des cellules à la bonne densité pour éviter la formation de bulles pour vérifier la distribution homogène dans la puce de l’organe.Déprimez le piston sur une pipette P200 avec une pointe vide, insérez dans la sortie du canal inférieur, et relâchez lentement le piston pipette pour tirer soigneusement la suspension à cellule unique à travers le canal inférieur. Aspirer l’excès de suspension cellulaire de la surface de la puce. Évitez tout contact direct avec les ports d’entrée et de sortie pour vous assurer qu’aucune suspension cellulaire n’est aspirée hors des canaux.Transférer la puce au microscope pour vérifier la densité d’ensemencement. Le canal inférieur est rempli de cellules sans lacunes observables entre les deux. Après avoir confirmé la densité cellulaire correcte, ensemencer les cellules dans les copeaux restants.Pour fixer les cellules sur la membrane poreuse, qui est située au-dessus du canal inférieur, inverser chaque puce, et les laisser reposer dans un berceau à copeaux. Placez un petit réservoir contenant du DPBS stérile à l’intérieur du plat de 150 millimètres pour fournir de l’humidité aux cellules. Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant environ trois heures ou jusqu’à ce que les cellules du chenal inférieur se soient fixées.Une fois que les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées de l’iPSC se sont attachées, retournez les puces à une position verticale pour permettre l’attachement cellulaire à la partie inférieure du canal inférieur. 48 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées de l’iPSC, équilibrent la température du milieu cellulaire endothélial en se réchauffant dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une heure. Puis, dégazer le milieu par incubation sous un système de filtration aspirateur pendant 15 minutes.Ensuite, assainir l’extérieur de l’emballage du module portable et les plateaux avec 70% d’éthanol, essuyer, et les transférer à l’armoire de biosécurité. Ouvrez l’emballage et placez les modules dans le plateau Orientez-les avec les réservoirs vers l’arrière du plateau. Pipette trois millilitres du média chaud pré-équilibré à chaque réservoir d’entrée.Ajouter le milieu de culture cellulaire endothéliale au réservoir d’entrée du canal inférieur et au milieu de différenciation neuronale au réservoir d’entrée du canal supérieur du canal supérieur. Ensuite, pipette 300 microlitres des supports chauds prééquilibrés à chaque réservoir de sortie, directement au-dessus de chaque port de sortie. Placez jusqu’à six modules portables sur chaque plateau.Apportez les plateaux à l’incubateur, et glissez complètement dans le module de culture avec la poignée de plateau faisant face vers l’extérieur. Sélectionnez et exécutez le cycle principal sur le module culture. Fermez la porte de l’incubateur et laissez le module culture amorcer les modules portables pendant environ une minute.Le cycle d’amorçage est terminé lorsque la barre d’état se lit prête. Retirez le plateau du module culture et apportez-le à l’armoire de biosécurité. Inspectez le dessous de chaque module portatif dans l’armoire de biosécurité pour vérifier que les modules portatifs ont été amorcés avec succès.Recherchez la présence de petites gouttelettes dans les quatre ports. Si un module portable n’affiche pas de gouttelettes, réexécuter le cycle principal sur ces modules. Si un média a coulait sur le plateau, ce qui se produit plus souvent par les ports de sortie, nettoyez le plateau avec 70% d’éthanol.Ensuite, lavez doucement les deux canaux de chaque puce avec un milieu de culture chaud et équilibré spécifique aux cellules pour éliminer les bulles possibles dans le canal, et placez de petites gouttelettes de médias sur le dessus de chaque entrée et port de sortie. Insérez les puces avec des supports dans les modules portables, et placez jusqu’à six sur chaque plateau. Insérez les plateaux dans le module culture.Programmez les conditions appropriées de culture des copeaux d’organes, comme le débit et l’étirement, sur le module de culture. Dès que le cycle de régulation est terminé, ce qui prend environ deux heures, les conditions programmées commencent. Après cela, le module de culture commence à couler aux conditions prédéfinies de culture de puce d’organe.L’immunocytochimie sur la puce de barrière de sang-cerveau iPSC-basée sept jours après ensemencement montre les sphères d’EZ différenciées en une population mixte de cellules neurales dans le canal supérieur de côté de cerveau, y compris les astrocytes bêta-positifs de S100, les cellules progénitrices neurales nestin-positives, aussi bien que les astrocytes GFAP-positifs, et les neurones tubulin-positifs de bêta III. Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées de l’IPSC ensemencées dans le canal latéral inférieur du sang ont exprimé GLUT-1 et PECAM-1. L’évaluation de la perméabilité de puce de barrière de sang-cerveau démontre que la puce d’organe ensemencée avec les cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires de cerveau iPSC-dérivées et les sphères d’EZ ont eu une barrière serrée comparée aux puces d’organe ensemencées avec les cellules endothéliales microvasculaires cerveau iPSC-dérivées seules.Les copeaux d’organes ensemencés avec des sphères EZ seuls n’affichaient aucune propriété de barrière. Du traitement de surface initial du canal à la commutation moyenne chaque jour, évitez la formation de bulles dans le canal. Tout au long de l’étape du protocole dans laquelle le réaccératrice d’activation de surface, la matrice extracellulaire ou le milieu contenant des cellules doit être insérée par les canaux, il est extrêmement important de vérifier soigneusement qu’aucune bulle n’est trouvée.L’analyse de perméabilité peut être effectuée pour évaluer la pénétrabilité du cerveau humain des médicaments candidats. Cette approche peut servir à tester des thérapeutiques potentielles. L’application de la puce BBB basée sur l’iPSC permet d’étudier le rôle du BBB dans diverses maladies neurologiques.À l’avenir, une telle plate-forme pourrait être utile pour les applications prédictives et personnalisées de médecine.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Génération de tissu adipeux humain cellules souches par dédifférenciation des adipocytes matures dans les cultures de plafond

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...