Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Wir danken Dr. Soshana Svendsen für die kritische Bearbeitung. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Israel Science Foundation Stipendium 1621/18, das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST), Israel 3-15647, das California Institute for Regenerative Medicine Grant ID DISC1-08800, die Sherman Family Foundation, NIH-NINDS Grant 1UG3NS105703, und The ALS Association Grant 18-SI-389. Die AH wurde von der Wallenberg Foundation (Fördernummer 2015.0178) gefördert.

1. Generierung von iPSC-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (iNPCs)
<ol><li>Produziere EZ-Kugeln aus iPSC-Kolonien, wie unten beschrieben und wie zuvor veröffentlicht20,21,22.<ol>
<li>Kultur iPSC Kolonien zu konfluency auf Keller Membran Matrix-beschichtet 6 Brunnenplatten (0,5 mg/Platte) in mTESR1 oder anderen kommerziellen Medien (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Entfernen Sie iPSC Medium und...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. 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Die Kombination von Organ-on-Chip-Technologie und iPSC-abgeleiteten Zellen in der NVU verspricht eine genaue Modellierung des menschlichen BBB. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die einfache und robuste Anwendung des kürzlich veröffentlichten iPSC-basierten BBB-Chips16. Eine Übersicht und das Timing des Seeding-Paradigmas sind in Abbildung 3dargestellt. Um Barrierefunktionen zu erhalten und zu erhalten, die für die BBB-Modellierung geeignet sind, is...

Die BBB ist eine hochselektive Barriere, die das ZNS vom zirkulierenden Blut trennt. Es schützt kritische Gehirnfunktionen vor potenziell störenden Substanzen, Faktoren und Xenobiotika und ermöglicht gleichzeitig den Zustrom von Nährstoffen und anderen Metaboliten, die zur Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns erforderlich sind1. Die BBB ist eine multizelluläre NVU, in der Pericyte, Astrozytenendfüße und neuronale Prozesse direkt mit mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) im Gehirn in Kontakt treten. Diese Interaktionen ermöglichen es BMECs, spezielle Barriereeigenschaften zu bilden, die durch enge und haftetende Knoten unterstützt werden2,3. Die Bildung dieser Barriere begrenzt den parazellulären Durchgang von Molekülen, aber es enthält polarisierte Transporter, um Moleküle aktiv in das ZNS oder zurück ins Blut zu transportieren1. Aufgrund dieser einzigartigen Barriereeigenschaften stellt die BBB ein großes Hindernis für die Lieferung von Biopharmazeutika in das Gehirn dar, und es wird geschätzt, dass weniger als 5% der von der FDA zugelassenen kleinen Moleküle das ZNS4erreichen können.
Tiermodelle wurden häufig verwendet, um BBB-Penetranz und die molekularen Mechanismen der BBB-Entwicklung zu untersuchen5. Während Tiermodelle die komplexe multizelluläre In-vivo-Umgebung getreu darstellen, schließen Unterschiede in Expression und Aktivität von BBB-Transportern sowie die speziesspezifitätsspezifisch oft eine genaue Extrapolation von Tierdaten auf den Menschenaus 6. Daher sind humanbasierte Modelle entscheidend für die Untersuchung des menschlichen BBB und für den Einsatz bei der Entwicklung von Medikamenten, die auf das ZNS abzielen. Diese Notwendigkeit wird durch die zunehmende Dominanz biologischer, humanspezifischer Arzneimittel im Bereich der pharmazeutischen Entwicklung noch deutlicher. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass ein kompromittierter BBB mit einer Reihe von schweren ZNS-Erkrankungen verbunden ist, einschließlich Hirntumoren und neurologischen Erkrankungen7,8,9. Menschliche Modelle, die diese Krankheiten getreu widerspiegeln, haben das Potenzial, sowohl 1) neue Wege zu identifizieren, die für die Arzneimittelentwicklung gezielt werden könnten, als auch 2) Die Penetranz von ZNS vorherzusagen, wodurch Zeit und Ressourcen in präklinischen Studien reduziert und möglicherweise die Ausfallrate in klinischen Studien verringert wird.
In-vitro-Modelle wurden weit verbreitet, um Wechselwirkungen zwischen BMECs und anderen Zellen der NVU zu untersuchen und Bildschirme für prospektive BBB-durchlässige Medikamente10durchzuführen. Um Schlüsselaspekte des menschlichen BBB nachzubilden, müssen In-vitro-Modelle physiologisch relevante Eigenschaften aufweisen (d. h. geringe parazelluläre Durchlässigkeit und physiologisch relevanter transendotheliale elektrischer Widerstand [TEER] über die endotheliale Monoschicht). Darüber hinaus muss das molekulare Profil eines In-vitro-Systems die Expression repräsentativer funktioneller Transportsysteme umfassen. Typischerweise bestehen In-vitro-Modelle aus Endothelzellen, die auf einer semipermeablen Membran mit Kombinationen anderer NVU-Zellen kokultiviert werden, um die BBB-Eigenschaften zu verbessern11. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache und relativ schnelle Beurteilung der Barrierefunktionalität und der Moleküldurchlässigkeit. Solche zellbasierten BBB-Modelle können mit tierischen oder menschlichen Zellquellen hergestellt werden, einschließlich Zellen, die aus chirurgischen Exzisionen oder verewigten BMEC-Linien isoliert sind.
Kürzlich wurden Protokolle zur Unterscheidung menschlicher pluripotenter Zellen in BMECs als attraktive Quelle für in vitro humane BBB-Modelle12,13eingeführt. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete BMECs (iBMECs) sind hochgradig skalierbar, zeigen entscheidende morphologische und funktionelle Eigenschaften des menschlichen BBB und tragen die Genetik des Patienten. In der Kultur bilden iBMECs eine Monoschicht, die enge Anschlussmarkierungen ausdrückt und in vivo-ähnlichen engen Kreuzungskomplexen anzeigt. Diese Zellen exprimieren auch BBB-Marker, einschließlich des BBB-Glukosetransporters, Glukosetransporter 1 (GLUT1). Wichtig ist, und im Gegensatz zu anderen alternativen Zellquellen für menschliche BMECs erfassen iBMECs Barriereeigenschaften mit Werten, die so hoch sind wie die in vivo14gemessenen, polarisieren entlang der basolateralen Achse und drücken funktionale Effluxpumpen aus. Darüber hinaus begrüßt die Verwendung von iPSCs aus verschiedenen Fächern beide 1) die Möglichkeit, Aspekte der BBB in einer personalisierten Medizin-Manier zu testen und 2) bietet eine flexible Quelle für die Erzeugung zusätzlicher Zelltypen der NVU. Die Erzeugung dieser Zellen aus einer isogenen Zellquelle zur Erstellung personalisierter BBB-Chips würde auch helfen, interindividuelle Unterschiede in den Arzneimittelreaktionen zu verstehen, was eine Hauptursache für Resistenzen oder eine kompromittierte Reaktion auf die in klinischen Studien beobachtete Behandlung ist.
Die Verwendung von iBMECs als Monolayer in einer Schale oder auf einem halbdurchlässigen Transwell-Einsatz stellt einen leistungsstarken Ansatz für die BBB-Modellierung dar. Diese Systeme sind in der Regel robust, reproduzierbar und kostengünstig. Darüber hinaus sind Funktionsanalysen wie TEER und Permeabilität relativ einfach durchzuführen. Zweidimensionale (2D) Systeme können jedoch die 3D-Natur des In-vivo-Gewebes nicht rekapitulieren, und ihnen fehlen die physiologischen Scherstresskräfte, die durch zirkulierende Blut- und Blutzellen bereitgestellt werden. Dies schränkt die Fähigkeit des vaskulären Endothels in diesen Modellen ein, intrinsische BBB-Eigenschaften und -Funktionen zu entwickeln und zu erhalten.
Mikrotechnische Systeme, die von lebenden Zellen gesäumt sind, wurden implementiert, um verschiedene Organfunktionen in einem Konzept zu modellieren, das Organ-on-Chips genannt wird. Durch die Nachbildung in vivo-ähnlicher multizellulärer Architektur, Gewebe-Gewebe-Schnittstellen, physikalisch-chemischer Mikroumgebungen und vaskulärer Perfusion erzeugen diese mikrotechnischen Plattformen ein Maß an Gewebe- und Organfunktionalität, das mit konventionellen 2D-Kultursystemen. Sie ermöglichen auch hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung und Analyse von biochemischen, genetischen und metabolischen Profilen ähnlich wie lebende Zellen im in vivo Gewebe- und Organkontext. Eine besondere Herausforderung des Organ-on-Chip besteht jedoch darin, dass das Design, die Herstellung und die Anwendung dieser mikrotechnischen Chips spezielles technisches Know-how erfordert, das in biologisch orientierten akademischen Labors normalerweise fehlt.
Wir haben vor kurzem iPSC und Organ-on-Chip-Technologien kombiniert, um ein personalisiertes BBB-Chipmodell15,16zu generieren. Um die beschriebenen technologischen Herausforderungen zu meistern, wird der handelsübliche Chip-S1 zusammen mit dem Kulturmodul verwendet, einem Instrument, das die Wartung der Chips auf einfache und robuste Weise automatisieren soll (Emulate Inc.). Der BBB-Chip erzeugt Wechselwirkungen zwischen neuronalen und endotheliaalen Zellen und erreicht physiologisch relevante TEER-Werte, die durch maßgeschneiderte Organchips mit integrierten Goldelektroden17gemessen werden. Darüber hinaus zeigt der BBB-Chip eine geringe parazelluläre Durchlässigkeit, reagiert auf entzündliche Hinweise auf Organebene, drückt aktive Efflux-Pumpen aus und zeigt einen prädiktiven Transport von löslichen Biomarkern und Biopharmazeutika. Bemerkenswert ist, BBB-Chips von mehreren Personen erzeugt erfasst die erwarteten funktionellen Unterschiede zwischen gesunden Personen und Patienten mit neurologischen Erkrankungen15.
Das unten beschriebene Protokoll beschreibt eine zuverlässige, effiziente und reproduzierbare Methode zur Erzeugung menschlicher iPSC-basierter BBB-Chips unter dynamischen Strömungsbedingungen. Es werden Leitlinien für die Art der Assays und Endpunktanalysen bereitgestellt, die direkt im BBB-Chip oder aus Probenahmeabwässern durchgeführt werden können. So zeigt das Protokoll das Spektrum der Techniken, die zur Bewertung biologischer und funktioneller Eigenschaften und Reaktionen in einem humanrelevanten Modell eingesetzt werden können.
Eine kurze Beschreibung des iPSC-basierten BBB-Chips finden Sie hier. Humane iPSCs werden zunächst in Gewebekulturkolben als frei schwebende Aggregate neuronaler Vorläufer, sogenannteEZ-Kugeln, unterschieden und vermehrt. Der obere Kanal des Chip-S116,18,19 ist mit dissoziierten EZ-Kugeln gesät, die die "Gehirnseite" des Chips bilden, da sich Zellen über 7 Tage in eine gemischte Kultur von neuronalen Vorläuferzellen (iNPCs), iAstrozyten und iNeuronen differenzieren. Humane iPSCs werden auch in Gewebekulturplatten in iBMECs unterschieden. Der untere Kanal des Chips wird mit iBMECs gesät, um die "Blutseite" zu bilden, während sie sich zu einem Endothelrohr entwickeln (Abbildung 1). Die poröse extrazelluläre Matrix (ECM)-beschichtete Membran, die den oberen und unteren Kanal trennt 1) ermöglicht die Bildung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kanälen und 2) ermöglicht es dem Benutzer, Permeabilitätstests und Bildzellen in beiden Kanälen mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop auszuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) wird durch neurovaskuläre Einheiten (NVUs) gebildet, die das zentrale Nervensystem (ZNS) vor einer Reihe von Faktoren im Blut abschirmen, die die empfindliche Gehirnfunktion stören können. Daher stellt die BBB ein großes Hindernis für die Abgabe von Therapeutika an das ZNS dar. Die sich anhäufenden Beweise deuten darauf hin, dass die BBB eine Schlüsselrolle beim Beginn und Fortschreiten neurologischer Erkrankungen spielt. Daher besteht ein enormer Bedarf an einem BBB-Modell, das die Penetration von CNS-gezielten Medikamenten vorhersagen und die Rolle des BBB bei Gesundheit und Krankheit aufklären kann.
Wir haben vor kurzem Organ-on-Chip und induzierte pluripotente Stammzell -Technologien (iPSC) kombiniert, um einen BBB-Chip zu erzeugen, der vollständig für den Menschen personalisiert ist. Diese neuartige Plattform zeigt zelluläre, molekulare und physiologische Eigenschaften, die für die Vorhersage des Arzneimittel- und Molekültransports über den menschlichen BBB geeignet sind. Darüber hinaus haben wir mit patientenspezifischen BBB-Chips Modelle neurologischer Erkrankungen generiert und das Potenzial für personalisierte Prädiktive Medizinanwendungen demonstriert. Hier ist ein detailliertes Protokoll, das zeigt, wie iPSC-abgeleitete BBB-Chips erzeugt werden können, beginnend mit der Differenzierung von iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen (iBMECs) im Gehirn und der Daraus resultierenden gemischten neuronalen Kulturen, die neuronale Vorläufer enthalten, differenzierte Neuronen und Astrozyten. Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zur Aussaat von Zellen in den Organchip und zur Kultivierung der BBB-Chips unter kontrolliertem laminaren Fluss. Schließlich werden detaillierte Beschreibungen der BBB-Chipanalysen bereitgestellt, einschließlich parazellulärer Permeabilitätstests zur Beurteilung der Wirkstoff- und Moleküldurchlässigkeit sowie immunzytochemische Methoden zur Bestimmung der Zusammensetzung von Zelltypen innerhalb des Chips.

Abbildung 6A,B,C stellt einen BBB-Chip dar, der mit EZ-Kugeln auf dem oberen Kanal "Gehirnseite" und iBMECs auf dem "Blutseite"-Bodenkanal gesät ist. iBMECs wurden zuerst gesät und durften über Nacht anbringen, danach wurden EZ-Kugeln gesät. Chips wurden dann unter statischen Bedingungen mit täglichem Medienaustausch für sieben Tage kultiviert. Der BBB-Chip wurde dann mit 4% PFA bei RT für 10 min fixiert und 3x mit DPBS gewaschen. Die Immunzytochemie wurde auf dem BBB...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Dieses Protokoll wird zeigen, wie differenzierte induzierte pluripotente Stammzellen auf einem Organ-on-Chip ausgesät werden können, um eine vollständig menschliche, personalisierte, mikrofluidische Blut-Hirn-Schranke zu erzeugen, die verwendet werden kann, um die Durchlässigkeit des Zentralnervensystems vorherzusagen und neurologische Störungen zu untersuchen. Anhand eines handelsüblichen Organ-on-Chip zeigen wir, wie jedes biologisch orientierte Labor diese Technologie nutzen kann, um eine personalisierte, mikrofluidische Blut-Hirn-Barriere auf Chip zu erzeugen. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass BBB eine Rolle bei neurologischen Erkrankungen spielt, indem personalisierte BBB-Chips aus iPSCs von Personen mit einer genetischen neurologischen Erkrankung generiert werden.Es wird möglich sein, die Rolle des BBB bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Diese Methode kann auch nützlich für Pharmaunternehmen sein, die diese menschliche BBB-Plattform verwenden können, um die Durchlässigkeit von kandidaten neurologischen Medikamenten in das menschliche Gehirn zu überprüfen. Die Anwendung von Organ-on-Chip-Technologien erfordert in der Regel spezialisierte Ingenieurskompetenzen.Die Verwendung kommerziell erhältlicher Plattformen ermöglicht die Anwendung dieser Technologie in jedem biologisch orientierten Labor. Um zu beginnen, bringen Sie die Schale mit den vorbereiteten Chips in den Biosicherheitsschrank. Mit einer P200 Pipette, sanft waschen beide Kanäle durch Zugabe von 200 Mikroliter neuronalen Differenzierungsmedium in den Einlass und ziehen Sie die Flüssigkeit aus dem Auslass.Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie sorgfältig überschüssige Medientröpfchen von der Oberfläche des Chips. Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Um die von iPSC abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen in den oberen Kanal zu saatieren, um die Gehirnseite zu erzeugen, fügen Sie eine P200-Spitze hinzu, die 30 bis 100 Mikroliter Zellsuspension in der Konzentration von ein mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter zum oberen Kanaleinlass enthält, und lassen Sie die Spitze vorsichtig von der Pipette los.Nehmen Sie eine leere P200-Pipette, drücken Sie den Kolben, legen Sie sie in den oberen Kanalauslass ein und ziehen Sie vorsichtig die einzellige Suspension durch die Spitze. Übertragen Sie den Chip an das Mikroskop, um die Sädichte und homogene Verteilung der Zellen innerhalb des oberen Kanals zu überprüfen. Nach Bestätigung der Zelldichte bei 20% Abdeckung, legen Sie die Chips sofort in den Inkubator für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.Danach die Zellen, die nicht anhaften, wegwaschen, indem man dem Einlass frisches neuronales Differenzierungsmedium hinzufügt und die Flüssigkeit über pipette aus dem Auslass zieht. Halten Sie die Zellen unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius mit einem täglichen neuronalen Differenzierungsmedium Ersatz. Nachdem iNPCs angebracht haben oder an einem darauffolgenden Tag nach der Aussaat, bringen Sie die Schale mit den vorbereiteten Chips in den Biosicherheitsschrank.Waschen Sie den unteren Kanal vorsichtig mit 200 Mikroliteren Endothelzellmedium. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie sorgfältig Tröpfchen von überschüssigen Endothelzellmedium von der Oberfläche des Chips, stellen Sie sicher, Medium in beiden Kanälen zu verlassen. Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten.Mit einer P200-Pipette 30 bis 100 Mikroliter der iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellsuspension des Gehirns in der Konzentration von 14 bis 20 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter aufstellen und die Spitze in den unteren Kanaleinlass legen. Der wichtigste Schritt, um funktionelle Barriereeigenschaften zu erreichen, ist die Aussaat von mikrovaskulären Endothelzellen im Gehirn. Es ist entscheidend, dass Samenzellen mit angemessener Dichte Blasenbildung vermeiden, um die homogene Verteilung innerhalb des Organchips zu überprüfen.Drücken Sie den Kolben auf einer P200 Pipette mit einer leeren Spitze, setzen Sie ihn in den unteren Kanalauslass ein, und lassen Sie den Pipettenkolben langsam los, um die einzellige Aufhängung vorsichtig durch den unteren Kanal zu ziehen. Saugen Sie die überschüssige Zellsuspension von der Oberfläche des Chips. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Ein- und Auslassanschlüssen, um sicherzustellen, dass keine Zellsuspension aus den Kanälen abgesaugt wird.Übertragen Sie den Chip auf das Mikroskop, um die Sädichte zu überprüfen. Der untere Kanal ist mit Zellen gefüllt, die keine beobachtbaren Lücken dazwischen haben. Nach Bestätigung der korrekten Zelldichte säen Sie die Zellen in den verbleibenden Chips.Um die Zellen an der porösen Membran zu befestigen, die sich oben auf dem unteren Kanal befindet, invertieren Sie jeden Chip und lassen Sie sie in einer Span-Wiege ruhen. Legen Sie ein kleines Reservoir mit sterilem DPBS in die 150-Millimeter-Schale, um Feuchtigkeit für die Zellen bereitzustellen. Inkubieren Sie die Chips bei 37 Grad Celsius für etwa drei Stunden oder bis Zellen im unteren Kanal befestigt sind.Sobald die iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns angebracht sind, kehren Sie die Chips wieder in eine aufrechte Position zurück, um eine Zellbindung am unteren Teil des unteren Kanals zu ermöglichen. 48 Stunden nach der Aussaat der iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, gleicht die Temperatur des Endothelzellmediums durch Erwärmung in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad für eine Stunde aus. Entgasen Sie das Medium dann 15 Minuten lang durch Inkubation unter einem vakuumgetriebenen Filtersystem.Als nächstes reinigen Sie das Äußere der tragbaren Modulverpackungen und Trays mit 70% Ethanol, wischen Sie sie ab und übertragen Sie sie in den Biosicherheitsschrank. Öffnen Sie das Paket, und legen Sie die Module in das Fach Orient sie mit den Reservoirs auf der Rückseite des Fachs. Pipette drei Milliliter der vorausgeglichenen, warmen Medien zu jedem Einlassbehälter.Fügen Sie dem Einlassreservoir des unteren Kanals und dem neuronalen Differenzierungsmedium das Medium Endothelzellkultur des oberen Kanals hinzu. Dann Pipette 300 Mikroliter der vorausgeglichenen, warmen Medien zu jedem Auslassbehälter, direkt über jedem Auslassanschluss. Legen Sie bis zu sechs tragbare Module auf jedes Tablett.Tragen Sie Schalen zum Inkubator und schieben Sie sie vollständig in das Kulturmodul mit dem nach außen gerichteten Traygriff. Wählen Sie den Prime-Zyklus im Kulturmodul aus, und führen Sie ihn aus. Schließen Sie die Inkubatortür, und lassen Sie das Kulturmodul die tragbaren Module für etwa eine Minute grundieren.Der Grundierungszyklus ist abgeschlossen, wenn die Statusleiste bereit liest. Entfernen Sie das Tablett aus dem Kulturmodul, und bringen Sie es in den Biosicherheitsschrank. Prüfen Sie die Unterseite jedes tragbaren Moduls im Biosicherheitsschrank, um sicherzustellen, dass die tragbaren Module erfolgreich grundiert wurden.Achten Sie auf das Vorhandensein von kleinen Tröpfchen an allen vier Ports. Wenn ein tragbares Modul keine Tröpfchen anzeigt, führen Sie den Prime-Zyklus auf diesen Modulen erneut aus. Wenn Medien auf das Tablett tropften, was häufiger an den Auslassöffnungen vorkommt, reinigen Sie das Fach mit 70 % Ethanol.Als nächstes waschen Sie vorsichtig beide Kanäle jedes Chips mit einem warmen, gleichförmigen zellspezifischen Kulturmedium, um mögliche Blasen im Kanal zu entfernen, und legen Sie kleine Tröpfchen Von Medien auf die Oberseite jedes Ein- und Auslassanschlusses. Legen Sie die Chips mit Trägern in die tragbaren Module ein und legen Sie bis zu sechs auf jedes Tablett. Legen Sie die Schalen in das Kulturmodul ein.Programmieren Sie die entsprechenden Organchipkulturbedingungen, wie Strömungsgeschwindigkeit und Dehnung, auf dem Kulturmodul. Sobald der Regelzyklus abgeschlossen ist, der etwa zwei Stunden dauert, beginnen die programmierten Bedingungen. Danach beginnt das Kulturmodul bei den voreingestellten Organchip-Kulturbedingungen zu fließen.Die Immunzytochemie auf dem iPSC-basierten Blut-Hirn-Barrierenchip sieben Tage nach der Aussaat zeigt die EZ-Sphären, die sich in eine gemischte neuronale Zellpopulation im oberen Hirnseitenkanal differenziert haben, einschließlich S100-Beta-positive Astrozyten, Nestin-positive neuronale Vorläuferzellen sowie GFAP-positive Astrozyten und Beta-III-Tubulin-positive Neuronen. IPSC-abgeleitete mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns, die im unteren Blutseitenkanal gesät wurden, exprimierten GLUT-1 und PECAM-1. Die Auswertung der Durchlässigkeit des Blut-Hirn-Schrankenchips zeigt, dass der Organchip, der mit iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen und EZ-Kugeln gesät wurde, eine enge Barriere im Vergleich zu Organchips hatte, die allein mit iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen aus gesäten wurden.Organchips, die mit EZ-Kugeln allein gesät wurden, zeigten keine Barriereeigenschaften. Von der anfänglichen Oberflächenbehandlung des Kanals bis zum Medium, das jeden Tag schaltet, vermeiden Sie Blasenbildung im Kanal. Während des gesamten Protokolls, in dem Oberflächenaktivierungsreagenz, extrazelluläre Matrix oder zellhaltiges Medium durch die Kanäle eingefügt werden müssen, ist es äußerst wichtig, sorgfältig zu überprüfen, ob keine Blase gefunden wird.Der Permeability-Assay kann durchgeführt werden, um die Durchlässigkeit von Kandidatenmedikamenten im menschlichen Gehirn zu beurteilen. Dieser Ansatz kann dazu dienen, potenzielle Therapeutika zu testen. Die Anwendung des iPSC-basierten BBB-Chips ermöglicht es, die Rolle des BBB bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen zu untersuchen.In Zukunft kann eine solche Plattform für vorausschauende, personalisierte Medizinanwendungen nützlich sein.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...