Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות לד ר סושנה סזוסן לעריכה קריטית. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המדע הישראלי מענק 1621/18, משרד המדע והטכנולוגיה (רוב), ישראל 3-15647, המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית המענק DISC1-08800, קרן משפחת שרמן, NIH-NINDS מענק 1יום 3NS105703, ואת האגודה ALS מענק 18-SI-389. AH מומן על ידי קרן ולנברג (גרנט מספר 2015.0178).

1. הדור של התאים הנגזרים מעשה ידי iPSC (iNPCs)
<ol><li>לייצר EZ-ספירות ממושבות ipsc כמתואר להלן, כפי שפורסמו בעבר20,21,22.<ol>
<li>תרבות iPSC מושבות לשטף על מרתף קרום המרתף מצופה 6 היטב צלחות (0.5 mg/צלחת) ב mTESR1 או מדיה מסחרית אחרת (ראה לוח חומרים).</li>
		<li>הס?...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

השילוב של הטכנולוגיה לעוגב-על-שבב ותאי iPSC-נגזר ב-NVU מחזיקה הבטחה למידול מדויק של BBB האנושי. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יישום פשוט וחזק של שבב BBB מבוסס לאחרונה שפורסם iPSC16. סקירה ותזמון של פרדיגמת הזריעה מוצגת באיור 3. כדי להשיג ולשמור על פונקציות המכשול המ...

BBB הוא מחסום סלקטיבי מאוד המפריד בין ה-CN לדם ממחזור הדם. הוא מגן על פונקציות המוח קריטי מפני חומרים הפרעה פוטנציאלי, גורמים, ו xenobiotics בעוד מאפשר זרם של חומרים מזינים ומטבוליטים אחרים הדרושים כדי לשמור על הומאוסטזיס המוח1. ה-BBB הוא מדור שינה (NVU), בו הננו-כפות הרגליים והתהליכים העצביים מגעים ישירות עם תאי המוח מיקרוכלי-דם (BMECs). אינטראקציות אלה מאפשרות ל-bmecs ליצור מאפייני מכשול מיוחדים הנתמכים על-ידי צמתים הדוקים ומחסיד2,3. היווצרות של המכשול הזה מגביל את המעבר הפרתאי של מולקולות, אבל הוא מכיל מובילי מקוטב כדי להעביר באופן פעיל מולקולות לתוך ה-CN או בחזרה לדם1. בשל מאפייני המכשול הייחודיים הללו, BBB מהווה מכשול גדול להעברת הביופרמקולוגיה למוח, וההערכה היא שפחות מ -5% ממולקולות קטנות באישור ה-FDA יכולים להגיע ל-CN4.
דגמי בעלי חיים שימשו רבות לחקר החדירה BBB והמנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח BBB5. בעוד מודלים בעלי חיים מייצגים בנאמנות את מורכבות משולבת בסביבה vivo, הבדלים ביטוי ופעילות של מובילי BBB כמו גם ספציפיות מצע על פני מינים לעתים קרובות למנוע התרוממות מדויקת של נתונים בעלי חיים לבני אדם6. לפיכך, מודלים מבוססי-אדם הם קריטיים כדי ללמוד את BBB האנושי ולשימוש בפיתוח תרופות המיועדות למקד את ה-CN. צורך זה הופך להיות אפילו יותר ברור עם שליטה גוברת של תרופות ביולוגיות, ספציפיות לאדם בתחום הפיתוח הפרמצבטי. צבירת ראיות מרמזת כי bbb פרוצים קשורה למספר הפרעות המוח החמורות, כולל גידולים בראש ומחלות נוירולוגיות7,8,9. המודלים האנושיים בנאמנות משקפים מחלות אלה יש פוטנציאל שני 1) לזהות מסלולים הרומן שיכול להיות ממוקד עבור פיתוח התרופה 2) לחזות החדירה של ה-CN, ובכך הפחתת זמן ומשאבים במחקרים פרה-קליניים ואולי ירידה בשיעור כישלון בניסויים קליניים.
במודלים של חוץ גופית יושמו באופן נרחב כדי ללמוד אינטראקציות בין BMECs לבין תאים אחרים של NVU ומסכי התנהלות עבור תרופות לחדירות BBB פוטנציאליים10. כדי ליצור מחדש היבטים מרכזיים של BBB האנושי, במודלים החוץ-גופית חייבים להציג מאפיינים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (דהיינו, חדירות הקרנף נמוכות והתנגדות מבחינה פיזיולוגית הקשורה לטראנס-תל-שורש). בנוסף, הפרופיל המולקולרי של מערכת החוץ-גופית חייב לכלול ביטוי למערכות התחבורה הפונקציונלית הייצוגית. בדרך כלל, במודלים של חוץ גופית מורכבים בתאי האנדותל כי הם משותפים על קרום למחצה חדיר עם שילובים של תאים NVU אחרים כדי לשפר את מאפייני BBB11. גישה זו מאפשרת הערכה פשוטה ומהירה יחסית של פונקציונליות המכשול וחדירות המולקולה. מודלים אלה מבוססי תא BBB ניתן להקים עם בעל חיים או מקורות תא אדם, כולל תאים מבודדים excisions כירורגי או קווי BMEC מונצח.
לאחרונה, פרוטוקולים כדי להבדיל בין התאים האנושיים החזקים לתוך bmecs הוצגו כמקור אטרקטיבי עבור מודלים bbb האנושי מתורבת12,13. תא גזע מושרה pluripotent (iPSC)-נגזר מסכת הנגזרת (iBMECs) הם מדרגיים מאוד, להפגין מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים חיוניים של BBB האדם, ולשאת את הגנטיקה של המטופל. בתרבות, iBMECs ליצור מונאולייר כי מבטא סמנים הצומת הדוקה מציג vivo-כמו מתחמי הצומת הדוקה. תאים אלה גם מבטאים סמנים BBB, כולל משגר הגלוקוז BBB, הגלוקוז המוביל 1 (GLUT1). חשוב מכך, ובניגוד מקורות אחרים תאים חלופיים עבור האדם BMECs, iBMECs לרכוש מאפייני המכשול עם ערכים גבוהים כמו אלה שנמדדו ב vivo14, מקטפולז לאורך הציר בזלת צלעות, ומשאבות לבטא פונקציונלי מהיר. יתר על כן, השימוש iPSCs מתוך נושאים שונים שני 1) מברך את ההזדמנות לבחון היבטים של BBB באופן מותאם אישית התרופה 2) מספק מקור גמיש ליצירת סוגים נוספים של תאים של NVU. יצירת תאים אלה ממקור תא איזוגניים כדי ליצור שבבי BBB אישית תסייע גם הבנה בין הבדלים בין בודדים בתגובות התרופה, שהיא מטרה מרכזית לתגובה התנגדות או פרוצים לטיפול נצפתה במחקרים קליניים.
שימוש ב-iBMECs כמו monolayers בתבשיל או על הוספת מעבר חדיר למחצה מייצגת גישה רבת עוצמה עבור מידול BBB. מערכות אלה נוטות להיות חזקות, מיועלות וחסכוניות. בנוסף, ניתוחים פונקציונליים כגון הפרטיר והחדירות הם פשוטים יחסית לביצוע. עם זאת, דו מימדי (2D) מערכות לא לחזור לסדר את הטבע 3D של רקמת vivo, ואין להם את הכוח הפיזיולוגי להדגיש כוחות שסופקו על ידי במחזור דם ותאי דם. הדבר מגביל את יכולת האנדותל של כלי הדם במודלים אלה כדי לפתח ולתחזק מאפיינים ופונקציות מהותיים של BBB.
מערכות מיקרו הנדסה מרופדת על ידי תאים חיים יושמו למודל האיברים השונים שונים במושג שנקרא עוגב-על-צ'יפס. על-ידי יצירה מיוצרת של אדריכלות מvivo כמו, ממשקי רקמה רקמה, מיקרוקוכימיה פיסיוכימיקלים, ו perfusion כלי דם, אלה פלטפורמות מיקרו מהונדסים ליצור רמות של רקמות ואיברים פונקציונליות לא אפשרי עם מערכות התרבות 2D קונבנציונאלי. הם גם מאפשרים ברזולוציה גבוהה, הדמיה בזמן אמת, ניתוח של פרופילים ביוכימיים, גנטיים, ומטבוליים דומים לתאי החיים בתוך רקמת vivo והקשר עוגב. עם זאת, אתגר מסוים של האיבר על שבב הוא העיצוב, ייצור, ויישום של שבבי מיקרו מהונדסים אלה דורש מומחיות הנדסה מיוחדת כי הוא בדרך כלל חסר במעבדות האקדמיות מונחה ביולוגית.
לאחרונה שילבו ipsc וטכנולוגיות עוגב-על-שבב כדי ליצור מודל מותאם אישית של שבב bbb15,16. על מנת להתגבר על האתגרים הטכנולוגיים שתוארו, השבב הזמין מסחרית משמש יחד עם מודול התרבות, מכשיר שנועד להפוך את התחזוקה של האסימונים בצורה פשוטה ואיתנה (הדמיית Inc.). שבב BBB משחזר את האינטראקציות בין תאים עצביים ואנדותל ומשיגה את ערכי העגלון הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הנמדדת על ידי שבבי עוגב מותאמים אישית עם אלקטרודות זהב משולבות17. בנוסף, שבב BBB מציג חדירות הקרנף נמוך, מגיב לרמזים דלקתיים ברמת האיבר, מבטא משאבות מיצוי פעיל, ומציג הובלה חזוי של ביוארים מסיסים וביופרמצבטיקה. בעיקר, שבבי BBB שנוצרו ממספר אנשים לוכדת את ההבדלים הפונקציונליים צפוי בין אנשים בריאים וחולים עם מחלות נוירולוגיות15.
הפרוטוקול המפורט להלן מתאר שיטה אמינה, יעילה ובעלת שדרוג ליצירת שבבי BBB מבוססי-האדם בתנאי זרימה דינמיים. ההדרכה מסופקת על סוג של מנתח וניתוח נקודות הקצה שניתן לבצע ישירות בשבב BBB או מדגימת קולחים. לפיכך, הפרוטוקול ממחיש את הספקטרום של טכניקות שניתן ליישם להערכת תכונות ביולוגיות ופונקציונליות ותגובות במודל הרלבנטי לאדם.
המלון מספק תיאור קצר של שבב BBB המבוסס על iPSC. האדם iPSCs הם הבדיל בתחילה והופץ בתוך מבחנות התרבות רקמות כמו אגרגטים בחינם צף של ושלתי עצביים, כינה כדורי EZ. הערוץ העליון של השבב-S116,18,19 הוא נזרע עם הנתק EZ-כדורים שיוצרים את "הצד המוח" של השבב, כמו תאים להבדיל מעל 7 ימים לתוך תרבות מעורבת של תאים מחולל קדמון (inpcs), iastrocytes, ו ineurons. האדם iPSCs גם מובחנת לוחיות התרבות רקמות לתוך iBMECs. הערוץ התחתון של השבב הוא הנזרע עם iBMECs כדי ליצור את "הצד הדם" כפי שהם מפתחים כדי ליצור צינורית אנדותל (איור 1). מטריצה נקבובי מגולוון (ecm) מצופה קרום המפריד בין הערוצים העליונים והתחתונים 1) מתיר את היווצרות אינטראקציות תא אל התא בין ערוצים ו 2) מאפשר למשתמש להפעיל חדירות בחני התאים התמונה באחד הערוצים באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

מחסום מוח הדם (BBB) נוצר על ידי יחידות נוירוכלי (הבוס) כי מגן על מערכת העצבים המרכזית (CN) מתוך מגוון של גורמים שנמצאו בדם שיכול לשבש את תפקוד המוח העדין. ככזה, BBB הוא מכשול גדול להעברת therapeutics לתוך ה-CN. צבירת ראיות עולה כי BBB משחק תפקיד מפתח בתחילתה והתקדמות של מחלות נוירולוגיות. לפיכך, יש צורך אדיר במודל BBB שיכול לחזות את החדירה של תרופות ממוקדות-CN, כמו גם להבהיר את תפקידה של BBB בבריאות ובמחלות.
יש לנו לאחרונה שילבו איבר על שבב והמושרה תא גזע pluriפוטנטי (iPSC) טכנולוגיות לייצר שבב BBB אישית מלאה לבני אדם. פלטפורמת הרומן מציגה תכונות סלולריות, מולקולריות ופיזיולוגיות המתאימות לחיזוי העברת הסמים והמולקולה ברחבי BBB האנושי. יתר על כן, באמצעות שבבי BBB ספציפי לחולה, יצרנו מודלים של מחלות נוירולוגיות והפגינו פוטנציאל עבור יישומים מותאמים אישית לרפואה חזוי. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט הממחיש כיצד לייצר שבבי BBB נגזר, החל בבידול של iPSC-נגזר מיקרוכלי המוח של תאים אנדותל (iBMECs) וכתוצאה מכך תרבויות עצביות מעורבת המכילה ושלתי עצביים, נוירונים הבדיל, ו astrocytes. כמו כן, מתוארת הליך לזריעת תאים לתוך שבב העוגב ולקבלת שבבי BBB תחת זרימה מבוקרת של שכבתית. לבסוף, תיאורים מפורטים של ניתוחי השבבים BBB מסופקים, כולל הפרפרביליות הפרסומליות להערכת תרופות וחדירות מולקולה, כמו גם שיטות אימונוציטוטוקוכימיקלים לקביעת ההרכב של סוגי תאים בתוך השבב.

איור 6A, B, C מייצג שבב bbb הנזרע עם EZ-כדורים על "צד המוח" בערוץ העליון ו-ibmecs על "הצד הדם" "הערוץ התחתון. iBMECs הופרה הראשון ומותר לצרף לילה, לאחר שנוצרו EZ ספירות. צ'יפס היו מתורבתים בתנאים סטטיים עם החלפת מדיה יומית במשך שבעה ימים. שבב BBB תוקן לאחר מכן באמצעות 4% כלפי מע ב RT עבו?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

פרוטוקול זה ידגים כיצד ניתן לזרוע תאי גזע פלוריפוטנטיים מובחנים על איבר על שבב כדי ליצור מחסום דם-מוח מיקרופלואידי אנושי לחלוטין, מותאם אישית, שניתן להשתמש בו כדי לחזות חרניות תרופה של מערכת העצבים המרכזית וללמוד הפרעות נוירולוגיות. באמצעות איבר על שבב הזמין מסחרית, אנו נדגים כיצד כל מעבדה מוכוונת ביולוגית יכולה להשתמש בטכנולוגיה זו כדי ליצור מחסום דם-מוח מיקרופלואידי מותאם אישית. הצטברות ראיות עולה כי BBB ממלא תפקיד במחלה נוירולוגית על ידי יצירת שבבי BBB מותאמים אישית הנגזרים iPSCs של אנשים עם מחלה נוירולוגית גנטית.ניתן יהיה ללמוד את תפקידו של BBB בבריאות ומחלות. שיטה זו יכולה גם להיות שימושית עבור חברות פארמה, אשר יכול להשתמש בפלטפורמת BBB אנושית זו כדי לסנן את החדירה של תרופות נוירולוגיות מועמד לתוך המוח האנושי. היישום של טכנולוגיות איברים על שבב דורש בדרך כלל מיומנויות הנדסיות מיוחדות.שימוש בפלטפורמות מסחריות מאפשרות יישום של טכנולוגיה זו בכל מעבדה מוכוונת ביולוגית. כדי להתחיל, להביא את המנה המכילה את השבבים מוכנים לארון biosafety. באמצעות פיפטה P200, בעדינות לשטוף את שני הערוצים על ידי הוספת 200 microliters של מדיום התברואה עצבית לתוך התוך התוך ומשיכת הנוזל מהשקע.הימנעות ממגע עם היציאות, שאף בזהירות טיפות מדיה עודפות מפני השטח של השבב. בעדינות להתסיס את ההשעיה התא כדי להבטיח השעיית תא הומוגני. כדי לזרוע את תאי הצאצא העצביים שמקורם ב- iPSC לתוך הערוץ העליון כדי ליצור את צד המוח, הוסף קצה P200 המכיל 30 עד 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים בריכוז של פי 10 עד ששת התאים למיליליטר לתוך עמוד הערוץ העליון, ושחרר בעדינות את הקצה מהפיגט.קח פיפטה P200 ריקה, לדכא את הבוכנה, להכניס לשקע הערוץ העליון, בזהירות למשוך את ההשעיה תא יחיד דרך הקצה. העבר את השבב למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה ואת ההתפלגות ההומוגנית של תאים בתוך הערוץ העליון. לאחר אישור צפיפות התא בכיסוי של 20%, הנח מיד את השבבים באינקובטור למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לשטוף את התאים כי לא לצרף על ידי הוספת מדיום התברואה עצבית טרי לתוך שקע מושך את הנוזל באמצעות פיפטה מן השקע. שמור על התאים בתנאים סטטיים ב 37 מעלות צלזיוס עם החלפה בינונית התברואה עצבית יומית. לאחר iNPCs מחוברים או ביום שלאחר מכן לאחר הזריעה, להביא את המנה המכילה את השבבים מוכנים לארון biosafety.לשטוף בעדינות את הערוץ התחתון עם 200 microliters של מדיום תא אנדותל. הימנעות ממגע עם היציאות, בזהירות שאפו טיפות של מדיום תא אנדותל עודף מפני השטח של השבב, הקפדה להשאיר בינוני בשני הערוצים. בעדינות להתסיס את ההשעיה התא כדי להבטיח השעיית תא הומוגני.באמצעות פיפטה P200, לצייר עד 30 עד 100 microliters של ה-iPSC נגזר המוח microvascular ההשעיה תא אנדותל בריכוז של 14 עד 20 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר, ולמקם את הקצה לתוך המפרצון הערוץ התחתון. הצעד הקריטי ביותר להשגת תכונות מחסום תפקודי הוא זריעת תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח. זה חיוני לתאי זרעים בצפיפות נאותה כדי למנוע היווצרות בועה כדי לאמת הפצה הומוגנית בתוך שבב האיבר.לדכא את הבוכנה על פיפטה P200 עם קצה ריק, להכניס לשקע הערוץ התחתון, ולאט לאט לשחרר את הבוכנה פיפטה למשוך בזהירות את ההשעיה תא יחיד דרך הערוץ התחתון. שאף את ההשעיה העודפת של התא מפני השטח של השבב. הימנע ממגע ישיר עם יציאות השקע והשקע כדי להבטיח שאף מתלה תא לא ישאף לצאת מהערוצים.מעבירים את השבב למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה. הערוץ התחתון מלא בתאים ללא פערים ניתנים לצפייה ביניהם. לאחר אישור צפיפות התאים הנכונה, זרע את התאים בשבבים הנותרים.כדי לחבר את התאים אל הממברנה הנקבובית, הממוקמת על גבי התעלה התחתונה, להפוך כל שבב, ולתת להם לנוח בעריסה שבב. מניחים מאגר קטן המכיל DPBS סטרילי בתוך צלחת 150 מילימטר כדי לספק לחות לתאים. דגירה השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשלוש שעות או עד תאים בערוץ התחתון מחוברים.לאחר שתאי ה אנדותל המיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב- iPSC מחוברים, הופכים את השבבים בחזרה למצב זקוף כדי לאפשר חיבור תא לחלק התחתון של הערוץ התחתון. 48 שעות לאחר הזריעה של תאי הדם המיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב- iPSC, לצייד את הטמפרטורה של מדיום התא ה אנדותל על ידי התחממות באמבט מים צלזיוס 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר מכן, degas המדיום על ידי דגירה תחת מערכת סינון מונחה ואקום במשך 15 דקות.לאחר מכן, חטא את החלק החיצוני של האריזה והמגשים הניידים עם 70% אתנול, נגב והעבר אותם לארון ה-biosafety. פתח את החבילה, והצב את המודולים במגש כוון אותם עם המאגרים לכיוון החלק האחורי של המגש. פיפטה שלושה מיליליטר של המדיה החמה והמנויידת מראש לכל מאגר פנימה.הוסף מדיום תרבות תא אנדותל למאגר inlet של הערוץ התחתון ואת מדיום ההתברמות העצבית למאגר הערוצים העליון של הערוץ העליון. לאחר מכן, פיפטה 300 מיקרוליטרים של המדיה החמה והמתואם מראש לכל מאגר שקע, ישירות מעל כל יציאת מוצא. מקם עד שישה מודולים ניידים על כל מגש.הביאו מגשים לאנקובטור, והחליקו לחלוטין לתוך מודול התרבות כשידית המגש פונה כלפי חוץ. בחר והפעל את המחזור הראשי במודול התרבות. סגור את דלת החממה, ואפשר למודול התרבות לחבר את המודולים הניידים במשך כדקה.מחזור ההקדמות יושלם כאשר שורת המצב תהיה מוכנה. מוציאים את המגש ממודודול התרבות ומביאים אותו לארון ה-biosafety. בדוק את החלק התחתון של כל מודול נייד בארון biosafety כדי לוודא כי המודולים הניידים היו בהצלחה primed.חפש את נוכחותן של טיפות קטנות בכל ארבעת הנמלים. אם מודול נייד כלשהו אינו מציג טיפות, לחץ מחדש על המחזור הראשי במודולים אלה. אם מדיה כלשהי טפטף על המגש, המתרחש לעתים קרובות יותר על ידי יציאות היציאה, נקה את המגש עם 70%אתנול.לאחר מכן, שטפו בעדינות את שני הערוצים של כל שבב עם מדיום תרבות חם ושורף לתאים כדי להסיר בועות אפשריות בערוץ, והצב טיפות קטנות של מדיה בחלק העליון של כל יציאה פנימה ושקע. הכנס את השבבים עם מנשאים לתוך המודולים הניידים, והצב עד שישה על כל מגש. הכנס את המגשים למודול התרבות.תכנת את תנאי תרבות שבבי האיברים המתאימים, כגון קצב זרימה ומתיחה, במודול התרבות. ברגע מחזור לווסת הושלמה, אשר לוקח כשעתיים, התנאים מתוכנת להתחיל. לאחר מכן, מודול התרבות מתחיל לזרום בתנאי תרבות שבבי האיברים המוגדרים מראש.אימונוציטוכימיה על שבב מחסום הדם - מוח מבוסס iPSC שבעה ימים לאחר הזריעה מראה את ספירות EZ נבדל לתוך אוכלוסיית תאים עצביים מעורבים בערוץ בצד המוח העליון, כולל S100 אסטרוציטים חיוביים בטא, נסטין חיובי תאי ניוון עצבי, כמו גם אסטרוציטים חיוביים GFAP, ובטא III טובולין חיובי נוירונים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב- IPSC שנזרעו בערוץ צד הדם התחתון הביעו GLUT-1 ו- PECAM-1. הערכה של החודרות שבב מחסום הדם - מוח מדגים כי שבב האיבר זרע עם תאי אנדותל microvascular המוח נגזר iPSC ו כדוריות EZ היה מחסום הדוק בהשוואה שבבי איברים זרע עם תאי אנדותל microvascular המוח נגזר iPSC לבד.שבבי איברים עם כדורי EZ בלבד לא הציגו תכונות מחסום כלשהן. מטיפול פני השטח הראשוני של הערוץ למיתוג בינוני בכל יום, הימנע היווצרות בועה בערוץ. לאורך כל השלב בפרוטוקול שבו יש להכניס מדיום להפעלת פני השטח, מטריצה חוץ-תאית או מדיום המכיל תאים דרך הערוצים, חשוב מאוד לוודא בזהירות שלא נמצאה בועה.ניתן לבצע את ההתמדה חדירה כדי להעריך את חדירת המוח האנושי של תרופות מועמדות. גישה זו יכולה לשמש לבדיקת טיפולים פוטנציאליים. היישום של שבב BBB מבוסס iPSC מאפשר ללמוד את התפקיד של BBB במחלות נוירולוגיות שונות.בעתיד, פלטפורמה כזו עשויה להיות שימושית עבור יישומי רפואה חזויים ומותאים אישית.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...